堿性磷酸酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

1、堿性磷酸酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究董靜 201131301031摘 要：以豬肝為原料，采用低濃度醋酸鈉(低滲破膜作用)制備肝勻漿，醋酸鎂則有保護(hù)和穩(wěn)定AKP 的作用，勻漿中加入正丁醇可使部分雜蛋白變性，釋出膜中酶，過濾后，以去除雜蛋白。含有AKP 的濾液用冷丙酮和冷乙酸進(jìn)行重復(fù)分離純化。根據(jù)AKP 在33的丙酮或30的乙醇中溶解，而在50的丙酮或60的乙酸中不溶解的性質(zhì)，用冷丙酮和冷乙醇重復(fù)分離提取，可從含有AKP 的濾液中獲得較為純凈的堿性磷酸酶。酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶催化對磷酸苯二鈉水解反應(yīng)的最適PH值為10.0，最適溫度為37,米氏常數(shù)值Km為3.154mmol/L，酶的熱穩(wěn)定性研究表明該

2、酶在pH在8-9區(qū)間和溫度在25-37區(qū)間下穩(wěn)定。關(guān)鍵字：堿性磷酸酶 分離純化 熱穩(wěn)定性 酸堿穩(wěn)定性堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3131，簡稱AKP)廣泛存在于微生物界和動物界，它在動物機(jī)體的骨化過程中及在磷化物和其他一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用。此外，通過催化磷蛋白的水解，堿性磷酸酶在細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中也具有一定的作用。它可專一性的水解磷酸單酯化合物而釋放無機(jī)磷，主要用于核酸研究，分析、測定核苷酸順序及其基團(tuán)的重組、分離，也是酶標(biāo)免疫測定技術(shù)的常用工具酶之一。藥用化妝品中添加堿性磷酸酶有益于皮膚細(xì)胞的再生和新陳代謝，還可用于核苷酸脫磷產(chǎn)生核苷等。它

3、是一種膜結(jié)合蛋白，在生物體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝等生理過程1。臨床上通過測定AKP的活力，可作為診斷骨骼及肝臟疾病的重要生化指標(biāo)。因此純化和研究AKP的性質(zhì)、調(diào)控等有重要意義。本實驗嘗試以豬肝為材料，分離純化豬肝堿性磷酸酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)，旨在探討以豬肝研制科研用堿性磷酸酶生化試劑的方法，同時也為進(jìn)一步的深入研究該酶提供理論上的參考。此外，豬肝來源廣泛，價格便宜，可以作為生產(chǎn)堿性磷酸酶生化試劑的原料2-3。研究酶的生物學(xué)特性，其之一是它對酸堿度的敏感性， pH對酶活性的影響極為顯著，通常各種酶只有在一定的范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的pH條件下所表現(xiàn)的活性不同，其表現(xiàn)活性最高時的

4、pH值稱為酶的最適pH。pH不僅對酶活性有很大影響，而且對酶的穩(wěn)定性也有很大的影響，而且對酶的穩(wěn)定性也有很大的影響。因為該酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，同蛋白質(zhì)容易變性一樣，酶在過酸或過堿的條件下也很容易變性失活。各種酶的酸堿度穩(wěn)定范圍是不同的，這就需要制作酸堿穩(wěn)定性曲線4。對溫度的敏感性是酶的又一個重要特性。酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值時的溫度稱為酶的最適溫度。如果保持其它反應(yīng)條件恒定，而在一系列變化的溫度條件下測定酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，可得到一條溫度酶活性曲線。酶的種類和來源不同，對熱的穩(wěn)定性也不同，這就需要通過熱穩(wěn)定性試驗測出熱穩(wěn)定范圍。一般的試驗方法是在一定條件下先將酶在不同的溫度

5、下處理一段時間，迅速降溫，然后再在一定溫度條件下測定酶活力。以處理溫度為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)作圖，可得到酶的熱穩(wěn)定性曲線，根據(jù)這條曲線即可求出酶的熱穩(wěn)定性范圍5。抑制劑是引起酶促反應(yīng)速度降低的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱。它與酶的活性部位結(jié)合，改變了酶活性部位的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)，從而引起酶活力下降，這里不包括酶蛋白的水解或變性等情況。在可逆抑制類型中，根據(jù)抑制劑、底物和酶三者的相互關(guān)系，又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種。在競爭性抑制中，酶不能同時和底物、抑制劑結(jié)合，即不能形成EIS，其動力學(xué)特征是：米氏常數(shù)的表觀值Km增加，酶的最大反應(yīng)速度Vm不變。在非競爭性抑制中，抑制劑、底物都能同時和

