LUMINEX技術(shù)原理及應用

1、.Luminex的基本原理及應用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析主要采用雙抗體夾心ELISA法。此法長期以來被視為蛋白質(zhì)定量分析的“標準方法”。ELISA可以用來準確測定大批量生物樣品，但每次實驗只能分析一個目標分子，而不具備同時分析多種目標分子的能力。在ELISA基礎上發(fā)展出的 luminex技術(shù)，不僅同樣通過雙抗體選擇而具有高特異性，同時也具有ELISA的高通量、操作簡便、測量準確等優(yōu)點，而且可以在一次實驗中完成對多種目標分子的分析，從而改變了過去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平臺。Luminex技術(shù)原理，在近年發(fā)表的文章中已有過詳細的介紹和說明。Luminex 技術(shù)應用微球和流式細胞儀的原理。 微

2、球內(nèi)部含有三種熒光免疫熒光，通過熒光不同的比例可以區(qū)分500種不同的微球。每種微球可以用來檢測一種不同的蛋白或基因。 因此，利用微球技術(shù)，可以同時檢測高達500個蛋白或基因。該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價交聯(lián)單克隆抗體，與被測定的目標分子結(jié)合后，加入熒光素標記的檢測抗體，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量“檢測熒光”強度來確定被測分子的濃度。在使用相同抗體對的條件下，luminex技術(shù)的測量結(jié)果在準確度、精確度、靈敏度方面與ELISA均可達到相似的水平。Luminex應用的熒光編碼微球帶有針對不同目標分子的特異性抗體，不同的微球在一定程度上可以自由組合，這樣在一次實驗中可以同時完成多個目

3、標分子的分析。多目標分子的同時測定可以大大減少生物樣品的消耗量，節(jié)省成本和測定時間，并且使多種目標分子之間相關(guān)性的分析更加準確。很多公司已經(jīng)開始提供Luminex試劑盒，用于基礎和臨床醫(yī)學研究以及臨床檢測。目前，Luminex試劑盒已經(jīng)可以檢測500多種蛋白質(zhì)分子，包括細胞因子、激素、自身抗體、腫瘤標志物等。Luminex常見問題及解答LUMINEX應用于哪些領域?生物醫(yī)學研究，生物標記物開發(fā)，臨床檢測等領域。Luminex技術(shù)主要用于蛋白和核酸檢測分析。LUMINEX敏感性如何？靈敏度取決于開頭的質(zhì)量。對于同樣的抗體對，Luminex檢測的靈敏度高于ELISA技術(shù)。一般檢測靈敏度在pg級。對

4、不同類型的樣品制備和樣品量的要求是怎樣的？血清、血漿是常用的樣本，每次檢測需要10ul， 每次可以檢測多個蛋白。從各種細胞或組織中提取的蛋白也可以用Luminex技術(shù)檢測，制備方法與ELISA、Western Blot完全一樣。一般可以檢測到多少基因或蛋白的表達信息？檢測蛋白和基因的數(shù)目主要取決于試劑盒。 蛋白質(zhì)檢測目前最高可以達到50個左右，基因檢測最高達500個。如何保證檢測結(jié)果的特異性？檢測的特異性取決于抗體高特異性。 試劑幾乎全部來源于美國大公司，產(chǎn)品經(jīng)過了嚴格的質(zhì)量控制。同時，我們檢測公司也有近15年的經(jīng)驗、嚴格的操作程序和質(zhì)量控制體系。客戶自己提供抗體，是否可以進行LUMINEX檢

5、測？Luminex和ELISA檢測試劑都需要兩個配套的特異性抗體。我們公司具有開發(fā)Luminex試劑盒的經(jīng)驗。但是，需要一系列的開發(fā)工作才能保證結(jié)果的特異性、重復性和可靠性。除了蛋白，LUMINEX技術(shù)是否還可以用于其它指標的檢測？可以用于基因表達，基因多態(tài)性和HLA配型分析。檢測周期多久？視待測蛋白的種類、數(shù)量和標本數(shù)量定。一般來說，檢測一組蛋白（1-50個，視蛋白種類定）和一組標本（多達360個標）需要3-4小時的操作時間及基本數(shù)據(jù)分析。但是，檢測周期也取決于公司當時的工作量。一般來說，從標本收到起，檢測應在1-2周完成；但是部分蛋白試劑盒需要收到訂單后從美國進口，檢測周期可能會延長到4-

