植物生物技術(shù)：第十章植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法

1、第十章 植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法,第一節(jié) 植物遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展 第二節(jié) 根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)基因 第三節(jié) 基因槍介導的植物轉(zhuǎn)基因 第四節(jié) 其他植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),本章主要內(nèi)容,第10章 植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法,本章教學目的與要求,農(nóng)桿菌T-DNA導入植物基因組整個過程 影響T-DNA轉(zhuǎn)移的主要因素 農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因的過程 基因槍法轉(zhuǎn)基因的優(yōu)缺點,第10章 植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法,第一節(jié) 植物遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展,嘗試階段：20世紀60-70年代 發(fā)展階段：20世紀80-90年代 物種的增加 轉(zhuǎn)基因方法的改進及創(chuàng)新 轉(zhuǎn)基因商業(yè)化發(fā)展階段 大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、馬鈴薯、煙草、西葫蘆和蕃木瓜等九種作物

2、的轉(zhuǎn)基因品種投入了商業(yè)化生產(chǎn),植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法,（1）間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法 （2）直接轉(zhuǎn)化法 A、 基因槍轉(zhuǎn)化法 B、 電擊法 C、花粉管通道法 D、 PEG介導基因轉(zhuǎn)化法,第二節(jié) 根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)基因,根癌農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生冠癭瘤,一、根癌農(nóng)桿菌的生物學特性,根癌農(nóng)桿菌屬于農(nóng)桿菌屬的革蘭氏陰性菌，最適生長溫度為25-30，最適pH范圍6.0-9.0 根癌農(nóng)桿菌廣泛侵染雙子葉植物，據(jù)不完全統(tǒng)計，約有93屬643種雙子葉植物對根癌農(nóng)桿菌敏感 裸子植物同樣具有敏感性，能誘發(fā)腫瘤 近年研究顯示：農(nóng)桿菌對有些單子葉植物也有侵染能力,二、常用的農(nóng)桿菌菌株：,農(nóng)桿菌T-DNA導入植物基因組

3、整個過程：,三、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的分子機理,（1）農(nóng)桿菌對受體的識別,（2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細胞,（3）誘導啟動毒性區(qū)基因表達,（4）類似接合孔復合體的合成和裝配,（5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運,（6）T-DNA的整合,農(nóng)桿菌對植物受體識別的基礎(chǔ)是細菌的趨化性：受傷植物組織產(chǎn)生的一些糖類、氨基酸類、酚類物質(zhì)，菌株對這些化學物質(zhì)產(chǎn)生趨向性反應。,(1) 農(nóng)桿菌對受體的識別,（2）農(nóng)桿菌附著到受體細胞,根癌農(nóng)桿菌附著于植物細胞是T-DNA加工和轉(zhuǎn)移的前提,植物細胞表面的農(nóng)桿菌附著位點是有限的，根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的附著位點不同。每個植物細胞可以同時附著多種不同的農(nóng)桿菌菌株，但僅僅只能被一個或少數(shù)幾個

4、菌株所轉(zhuǎn)化。,只有在創(chuàng)傷部位生存了816小時之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這段時間稱為細胞調(diào)節(jié)期。在調(diào)節(jié)期內(nèi)，農(nóng)桿菌會產(chǎn)生細微的纖絲而將自身縛附在植物細胞壁表面。,（3）誘導和啟動毒性區(qū)基因表達,當農(nóng)桿菌在生長培養(yǎng)基上大量繁殖時，所有的T區(qū)基因均處于非轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài) 當把植物受傷細胞提取液加入培養(yǎng)基時，所有的T區(qū)基因均被誘導和活化 植物細胞分泌物（糖、氨基酸和酚類物質(zhì)等）既是農(nóng)桿菌定向附著到植物細胞表面的物質(zhì)，也能誘導和啟動毒性區(qū)基因的表達，為T-DNA的轉(zhuǎn)運做準備,（4）類似接合孔復合體的合成和裝配,T-DNA的轉(zhuǎn)運的第一步是通過細菌細胞膜 農(nóng)桿菌必須形成一個跨膜通道 現(xiàn)在認為，VirB蛋白可能充當

