普通光學(xué)顯微鏡的原理與使用.ppt

1、普通光學(xué)顯微鏡原理與使用,河北大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,主要內(nèi)容,顯微鏡的發(fā)展 顯微鏡的光學(xué)原理 顯微鏡的幾個(gè)基本概念 顯微鏡的結(jié)構(gòu) 顯微鏡的使用 顯微鏡的維護(hù),要知道的幾個(gè)重要的分辨率,人眼：0.2mm/250mm 光學(xué)顯微鏡：0.2um 電子顯微鏡：0.2nm,1.顯微鏡的發(fā)展,1.1 人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個(gè)物體。也就是說(shuō)，當(dāng)兩個(gè)物體相距不到0.1mm的時(shí)候，人眼就會(huì)把它們看成是一個(gè)物體了。這個(gè)極限便稱為人眼的分辨本領(lǐng)。 人眼視錐細(xì)胞直徑為4微米，對(duì)應(yīng)的視角約為30秒，這個(gè)角度就是視角的極限。一般要能清晰

2、的分辨兩個(gè)點(diǎn)，視角須在1分以上。高1米的物體距眼睛3400米時(shí)，視角為1分。,1.2 放大鏡：約在四百年前眼鏡片工匠們開始磨制放大鏡。當(dāng)時(shí)的放大鏡的放大倍數(shù)只有35x 1.3 顯微鏡： 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。 16731677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡 19世紀(jì)70年代，德國(guó)人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。 1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)； 1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)； 1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，,羅伯特虎克制造的顯微鏡（1665）放大倍數(shù)：140倍,列文虎克和他的顯微鏡（約1680）,2 顯微鏡的光學(xué)原理,2

3、.1折射和折射率 光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播，當(dāng)通過(guò)不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。,2.2凸透鏡的五種成象規(guī)律(1) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)象； (2) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)象； (3) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象； (4) 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則象方不能成象； (5) 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則象方也無(wú)象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置

4、形成放大的直立虛象。,2.3顯微鏡的成像原理 顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。 物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個(gè)倒立的放大的實(shí)像AB。 AB靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像AB后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過(guò)目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。,3 顯微鏡的幾個(gè)基本概念,3.1 光源：能發(fā)射光波的物體。 可見光頻率范圍：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)

5、范圍：390nm 760nm 相應(yīng)光色：紫、藍(lán)、青、綠、黃、橙、紅,3.2分辨率(鑒別距離)：顯微鏡能分辨的最小距離，用D表示。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高。 D=0.61/ nsin D：分辨率 :光波的波長(zhǎng) N:介質(zhì)折射率 :物鏡鏡口角 3.3孔徑角：由標(biāo)本上一點(diǎn)發(fā)出的進(jìn)入物鏡最邊緣光線L和進(jìn)入物鏡中心光線OA之間的夾角稱為孔徑角。 3.4數(shù)值孔徑：令NA = nsin , 叫物鏡的數(shù)值孔徑。 數(shù)值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關(guān)系，越短，NA越大，分辨率越高。,物鏡數(shù)值孔徑,3.5放大率 在顯微鏡下所看到的物像和實(shí)際物體之間的大小比例叫顯微鏡的放大率或放大倍數(shù)。顯微鏡下物像的放大主要由物

6、鏡、鏡筒長(zhǎng)度、目鏡所決定。適合的放大倍數(shù)決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一船應(yīng)為數(shù)值孔徑的5001000倍。 3.6像差,像差,球差,象散,慧差,場(chǎng)曲,負(fù)畸變,正畸變,色差,球差校正,色差校正,3.7焦點(diǎn)深度 在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內(nèi)物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清。這段距離位于顯微鏡焦點(diǎn)的上下很小的范圍之內(nèi)。這段距離的上下限叫焦點(diǎn)深度。,焦點(diǎn)深度,3.8視場(chǎng)數(shù) 目鏡中觀察到的物像的一定范圍叫視野。 顯微鏡的總放大率小的時(shí)候所能看到的標(biāo)本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標(biāo)本的局部愈小。所以說(shuō)視野與顯微鏡的總放大率成反比。 在同一總放大率的條件下視野也可有大小差別。這種差別決定于目鏡

7、的某些性能。首先目鏡的視場(chǎng)光欄的直徑是最主要的條件。視場(chǎng)光欄的直徑叫目鏡的視場(chǎng)數(shù)值,3.9工作距離 工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。 數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。,點(diǎn)光源經(jīng)過(guò)光學(xué)儀器的小圓孔后，由于衍射的影響，所成的像不是一個(gè)點(diǎn)，而是一個(gè)明暗相間的衍射圖樣，中央為愛里斑。,s1,s2,D,*,*,愛里斑,瑞利判據(jù)：當(dāng)一個(gè)點(diǎn)光源的衍射圖樣的中央最亮處剛好與另一個(gè)點(diǎn)光源的衍射圖樣的第一級(jí)暗紋相重合時(shí)，這兩個(gè)點(diǎn)光源恰好能被分辨。,提高顯微鏡分辨率的方法：,（1）增大物鏡的數(shù)值孔徑 在物鏡和蓋玻片之間充以n 較大的