6、5周。如何判定 LUMINEX數(shù)據(jù)表達水平差異有無意義？表達差異主要取決于標本的性質(zhì)和數(shù)量，我們公司為客戶提供專業(yè)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計服務。LUMINEX實驗和流式細胞儀的優(yōu)劣比較? Luminex技術(shù)是流式細胞儀和微球相結(jié)合的蛋白、核酸檢測技術(shù)， 檢測對象是蛋白質(zhì)、DNA等大分子。普通流式細胞儀主要用于檢測整體細胞表面或細胞內(nèi)的蛋白表達情況。Luminex檢測蛋白和標本數(shù)目大，是一種高通量檢測技術(shù)。普通流式細胞儀每次只能檢測幾種蛋白分子，而且檢測速度較慢，不適合高通量分析。 由此可見，兩種方法應用方向有很大差別。報告的格式如何？報告以xcel表格形式，包括每種蛋白在每個標本中的表達量。公司也可以為客戶

7、提供數(shù)理統(tǒng)計分析結(jié)果。完成一個LUMINEX的實驗,需要的細胞的量是多少? 至少10ul的血清、血漿，蛋白提取物， 或50-100萬細胞。如何控制LUMINEX檢測的質(zhì)量？我們對每一次檢測都設定標準曲線，并設定內(nèi)參進行校正。我們會定期做儀器校正，檢測精密度和重復性實驗以確保檢測結(jié)果的可靠性。實驗失敗有幾種原因? 從實驗室角度看，成敗原因包括試劑盒的質(zhì)量，待測樣品稀釋倍數(shù)；待測蛋白質(zhì)低于儀器檢測底限，實驗操作程序。從客戶角度看，成敗取決于樣品制備，保存和運輸是否恰當。我們公司可以提供規(guī)范操作程序，供客戶參考。得到實驗的結(jié)果后, 可以進行那些研究的工作? 可進行多方面的研究，例如：觀察不同實驗條件

8、對待測蛋白含量的影響，可進行藥物作用靶點研究，不同人群血樣生物標記物的研究，健康評估，疾病診斷，指導治療等。經(jīng)過分析后，若得到幾百個感興趣的基因或蛋白，如何對這些基因做功能分類或者Pathway相關(guān)分析呢？分析方法與其它技術(shù)平臺一樣，我們公司可以提供全套有償服務。如何考慮LUMINEX重復實驗的問題？我們每次都會對使用的標準品和內(nèi)參做重復性測定，同時也建議對每份樣本進行重復2次測定。在進行LUMINEX實驗時，由于經(jīng)費的限制，是否可以把多個樣品進行混合以消除樣品的個體差異后再上LUMINEX檢測？不建議這么做。多個樣品做檢測，計算平均值和誤差才有統(tǒng)計學意義。如果多個樣品混合后測定只能算1份樣品

9、?？蛻羰墙M織的樣品，準備自己提取樣品，請問樣品提取方面有沒什么技術(shù)要求？需要采用對抗原抗體反應，或者蛋白質(zhì)抗原性沒有抑制作用的提取液進行提取，避免采用會造成蛋白質(zhì)變性的試劑，如高濃度的尿素或者鹽酸胍等。需要能完全提取待測蛋白質(zhì)，否則對結(jié)果會造成誤判。提取以后需要怎么保存，怎么運輸？建議保存于-80度。避免反復凍融?？捎酶杀蛘咧辽儆帽\輸。LUMINEX的假陽性率是多少? 技術(shù)性的假陽性率非常低，小于1%。生物假陽性率取決于每個蛋白的生物學特征?？砷_展此項目的臨床科室有哪些？目前我公司擁有的世界最先進的高通量液相芯片檢測技術(shù)，在國內(nèi)僅有3臺。是否可以將同一癥狀的病例混合后抽提,看共性表達?可

10、以。混合后的樣品將被視作單一樣品進行檢測。服務流程如何？幫助客戶制定檢測方案樣品檢測結(jié)果分析報告出具可為客戶提供更深層次的服務（實驗設計、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫與發(fā)表）如何訂購您們的服務？通過咨詢，協(xié)商檢測方案，然后付費或簽訂合同。 LUMINEX蛋白檢測平臺服務項目一、細胞因子、化學因子類：6Ckine/CCL2BCA-1/CXCL13CTACK/CCL27皮膚T細胞虜獲趨化因子EGF表皮生長因子ENA-78/CXCL5 中性粒細胞激活蛋白-78Eotaxin 嗜酸細胞活化趨化因子Eotaxin-2/CCL24/MPIF-2嗜酸細胞活化趨化因子-2Eotaxin-