5、了這個角色，這些蛋白可能一起在膜上形成一種類似于細菌結(jié)合轉(zhuǎn)移時所必需的結(jié)構(gòu)，即接合孔，T-DNA通過這種孔由農(nóng)桿菌進入植物細胞,（5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運,Vir基因操縱子被激活后，VirD1和VirD2蛋白在邊界重復序列的特定位點上（一般認為在末端第3和第4堿基處）切下單鏈T-DNA 同時，T鏈的5端與VirD2蛋白共價結(jié)合，以免5端受到5外切酶的攻擊 VirE2蛋白與單鏈T-DNA非共價結(jié)合，形成細長的核酸蛋白質(zhì)絲，抵抗3和5外切核酸酶及內(nèi)切核酸酶的降解 加工好的單鏈T-DNA復合體穿過由VirB蛋白形成的類接合孔進入植物受體細胞，然后由VirD2和VirE2的核導向作用進入植物細胞核,

6、（6）T-DNA的整合,當單鏈的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞之后，在有關(guān)的植物細胞酶體系的催化作用下，便會合成出互補鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。 在一系列酶的參與下整合進植物基因組。 這種整合是一種隨機的： 優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點； T-DNA與植物DNA連接處富含A、T堿基； 植物DNA上的插入位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性,四、T-DNA轉(zhuǎn)移的影響因素,（1）農(nóng)桿菌菌株,一般而言，三類農(nóng)桿菌菌株的侵染力的排列順序為：農(nóng)桿堿型（琥珀堿型）菌株（如A281）胭脂堿型菌株（C58）章魚堿型菌株（Ach5，LBA4404） 棉花中EHA105（農(nóng)桿堿型）LBA4404（章魚堿

7、性）,（2）農(nóng)桿菌菌株高侵染活力的生長時期,高侵染活力的菌株一般處在對數(shù)生長期，也即0.31.0 OD范圍。1.0 OD1x108 cell/ml。,一般用0.3 1.0OD農(nóng)桿菌菌液接種植物材料,（3）基因活化的誘導物,Vir區(qū)基因的活化是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的先決條件 酚類化合物、單糖或糖酸、氨基酸、磷酸饑餓和低pH都影響Vir區(qū)基因的活化。 常用的誘導物：乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS）,（4）外植體的類型和生理狀態(tài),1997年Villemont研究指出，轉(zhuǎn)化只發(fā)生在細胞分裂的一個較短時期內(nèi)，只有處于細胞分裂S期的細胞才具有被外源基因轉(zhuǎn)化的能力。因此，細胞具有分裂能力是轉(zhuǎn)化

8、的基本條件。,一般來說，發(fā)育早期（幼年期）的組織細胞轉(zhuǎn)化能力較強。,（5）外植體的預培養(yǎng),每種外植體均有其最佳預培養(yǎng)時間，時間太長反而降低外植體的轉(zhuǎn)化率，23天為宜,外植體的預培養(yǎng)有以下作用： 促進細胞分裂，使受體細胞處于更容易整合外源DNA狀態(tài) 田間取材的外植體通過預培養(yǎng)起到馴化作用，使外植體適應于試管離體培養(yǎng)的條件 有利于外植體能與培養(yǎng)基平整接觸：外植體在開始培養(yǎng)過程中，由于其迅速生長而出現(xiàn)上翹和卷曲，使農(nóng)桿菌的接種切面離開培養(yǎng)基致使農(nóng)桿菌生長受抑制而實現(xiàn)對受體的轉(zhuǎn)化,（6）外植體的接種及共培養(yǎng),外植體的接種: 指把農(nóng)桿菌工程菌株接種到外植體的侵染轉(zhuǎn)化部位。,農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)在整個轉(zhuǎn)化

9、過程中非常重要，農(nóng)桿菌的附著，T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合都在這個時期內(nèi)完成,農(nóng)桿菌附著外植體表面后并不能立刻轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存816h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤。因此，共培養(yǎng)時間必須長于816h。,共培養(yǎng)：指農(nóng)桿菌與外植體共同培養(yǎng)的過程。,五、轉(zhuǎn)化細胞的選擇培養(yǎng),轉(zhuǎn)化細胞和非轉(zhuǎn)化細胞在非選擇培養(yǎng)基上生長存在著競爭，而且往往非轉(zhuǎn)化細胞在這種條件下生長更具優(yōu)勢，轉(zhuǎn)化難以成功。 一般在轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建時就應該考慮后期轉(zhuǎn)化細胞的選擇問題。多在轉(zhuǎn)化載體上加入一個選擇標記基因。這樣，在選擇培養(yǎng)中加入選擇試劑可以抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長，而對轉(zhuǎn)化細胞的生長無抑制作用，從而起到選擇效果。,六、各種農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù),（一）