8、油，如香柏油n =1.52,不僅使n 增大，而且孔徑角 也增大。 （2）用短波長(zhǎng)的光照射 如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。,4 顯微鏡的結(jié)構(gòu),組成,光學(xué)放大系統(tǒng),照明系統(tǒng),機(jī)械和支架系統(tǒng),物鏡,光源,折光鏡,聚光鏡,濾光片,目鏡,光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)： 1. 照明燈(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 載物臺(tái)和切片夾(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推進(jìn)器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物鏡(Objectives) 6. 粗細(xì)螺旋(Course and fine focus knob)

9、 7. 目鏡(Oculars) 8. 照相機(jī)等接口(Connection to camera, etc.),4.1物鏡 物鏡(objective)是光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領(lǐng)的最關(guān)鍵部件。 (1)消色差物鏡(achromat) 色差校正使可見光中紅光和藍(lán)光聚焦于一點(diǎn)，而黃綠光則聚焦于另一點(diǎn)。能夠消除光譜中紅光和藍(lán)光所形成的色差。這種物鏡與目鏡配用時(shí)可達(dá)到消色差物鏡所要求的光學(xué)性能。 (2)復(fù)消色差物鏡(apochromat) 是性能最高的物鏡。能消除可視光中黃、紅、藍(lán)即包括幾乎所有譜線在成像過(guò)程中所造成的色差。,(3)平象物鏡 它們所成的影象基本上是平的，象場(chǎng)彎曲很小，不會(huì)發(fā)

10、生視野中心與邊緣不能同時(shí)準(zhǔn)焦的現(xiàn)象，因此對(duì)目視觀察及顯微攝影都極為方便。平象物鏡由于將彎曲的影象展平，在同樣放大倍數(shù)下它成的影象比用一般物鏡要大一點(diǎn)。在平象物鏡的金屬外框上，刻有Flanachr、 planapo、 plan 等字樣。 (4)相差物鏡 相差物鏡(Phasencontrast objective)的一個(gè)透鏡片上噴涂著一層環(huán)狀金屬膜板叫相位板。相位板是相差顯微鏡的關(guān)鍵部件。它和相差顯微鏡的聚光鏡上的的環(huán)狀光欄相配合使用。有關(guān)位相板涂料的性質(zhì)和作用原理在以后詳述。 外殼上刻有Ph標(biāo)記,物鏡結(jié)構(gòu),低倍物鏡,物鏡標(biāo)識(shí),無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng),4.2目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)象再放大一級(jí)，并

11、把物象映入觀察者的眼中，實(shí)質(zhì)上目鏡就是一個(gè)放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對(duì)于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。 4.3聚光鏡 聚光鏡裝在載物臺(tái)的下方。小型的顯微鏡往往無(wú)聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時(shí)，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來(lái)的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。,聚光鏡光欄 所謂光欄，從廣義的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可認(rèn)為光欄。 聚光鏡光欄作用 （1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調(diào)整圖象的分辨率和反差。 （2）輔助調(diào)整

12、亮度。,聚光器數(shù)值孔徑,5 光學(xué)顯微鏡的使用,實(shí)驗(yàn)時(shí)要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿 67 cm左右。 打開光源開關(guān)，調(diào)節(jié)光強(qiáng)到合適大小。 轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對(duì)載物臺(tái)上的通光孔。 將所要觀察的玻片放在載物臺(tái)上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。 先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動(dòng)粗動(dòng)調(diào)焦手輪，使載物臺(tái)上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，然后，通過(guò)目鏡觀察，并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦手輪，使載物臺(tái)慢慢下降，直到看清物像。,如果像偏離視野，可慢慢調(diào)節(jié)載物臺(tái)移動(dòng)手柄。 瞳距調(diào)節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。 屈光度調(diào)節(jié) 高倍物鏡觀察：把物

13、像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡轉(zhuǎn)入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時(shí)，換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動(dòng)調(diào)焦手輪進(jìn)行調(diào)節(jié)。 根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱）。 觀察完畢，應(yīng)先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，并檢查物鏡是否沾水沾油，檢查處理完畢后即可裝箱。,瞳距調(diào)節(jié),屈光度調(diào)節(jié),6 光學(xué)顯微鏡的維護(hù),顯微鏡要輕拿輕放。 嚴(yán)禁將表面有水的載片放到顯微鏡上。 從低倍轉(zhuǎn)入高倍應(yīng)能看到圖象，否則需轉(zhuǎn)入低倍另行調(diào)節(jié)、查找原因。 每次使用完畢后將將光源亮度調(diào)至最低。 臨時(shí)不用顯微鏡只需將光源亮度調(diào)至最低而無(wú)需關(guān)閉。忌頻繁開關(guān)顯微鏡電源。 鏡頭臟污只能用專用工具經(jīng)專門程序清洗。 使用完畢等燈箱冷卻后罩上防塵罩或放入箱內(nèi)，并存于干燥無(wú)塵處。,清潔工具,清潔液配方：1份無(wú)水乙醇3份乙醚,擦拭方法,注意,塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。 嚴(yán)禁用干擦鏡紙擦拭鏡頭。 物鏡嚴(yán)禁拆卸并防止振動(dòng)。 打開