11、3/CCL26嗜酸細胞活化趨化因子-3FGF-2 成纖維細胞生長因子-2Flt-3 ligand FMS樣酪氨酸激酶3 配體Fractalkine 人神經(jīng)趨化因子GCP2/CXCL6 人中性粒細胞趨化蛋白2G-CSF 粒系集落刺激因子GM-CSF 粒-單系集落刺激因子GRO生長相關(guān)基因蛋白HCC-1/3/CCL14/I-309/CCL1IFN2干擾素2IFN干擾素IL-10白介素-10IL-11白介素-11IL-12 (p40) 白介素-12IL-12 (p70) 白介素-12IL-13白介素-13IL-15白介素-15IL-16白介素-16IL-17白介素-17IL-1ra白介素-1raIL

12、-1白介素1IL-1白介素-1IL-2白介素-2IL-20 白介素-20IL-21 白介素-21IL-23 白介素-23IL-28a 白介素-28aIL-29 白介素-29IL-3白介素-3IL-33/NF-HEV (mature) 白介素-33IL-4 白介素-4IL-5 白介素-5IL-6 白介素-6IL-7 白介素-7IL-8 白介素-8IL-9 白介素-9IP-10 干擾素誘導蛋白-10I-TAC/CXCL11干擾素誘導T細胞趨化因子LIF白血病抑制因子Lymphotactin淋巴細胞趨化蛋白MCP-1(MCAF)單核細胞趨化蛋白1MCP-2單核細胞趨化蛋白2MCP-3/CCL7單核細

13、胞趨化蛋白3MCP-4單核細胞趨化蛋白4M-CSF巨噬細胞集落刺激因子MDC/CCL22 巨噬細胞來源的趨化因子MIG/CXCL9趨化因子9MIP-1D (MIP-5/CCL15)巨噬細胞炎性蛋白-1DMIP-1巨噬細胞炎性蛋白-1MIP-1巨噬細胞炎性蛋白-1MIP-3/CCL19巨噬細胞炎性蛋白3MIP-3/CCL20巨噬細胞炎性蛋白3MMP -1基質(zhì)金屬蛋白酶-1MMP -2 基質(zhì)金屬蛋白酶-2MMP -3 基質(zhì)金屬蛋白酶-3MMP -7 基質(zhì)金屬蛋白酶-7MMP -9 基質(zhì)金屬蛋白酶-9MMP -10 基質(zhì)金屬蛋白酶-10MMP -12 基質(zhì)金屬蛋白酶-12MMP -13 基質(zhì)金屬蛋白

14、酶-13NAP-2/CXCL7中性粒細胞趨化蛋白2PDGF-AA 血小板衍生生長因子AAPDGF-AB/BB血小板衍生生長因子AB/BBRANTES分泌趨化因子sCD30 可溶性CD30sCD40L可溶性CD40LSCF干細胞因子SDF-1+/CXCL12基質(zhì)細胞衍生因子-1+sEGFR可溶性表皮生長因子受體sgp130 可溶性糖蛋白130sIL-1RI可溶性白細胞介素-1受體IsIL-1RII可溶性白細胞介素-1受體IIsIL-2R可溶性白細胞介素-2受體sIL-4R可溶性白細胞介素-4受體sIL-6R 可溶性白細胞介素-6受體sRAGE 可溶性晚期糖基化中產(chǎn)物受體sTNF RI 可溶性腫瘤

15、壞死因子受體IsTNF RII可溶性腫瘤壞死因子受體IIsVEGF R2 可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體2sVEGF R3 可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體3sVEGF RI 可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體ITARC/CCL17胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子TGF轉(zhuǎn)化生長因子TIMP-1組織金屬蛋白酶抑制劑-1TIMP-2組織金屬蛋白酶抑制劑-2TIMP-3組織金屬蛋白酶抑制劑-3TIMP-4組織金屬蛋白酶抑制劑-4TNF 腫瘤壞死因子TNF腫瘤壞死因子TPO 甲狀腺過氧化物酶TRAIL/TNFSF10TSLP人胸腺基質(zhì)淋巴細胞生產(chǎn)素VEGF血管內(nèi)皮生長因子二、細胞信號通路類：Active Caspase 3 活化半

16、胱胺酸蛋白酶 3Active Cleaved PARP活化切割的多腺苷二磷酸多聚酶Akt/PKB (Ser473) 磷酸化蛋白激酶BAkt/PKB (Thr308) 磷酸化蛋白激酶BATF2 (Thr69/71)活化復制因子2BAD (Ser112)CD3 (pan Tyr)c-Jun (Ser73)c-Kit (pan Tyr)Cleaved PARPc-Met/HGFR (pan Tyr)CREB (Ser133)EGF Receptor (pan Tyr)表皮生長因子受體Erb-B2/HER2 (pan Tyr)第二人體表皮生長因子受體ERK/MAP Kinase 1/2 (Thr185