6、酶結(jié)合形成EIS，但是EIS不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其動力學(xué)特征是：Vm降低而Km不變。在反競爭性抑制中，抑制劑必須在酶和底物結(jié)合以后才能和酶結(jié)合形成EIS，即Ki=，其動力學(xué)特征是：Km和Vm都發(fā)生了變化6。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 原料菜市場購買的新鮮豬肝，由本實驗室保存。1.1.2 主要儀器 移液管；量筒；玻璃勺漿器(管)；剪刀；離心機(jī)（湘儀CenceH2050R）為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公產(chǎn)品；新華定性濾紙；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋為金壇市金城國勝實驗儀器產(chǎn)品；721型分光光度計（UNIC7200SPECTROPHOTOMETER）為國產(chǎn)分光光度計。1.1.3 試劑0.5mol

7、/L醋酸鎂溶液：107.25g醋酸鎂溶于蒸餾水中，定容至1000ml;0.1mol/L酸鈉溶液:8.2g醋酸鈉溶于蒸餾水中，定容至1000ml;0.01mol/L醋酸鎂-0.0lmol/L醋酸鈉溶液:準(zhǔn)確吸取20ml0.5mol/L醋酸鎂溶100ml0.14mol/L醋酸鈉溶液，混合后定容至1000ml；tris-hcl ph8.8緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，即為0.1mol/LTris溶液.取100ml10.1mol/LTris溶液，加蒸餾水約780mL，再加0.1mol/L醋酸鎂溶液100ml，混勻后用1%冰醋酸調(diào)ph為8.8，用蒸餾水定容至1

8、000ml；正丁醇、丙酮、95%乙醇；0.04mol/l作用物液：稱取10.16g磷酸苯二鈉，用煮沸后冷卻的蒸餾水溶解，并稀釋至1000ml，加4ml氯仿防腐，貯于棕色瓶子內(nèi)，置冰箱內(nèi)保存；0.1mol/l碳酸鹽緩沖液（ph10.0）：稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g溶解于蒸餾水中，并稀釋至1000ml；堿性磷酸酶液：取純化的堿性磷酸酶5mg，用ph10緩沖液配制成100ml，放置冰箱內(nèi)保存;0.5mol/lNaOH溶液;100.3%4-氨基安替比林:稱取3g4-氨替比林及碳酸氫鈉42g，用蒸餾水溶解，并稀釋至1000ml，貯于棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存； 0.5%鐵氰化鉀：稱取10g

9、鐵氰化鉀及30g硼酸各溶于800ml蒸餾水中，溶解后兩液混合加水至2000ml。置棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存；基質(zhì)液：稱取磷酸苯二鈉2H2O6g,4-氨基安替比林3g，分別溶于煮沸冷卻后的蒸餾水中，兩液混合并稀釋至1000ml，加4ml氯仿防腐，于棕色瓶內(nèi)，用時與等量的水混合即可;各ph值相應(yīng)緩沖液，0.5mol/LKH2PO4：稱取KH2PO46.80g，加水溶解并定容至100ml；0.04M磷酸氫二鈉：稱取磷酸氫二鈉14.3g，溶解于0.1MpH10的碳酸緩沖液中，并用此液稀釋至1000ml。1.2 方法1.2.1 提取方法分離純化堿性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4進(jìn)行）取新鮮豬肝1

10、0g剪碎（0-4）加0.01mol/L醋酸鎂-0.0lmol/L醋酸鈉60ml，在電動勻漿上勻漿。 肝勻漿體積32.5ml加10ml正丁醇，攪拌3-5分鐘后，四層紗布過濾后，離心30min，2500r/min加23.5ml冷丙酮（-10）混勻，冰凍離心2500轉(zhuǎn)5分鐘加0.5moL/l醋酸鎂20ml，量體積為29ml 濾液23,5ml 上清液（棄去） 沉淀 加96%乙醇12,95ml離心3000轉(zhuǎn)5分鐘 懸液 沉淀（棄去） 上清液33.5ml加96%乙醇27.9ml，離心2500轉(zhuǎn)5分鐘上清液（棄去） 沉淀0.01mol/L醋酸鎂-0.0lmol/L醋酸鈉20ml溶解，加96%乙醇9.75ml

11、，離心2500轉(zhuǎn)5分鐘沉淀（棄去）加96%乙醇24.5ml，離心2500轉(zhuǎn)5分鐘 上清液29.5ml上清液（棄去）加0.5mol/L磷酸鎂15ml溶解，總體積17.5ml，加99.5%丙酮16.4ml，離心2500轉(zhuǎn)5分鐘 沉淀沉淀（棄去）加丙酮7.65ml至50%，離心4000轉(zhuǎn)10分鐘 上清液上清液（棄去） 沉淀：加pH8.8Tris緩沖液10ml，分裝保存，1ml1管，在-20下保存10管。1.2.2 Km值測定方法 取大試管7支，按表1分別加入相應(yīng)試劑，加入酶液，混勻之后立即計時，各管在37水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘后，立即加入0.5molNaOH液1.0ml以終止反應(yīng)；各管中加入0.3%