10、整株感染 （二）葉盤法 （三）原生質(zhì)體法 （四）替代性轉(zhuǎn)化法,七、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的具體技術(shù),（一）農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序的轉(zhuǎn)化方法,農(nóng)桿菌菌株EHA105，卡那霉素選擇 1. 在營養(yǎng)土中種植一定數(shù)量的擬南芥，至花期。 2. 農(nóng)桿菌的活化：超低溫冰箱內(nèi)取出保存菌株的甘油管在冰上融化，接菌于YEP液體培養(yǎng)基中，28搖菌約30hr，將活化的菌液按1:400轉(zhuǎn)至卡娜霉素和利福平的培養(yǎng)基中，28搖菌約14hr，測OD值，OD值在1.5-3.0時。收集菌體，用滲透培養(yǎng)基里（1/2MS + 10%蔗糖 + 20l Silwet-77），使OD為0.81.0左右可用于轉(zhuǎn)化。,進行花序侵染前先剪掉角果和花，然后將擬南

11、芥的花序浸泡于含農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基里2-3分鐘，可用吸管輕輕攪拌農(nóng)桿菌浸染緩沖液，以利于轉(zhuǎn)化，浸染結(jié)束后將植株平放于吸水紙上干燥數(shù)分鐘，以免農(nóng)桿菌菌液滴落到蓮座葉上，同時也避免過高濃度的農(nóng)桿菌對植株有毒害作用。 轉(zhuǎn)化完成后套黑色塑料袋進行暗培養(yǎng)，1天后，揭開塑料袋進行光照培養(yǎng)直至角果成熟。 收獲T1代轉(zhuǎn)基因種子進行篩選，得到的陽性轉(zhuǎn)化植株移栽至營養(yǎng)土中培養(yǎng)。,（二）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花下胚軸的方法,農(nóng)桿菌菌株LBA4404，卡那霉素選擇 農(nóng)桿菌菌株的培養(yǎng)： 超低溫冰箱內(nèi)取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上劃線，28暗培養(yǎng)36-48hr，待皿內(nèi)長出清晰的單菌落，接種于含卡那霉素和利福平的LB培

12、養(yǎng)基中，28搖菌36-48hr，待菌液渾濁，取1ml菌液涂布于含卡那霉素和利福平的LB固體培養(yǎng)基上，28暗培養(yǎng)36-48hr，待皿內(nèi)長出足夠的菌落后，把培養(yǎng)基表面菌落刮入三角瓶內(nèi)的MGL（含乙酰丁香酮50mg/L）培養(yǎng)基中，28、200rpm搖30min，OD值在0.5-1.0之間即可用于侵染。,2. 無菌苗制備 3. 外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng) 取7d左右的棉花無菌苗置于無菌平皿，迅速切成0.5-0.7cm左右的小段，放入農(nóng)桿菌工程菌液，放置5-10min；期間搖動三角瓶數(shù)次，然后取出下胚軸小段，置于干燥的無菌濾紙上，吸干材料表面的菌液，吹5分鐘使表面稍為干燥，分散布于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS

13、無機鹽+B5有機物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+葡萄糖30g/l + 瓊脂7.5g/l, pH 5.6 )中，19-21, 暗培養(yǎng)48小時結(jié)束共培養(yǎng)。,4. 將共培養(yǎng)后的材料接入篩選培養(yǎng)基（MS無機鹽+B5有機物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+葡萄糖30g/l + 瓊脂7.5g/l+卡那霉素50mg/l+頭孢霉素200mg/l, pH 5.6 )中，28暗培養(yǎng)，每三周繼代一次 5. 將篩選培養(yǎng)基的抗性愈傷組織接入胚狀體誘導培養(yǎng)基，28光照培養(yǎng)。把誘導產(chǎn)生的胚狀體接入胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基長芽；再進一步置于生根培養(yǎng)基生成完整的轉(zhuǎn)基因植株。 6. 將根系健壯的植