17、/Tyr187)GAPDHH2A.X (Ser139)HSP27 (Ser 78)IGF1R (pan Tyr)胰島素樣生長因子1受體IRS1 (pan Tyr)IB (Ser 32)JNK (Thr183/Tyr185)LAT (pan Tyr)Lck (pan Tyr)MEK1 (Ser222)MKK6 (Ser207/Thr211)MSK1 (Ser212)p21p38 (Thr180/Tyr182)p53 (Ser15)p53 (Ser46)p70 S6 Kinase (Thr412)PDGF Receptor (pan Tyr)Rsk1 (Ser380)STAT1 (Tyr701)S

18、TAT1 (Tyr707)STAT2 (Tyr690)STAT3 (Ser727)STAT3 (Tyr705)STAT5A/B (Tyr694/699)STAT6 (Tyr641)Syk (pan Tyr)ZAP-70 (pan Tyr)三、神經(jīng)因子類：CortisolApo AlApo CIIIApo EBDNFCathepsin D組織蛋白酶DComplement C3Complement C4Complement Factor HC reactive protein (CRP) C-反應蛋白MelatoninMIP-4MPONCAMNeurotensinOrexin AOxytocinP

19、AI-1 (total)PDGF-AAPDGF-AB/BBPEDFPrealbuminRANTESSAPsICAM-1Substance PsVCAM-11-Antitrypsin2-Macroglobulin-MSH-Endorphin四、骨代謝因子類：RANKLAdiponectin脂聯(lián)素IL-1ACTHIL-6InsulinLeptin瘦素Osteopontin (OPN)骨橋蛋白OsteocalcinOsteoprotegerinPTHTNF 腫瘤壞死因子五、皮膚生長調(diào)控因子：CortisolFibronectinHSAInvolucrinLPSKeratin-6Keratin - 1

20、Keratin - 10六、凋亡及敗血癥因子：MIF巨噬細胞移動抑制因子PAI-1 (Total)sFassFasLsICAM-1sVCAM-1七、免疫球蛋白分型：IgAIgG1IgG2IgG3IgG4IgM八、腫瘤生物標記物：CA-125癌抗原125IGF-II 胰島素樣生長因子2Leptin瘦素MIF巨噬細胞移動抑制因子Osteopontin (OPN)骨橋蛋白Prolactin泌乳刺激素MMP-1基質(zhì)金屬蛋白酶-1MMP-2 基質(zhì)金屬蛋白酶-2MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶-9CA 15-3癌抗原檢測15-3Serum amyloid A血清淀粉樣蛋白ACA 19-9癌抗原19-9TGF 轉(zhuǎn)化

21、生長因子Cathepsin D組織蛋白酶DTNF 腫瘤壞死因子VEGF血管內(nèi)皮生長因子VEGFR2血管內(nèi)皮生長因子受體2-2-Microglobulin -2微球蛋白CEA 癌胚抗原C reactive protein (CRP) C-反應蛋白E-cadherin 上皮型鈣黏附蛋白EGFR表皮生長因子受體Eotaxin 嗜酸細胞活化趨化因子ER- 雌激素受體Fas(CD95 or Apo-1) 腫瘤壞死因子受體超家族成員6Ferritin 鐵蛋白Fibrinogen纖維蛋白原AFP 甲胎蛋白Follistatin 卵泡素G-CSF 集落刺激因子3Haptoglobin 結(jié)合珠蛋白HER-2(e

22、rbB2) 第二人體表皮生長因子受體ICAM-1細胞間粘附分子-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3Angiopoietin-2血管生成素2LH賴氨酸羥化酶MCP-1(MCAF)單核細胞趨化蛋白1MIG/CXCL9趨化因子9tPSA總前列腺特異性抗原fPSA游離前列腺特異性抗原NSE神經(jīng)元特異性烯醇化酶Free-hCG游離血清人絨毛膜促性腺激素EB antibody EB病毒抗體HE4人附睪分泌蛋白4CA215癌抗原215CA242癌抗原242CA724癌抗原724CA50癌抗原50Cyfra 21-1角蛋白19片段SCCA鱗狀細胞癌抗原九、內(nèi)分泌激素類：ACTHAGRPAmylin (Active or Total)BDNFCNTFC-PeptideFSHGHGLP-1 (Active)GlucagonIGF-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3IGFBP-4胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4IGFBP-5胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5IGFBP-6IGFBP-7InsulinLeptinLH賴氨酸羥化酶Prolactin泌乳刺激素TSHGhrelin (Active)GIP (Tot