酵素化學(xué)實(shí)驗(yàn).ppt

1、Enzyme Biochemistry Laboratory,酵素化學(xué)實(shí)驗(yàn),國立臺灣大學(xué) 微生物與生化所 莊榮輝,酵素純化方法 酵素分析方法 問題集,B2,酵素純化與分析,酵素分析方法,1 蛋白質(zhì)定量法 2 酵素活性測定法 3 電泳檢定法 4 分子量決定法 5 蛋白質(zhì)構(gòu)造與組成分析 6 免疫學(xué)工具的利用 7 蛋白質(zhì)科技,1 蛋白質(zhì)定量法,1.1 Biuret 法 1.2 Lowry 法 1.3 UV 吸光法 1.4 Coomassie Blue (dye binding) 法 1.5 其它方法, 蛋白質(zhì)構(gòu)造的骨架：,R group,N-C-C-N-C-C-N-C-C,Cu2+,Cu+,活性區(qū),

2、尿素 urea, 各 種 蛋 白 質(zhì) 定 量 法 原 理 ：,Coomassie Brilliant Blue G,4,5,Specific Binding Group,M,3,1,2,206 nm (carbonyl),280 nm (aromatic),UV Absorbance,Biruet Methods (carbonyl),Lowry Methods,Phosphomolybdic- phosphotungstate,Metal,Tyr,Arg,Lys,Heme, 分子消光係數(shù)：, 分子吸收某波長光線能力的指標(biāo),吸光值 = E x b x c,constant,1 cm,光,光,1

3、,10,0.1,%, 蛋白質(zhì)的分子消光係數(shù)：, 280 nm - Aromatic Groups (Side chain) 1 mg/mL 溶液 吸光度 (280 nm) = 1 約值, 192 nm - Carbonyl Groups (Backbone) 1 mg/mL 溶液 吸光度 (192 nm) = 60 (206 nm) = 29,200 nm 附近的吸光受 氧分子 干擾很大, 共軛雙鍵：,p,p 電子共振,p,活性區(qū), 各 種 蛋 白 質(zhì) 定 量 法 原 理 ：,Coomassie Brilliant Blue G,4,5,Specific Binding Group,M,Metal,Arg,Lys,Heme, Bradford Method：,Coomassie Brilliant Blue G-250,加入蛋白質(zhì),酸性環(huán)境下呈茶色,與蛋白質(zhì)結(jié)合變藍(lán)色,CBG 是一種指示劑,470 nm,595 nm, 不同蛋白質(zhì)的定量差異：,A600,mg Protein,BSA,IgG, 各種蛋白質(zhì)定量法的比較：,Lowry,Absorbance 280 nm,Absorbance 205 nm,Bradford Dye-binding,定量方法,靈敏度,準(zhǔn)確度,其它說明,Biuret,精 確,準(zhǔn) 確,精確+準(zhǔn)確,不精確+不準(zhǔn)確,280