14、株移入盆缽，涼棚過渡35d；然后移到自然條件下生長，直至成熟。,（三）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織,1.農(nóng)桿菌的活化：超低溫冰箱內(nèi)取出保存菌株的甘油管在冰上融化，YEP平皿上劃線，28暗培養(yǎng)36-48hr，待皿內(nèi)長出清晰的單菌落，接種于含卡那霉素和利福平的LB培養(yǎng)基中，28搖菌6-8hr至OD=0.5，再將要好的菌以1:1000的比例接種到ABC培養(yǎng)基中，過夜搖菌，取搖好的菌液30ml，離心收集菌液，用AAM培養(yǎng)基重懸，OD值=0.4之間即可用于侵染。,2. 農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織共培養(yǎng):取預培養(yǎng)15d的質(zhì)地均勻健康的胚性愈傷組織接入100ml錐形瓶，加入農(nóng)桿菌菌液，浸泡30min，倒去菌液，用滅菌

15、濾紙上吸干表面菌液，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基25 ，暗培養(yǎng)23D 3. 抗性愈傷的選擇與培養(yǎng)：將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無菌水清洗56次，再加入滅菌水（含1000mg/l頭孢霉素）在 25 ，120r/min下?lián)u動3h ，倒滅菌水，將愈傷組織置于滅菌濾紙上吸干，接入篩選培養(yǎng)基（2mg/l 500mg/l頭孢霉素、200mg/l氨芐青霉素、50mg/l潮霉素），25弱光培養(yǎng)20天左右。 4. 植株再生與移栽：將篩選培養(yǎng)基的抗性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基，直至分化成苗，根系好的再生植株直接移栽，發(fā)育不良的可以嫁接移栽 。,八、農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化具有以下特點,優(yōu)點： 操作簡便 轉(zhuǎn)化效率高 轉(zhuǎn)化機理明確 外源基因多

16、以低拷貝插入、遺傳穩(wěn)定。 缺點： 轉(zhuǎn)化周期長導致體細胞無性系變異嚴重 基因型依賴性強 需要深厚的組織培養(yǎng)基礎(chǔ),第三節(jié) 基因槍法,基因槍法（gene gun)又稱離子槍法、微彈轟擊法、生物炸彈法,一、基因槍轉(zhuǎn)化的基本原理,將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細胞或組織。微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上，得到表達，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化,二、基因槍轉(zhuǎn)化的優(yōu)點,無宿主限制：基因槍技術(shù)沒有物種限制，對雙子葉和單子葉植物都可適用，對動物、微生物也同樣適用。 靶受體類型廣泛：幾乎所有具有潛在分生能力的組織或細胞都可以用作基因槍轉(zhuǎn)化的受體。 操作簡便快速，

17、轉(zhuǎn)化周期短,轉(zhuǎn)化頻率低 嵌合體較多 結(jié)果的重復性差 轉(zhuǎn)化的外源基因以多拷貝居多易導致基因沉默 遺傳穩(wěn)定性差 實驗成本較高 外源DNA的整合機理等理論問題不清楚,三、基因槍轉(zhuǎn)化的缺點,四、基因槍轉(zhuǎn)化的操作方法,小麥的幼胚基因槍轉(zhuǎn)化,1. 無菌材料的獲得和培養(yǎng) 取大田小麥開花后14-18的麥穗，剝出幼嫩種子，用0.1升汞滅菌10min，于超凈工作臺上挑出幼胚，盾片朝上接種于誘導培養(yǎng)基MS2（MS2,4D mg/l ABA0.5 mg/l 水解乳蛋白500 mg/l 蔗糖3%）上，25，暗培養(yǎng)。后將產(chǎn)生的淡黃色新鮮愈傷組織在轉(zhuǎn)化前4-6進行滲透處理，滲透培養(yǎng)基為MS2+0.2 mg/l甘露醇0.2m

