水系霍亂弧菌監(jiān)測點技術(shù)規(guī)范

1、附件 2：水系霍亂弧菌監(jiān)測點監(jiān)測技術(shù)規(guī)范一、 采樣與送檢技術(shù)規(guī)范 1、水體：水體的采樣一般要求用滅菌的500ml水樣瓶采集相對靜止的表層水（30cm以內(nèi)）500ml，加蓋密封后在室溫（2025）下送實驗室檢測。取水點的選擇應結(jié)合流行病學調(diào)查等資料確定，同時，采樣時應選擇在水流平穩(wěn)或靜止處吸取。非疫情狀態(tài)下的監(jiān)測采樣時間一般在清晨時，此時水體未受人群活動等因素影響。每個采樣點中采樣位置應相距數(shù)米、采集不少于2瓶作為平行檢測。采樣時立即測定采集樣品的溫度、PH，并記錄當天的最高溫度和最低溫度，數(shù)據(jù)始終隨每份樣品的檢測報告逐級上報。2、水產(chǎn)品：水生動物的采樣通常選取活的新鮮的水生動物為采集對象，有時

2、也應考慮冰凍的水生動物，以無菌操作采集合適的部位，如腮部和/或腸內(nèi)容物等，置采樣瓶（管）或食品采樣袋密封，在常溫下送檢。有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室在進行相關(guān)處置。同時，要求以無菌棉簽涂抹五只（條）以上的某類水生動物體表、腮及/或肛門，置堿性蛋白胨水送檢，每管堿性蛋白胨水作一份樣品看待。3、樣品的送檢：統(tǒng)一要求在樣品采集后，按生物安全規(guī)范，在室溫條件下3小時內(nèi)送遞實驗室開展霍亂弧菌的分離培養(yǎng)。在北方地區(qū)冬季采樣時，應注意樣品的保溫，防治結(jié)冰。二、水體和水產(chǎn)品樣本霍亂弧菌分離培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范（一）培養(yǎng)基要求：以堿性蛋白胨水（ph8.6）作為增菌液；強選擇性分離培養(yǎng)基使用慶大霉素培養(yǎng)基或T

3、CBS培養(yǎng)基；弱選擇性培養(yǎng)基統(tǒng)一使用堿性瓊脂。每批培養(yǎng)基在使用前必須進行質(zhì)量檢測。（二）水體樣本的增菌：增菌培養(yǎng)方法規(guī)定采樣一下兩種之一。1、十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法:詳見霍亂防治手冊（第五版）第75頁。2、濾膜富集增菌培養(yǎng)法：以0.45微米濾膜，使用Millipore真空過濾系統(tǒng)進行細菌富集，富集后的濾膜置含有終濃度為1/20萬亞硒酸鉀的10ml堿性蛋白胨三角瓶內(nèi)增菌。3、水產(chǎn)品樣品增菌：使用無菌棉簽涂抹的樣品，直接接種到堿性蛋白胨水作為增菌液處理。整體或局部采回的樣品，在實驗室應先在無菌操作的條件下，將其解刨，取腮部和腸內(nèi)容物剪碎后，置100ml三角瓶內(nèi)，加入510倍體積的堿性蛋白胨水增菌

4、；但小貝殼類動物，則用錘子將外殼擊碎，整體放入三角瓶中增菌；甲殼類動物除含肉質(zhì)部分外，其余部分部分（包括腮、腸、足、表層外殼等）整體放入三角瓶進行增菌處理。4、環(huán)境樣品的霍亂弧菌分離培養(yǎng)程序：樣品在37經(jīng)812h增菌后，每份樣品分別接種一個9cm直徑的慶大霉素瓊脂或TCBS瓊脂平板和一個堿性瓊脂平板進行劃線分離培養(yǎng)，同時，以無菌吸管吸取0.20.5ml增菌液接種到新的堿性蛋白胨水中，進行二次增菌培養(yǎng)后，再如上述步驟進行劃線分離培養(yǎng)。特別強調(diào)所有環(huán)境樣品的增菌分離培養(yǎng)步驟必須包括上述二次增菌和強、弱雙平板分離。5、疑似菌落鑒定基本要求：分別從慶大霉素瓊脂或TCBS瓊脂、堿性瓊脂平板上各挑取5個以上的（少于5個的全部挑取）疑似菌落接種于營養(yǎng)瓊脂斜面置371824h純培養(yǎng)（即每份樣品至少從4個分離平板上獲得約20株可疑菌落菌株），取斜面純培養(yǎng)物進行O1 群及O139群霍亂診斷血清玻片凝集試驗，血清凝集陽性的菌株繼續(xù)相關(guān)的系統(tǒng)鑒定并報告結(jié)果。必須注意同一樣品中O1、O139群霍亂弧菌可能同時存在，有必要對所有選出的菌株都進行凝集試驗，以免遺漏。從環(huán)境中檢出的O1或O139群霍亂弧菌，要求即時上送省疾病預防控制中心進行噬菌體生物分型，具備條件的進行毒素基因的PCR檢測、確定是否采取相關(guān)措施。