18、g/l山梨醇。轟擊材料集中置于培養(yǎng)皿（直徑9cm）中心不大于3的范圍內(nèi)，25，暗培養(yǎng)。,2. 質(zhì)粒及其制備 質(zhì)粒的制備采用堿裂解法，經(jīng)PEG 純化，保存于-20備用。 3. 基因槍轉(zhuǎn)化 基因槍型號:PDS1000HeSystem （美國BioRad公司） 按轟擊參數(shù)進行轉(zhuǎn)化：金粉直徑為1，包裹子彈的沉淀劑用502.5M Ca(NO3)220L40PEG4000，每槍轟擊的金粉用量為0.25gDNA/125g金粉，可裂圓片壓力為1350psi （磅/平方英寸)，轟擊距離為12cm，每皿轟擊一次。,4. 轉(zhuǎn)化體的篩選和再生 轉(zhuǎn)化后的愈傷組織繼續(xù)在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)到原培養(yǎng)基中過渡培養(yǎng)周。用篩

19、選培養(yǎng)基MSJ （MS2,4D 0.5 mg/l 水解乳蛋白500 mg/l 維生素B1 0.5 mg/l KCl 1000mg/l Gln 200mg/l蔗糖3%）篩選2-3次，每14天繼代一次。 篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)入附加/的培養(yǎng)基MSK（MSKT 0.5 mg/l NAA 0.2mg/l 蔗糖3%）中進行分化，每天光照16,23。待分化出的綠芽長至23cm 高時，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基MSI（MSIBA 5 mg/l 5蔗糖）中，附加PPT 10-30 mg/l進行生根和篩選。,四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素,大豆莖尖基因槍轟擊轉(zhuǎn)化率高達2%，但有的報道只有10-4，一般在10-310-2頻率范圍。影響轉(zhuǎn)

20、化率的因素很多： 金屬微粒的影響 DNA沉淀輔助劑的影響 DNA的純度及濃度對轉(zhuǎn)化率的影響 微彈速度的影響(微彈的速度是影響轉(zhuǎn)化率最重要因素)。 植物材料的內(nèi)在因素的影響,第四節(jié) 其他植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),一、電激法 二、PEG轉(zhuǎn)化法 三、花粉管通道法 四、激光微束穿刺法 五、超聲波轉(zhuǎn)化法 六、浸泡法,七、子房注射法 八、低能離子束法 九、顯微注射法 十、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法 十一、病毒載體轉(zhuǎn)化,一、電激法,可用于外源DNA的直接導入 基本原理是利用新鮮分離的原生質(zhì)體在高壓電脈沖作用下在質(zhì)膜上形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA 的攝取。 有兩種不同的處理方式：一種是采用較低的電壓處理較長時間，另一種

21、是采用高壓電處理很短的時間。 優(yōu)點：操作簡便，適用于對農(nóng)桿菌感染不敏感的植物，適于瞬間表達（transient expression）的研究 缺點：易造成原生質(zhì)體的損傷，使植板率降低。,二、PEG介導法,可用于外源DNA（質(zhì)粒）直接導入 將原生質(zhì)體懸浮于含有DNA 的介質(zhì)中，用分子量為40006000 的PEG 在pH89 下促進DNA 的攝取，從而使細胞轉(zhuǎn)化。 很多因素都會影響PEG 誘導的轉(zhuǎn)化，如加入DNA 和PEG 的次序，攜帶DNA（carrier DNA），加入的PEG 的濃度等，原生質(zhì)體所處的時期等 利用PEG法已使多種重要的禾谷類作物，如水稻、高粱、小麥的原生質(zhì)體獲得了基因植物。

22、,主要步驟： 胚性懸浮細胞系的建立 原生質(zhì)體游離及純化 PEG的轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體培養(yǎng),三、花粉管通道法,將外源DNA沿著花粉管經(jīng)過珠心進入尚未形成正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移，實質(zhì)是受精過程轉(zhuǎn)化 目前已應用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉(zhuǎn)基因研究。 方法存在爭議 可用于外源DNA直接導入,主要步驟（大豆轉(zhuǎn)化）： 導入的時間：盛花期，下午2點之后 花蕾大小的選擇：花冠高于花萼0.5-1mm的花蕾 導入方法：切部分柱頭 不切柱頭,花粉管通道法的優(yōu)缺點,優(yōu)點 不依賴于植物組織培養(yǎng)和誘導再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程 花粉管通道是天然存在的，理論上講，該方法可用于

23、任何開花植物，從而極大地擴展了受體植物種和品種的范圍。 方法簡便，適合大規(guī)模的遺傳轉(zhuǎn)化,缺點 進行外源基因轉(zhuǎn)化的時間受受體作物自然花期的限制，同時必須充分了解每一種植物的開花受精生物學特性及其時間進程。 在田間進行操作，受環(huán)境條件的影響較大。 操作的經(jīng)驗性很強，需要一定的技術(shù)摸索和技巧 對單籽粒的小花農(nóng)作物，操作難度大。,四、激光微束穿刺法,外源DNA的直接導入 子葉細胞在高滲液中浸泡一定時間后，細胞內(nèi)外會形成一個滲透壓梯度，內(nèi)高外低，用激光微束進行細胞膜穿孔，外源DNA便通過直徑23 的穿刺孔順著滲透壓梯度進入細胞內(nèi)，在很短時間內(nèi)，細胞穿孔自然閉合，而進入細胞內(nèi)的外源DNA便隨機整合到植物組

24、DNA上。 這種方法適合于多種植物及其不同的幼嫩器官、懸浮細胞和愈傷組織等，尤其對單子葉植物的外源基因?qū)胧钟杏谩?操作簡便，對細胞的損傷小，可準確定位于被照射的細胞，實驗重復性好,五、超聲波轉(zhuǎn)化方法,可用于外源DNA的直接導入 轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體、植物懸浮細胞、植物組織塊、小麥幼胚等 轉(zhuǎn)化過程比較簡單，將待轉(zhuǎn)化的無菌生物體與質(zhì)粒DNA加入到有超聲波緩沖液的容器中(如一小離心管)，迅速混勻后將超聲波發(fā)生器變幅桿末端插入液面下，采用不同的聲頻、聲強及時間進行處理。超聲波可采用連續(xù)和脈沖兩種方式。處理后的生物細胞轉(zhuǎn)到新鮮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可長出轉(zhuǎn)化了的生物體。超聲波發(fā)生器可采用普通的超聲波勻漿器。

25、 超聲波被用來輔助提高農(nóng)桿菌對植物的轉(zhuǎn)化效率,六、浸泡法,外源DNA（質(zhì)?；駾NA片段）直接導入 DNA浸種、DNA 浸苗、DNA 浸胚、DNA 浸芽 簡單、快速、方便 水稻、苧麻、小麥中有報道,七、子房注射法,子房注射法是一種外源 DNA直接轉(zhuǎn)移技術(shù)，實際上是在分子水平上進行遠緣雜交，可以直接將外源 DNA 導入受體。 子房注射法較為簡便，而且進行外源 DNA 導入的時間比采用花粉管通道的方法較為寬松。 在水稻、棉花、西瓜、黃瓜等多種作物上有成功報道。,八、低能離子束法,原理： 一定能量和劑量的離子束對植物細胞壁的濺射作用破壞細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)，結(jié)果在局部產(chǎn)生刻蝕和穿孔，為外源遺傳物質(zhì)進入

26、細胞提供微通道； 用于注入的荷電正離子降低了細胞表面的負電性，減弱了對帶負電的外源 DNA 的靜電斥力，從而促進了外源 DNA 的吸附和進入； 離子束的直接和間接作用打斷了細胞內(nèi)的染色體 DNA 結(jié)構(gòu)，有利于將外源遺傳物質(zhì)整合到受體基因組中。,九、顯微注射法,先把原生質(zhì)或培養(yǎng)的細胞固定在瓊脂、低熔點的瓊脂糖中，或用聚賴氨酸處理附著在玻璃平板上，也可通過一固著的毛細管將原生質(zhì)體吸著在管口， 通過一極細的毛細管將一定量的DNA 注入細胞內(nèi)，甚至直接注入核內(nèi)。 此法已在煙草、油菜、苜蓿等植物的原生質(zhì)體上獲得成功。 微注射法的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化效率高，在用線形DNA 的一些試驗中，轉(zhuǎn)化效率甚至高達60以上，無需特殊的選擇系統(tǒng),十、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法,脂質(zhì)體法就是將包含外源基因的帶負電荷的脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體融合，從而達到轉(zhuǎn)基因的目的。 個步驟： 原生質(zhì)體分離和純化、 脂質(zhì)體的制備、 原生質(zhì)體與脂質(zhì)體的融