12、4-氨基安替比林1.0ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，放置10分鐘，以0管為對照，在波長510nm下比色，記錄各管的吸光度；作圖：所測各管的吸光度代表各管中反應(yīng)速度v，以之為縱軸，以作用物濃度S為橫軸，在坐標(biāo)紙上連接各點作圖，以觀察曲線的形狀。以各管吸光度值的倒數(shù)為縱坐標(biāo)軸，以作用物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，作圖并求出此酶的Km值。表1 Km值測定曲線制作試劑管號（ml）123456700.04mol/L作用物液0.150.200.250.300.400.600.800pH10磷酸緩沖液0.900.900.900.900.900.900.900.90蒸餾水0.850.800.750.70

13、0.600.400.200混勻37預(yù)熱5分鐘酶液0.10.10.10.10.10.10.10.11.2.3 最適pH及酸堿穩(wěn)定性實驗pH活性曲線的制作 取6支試管，按表2操作，以反應(yīng)pH值為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)繪制pH活性曲線，求出堿性磷酸酶在本實驗條件下的最適pH值。表2 pH活性曲線制作管號123450反應(yīng)pH8910111210相應(yīng)pH緩沖液各加0.5ml酶液各加0.1ml（0號管酶液在鐵氰化鉀之后加）/37預(yù)熱5分鐘預(yù)熱的基質(zhì)液各加3.0ml37精確保溫15min后各加1,0ml堿性溶液終止反應(yīng)0.5%鐵氰化鉀各加2.0mlA510酸堿穩(wěn)定范圍的測定 取6支試管，按表3操作，以pH

14、為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制酸堿穩(wěn)定曲線，并分析堿性磷酸酶的酸堿穩(wěn)定范圍。表3 酸堿穩(wěn)定范圍曲線的制作管號123450處理pH8910111210相應(yīng)pH緩沖液各加0.1ml酶液各加0.1ml37保溫處理1h0.1MPH10碳酸鹽緩沖液各加0.5ml預(yù)熱的基質(zhì)液各加3.0ml（0號管基質(zhì)液在鐵氰化鉀之后加）0.5%鐵氰化鉀各加0.2mlA5101.2.4 最適溫度及熱穩(wěn)定性實驗溫度活性曲線的制作 取4支試管，按表4操作，以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制溫度活性曲線圖，求出堿性磷酸酶在本實驗條件下的最適溫度。表4 溫度活性曲線制作管號1230反應(yīng)溫度（）25378037稀釋酶液各加

15、0.1ml（0號管在鐵氰化鉀之后加）預(yù)熱復(fù)合基質(zhì)液各加3.0ml分別在不同溫度下精確反應(yīng)15min，各加1.0ml堿性溶液終止反應(yīng)各加0.5%鐵氰化鉀2.0ml，靜置10minA510熱穩(wěn)定性測定 取4支試管，按表5操作，在上述相應(yīng)溫度的恒溫水浴鍋內(nèi)放置相應(yīng)時間后取出，立即以流動水冷卻并置于37恒溫水浴鍋中預(yù)熱2分鐘，以處理溫度為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制處理時間為15min的熱穩(wěn)定曲線，并分析在本實驗條件下堿性磷酸酶的熱穩(wěn)定范圍。表5 熱穩(wěn)定范圍曲線制作管號1230熱處理溫度（）25378025熱處理時間（分）各15酶液（ml）各加0.1ml（0號管在鐵氰化鉀之后加）37預(yù)熱的復(fù)合基質(zhì)各

16、加3.0ml37精確反應(yīng)15min后各加1,0ml堿性溶液終止反應(yīng)0.5%鐵氰化鉀各加0.2mlA5101.2.5 抑制劑類型鑒別 取5支試管，按表6操作，以反應(yīng)速度倒數(shù)1/V或1/ A510為縱坐標(biāo)，以底物濃度倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，作圖，觀察直線在縱軸和橫軸上的交點位置并計算其K值，與未加抑制時的Km值比較。說明該抑制劑屬于何種類型。表6 抑制劑類型曲線制作管號1234040mmol./L底物濃度0.100.150.200.300碳酸鹽緩沖液0.90.90.90.90.9蒸餾水0.800.750.700.600.900.25MKH2PO40.10.10.10.10.1混勻，37預(yù)熱5min酶液

17、0.10.10.10.10.1最終底物濃度（mmol/L）0.10.10.10.10.1按順序各加1.0ml堿性溶液，1ml4-氨基安替比林，2ml鐵氰化鉀A5102. 結(jié)果與分析2.1 Km值的測定表7 Km值測定實驗各管光吸收值管號123456700.04mol/L作用物液0.150.200.250.300.400.600.800光吸收值0.4120.4590.5350.5450.4440.4590.7010圖1 Km測定圖由圖1可知，Km值測定曲線y=3.747 x+1.188,計算出Km值等于3.154mmol/L2.2 最適pH及酸堿穩(wěn)定性實驗2.2.1 pH-活性曲線測定表8 pH

18、活性曲線制作管號123450反應(yīng)pH8910111210A5100.0070.0110.0380.03600圖2 pH-活性曲線由上述數(shù)據(jù)和圖2可知，堿性磷酸酶在本實驗條件下的的最適pH值為102.2.2 酸堿穩(wěn)定范圍的測定表9 酸堿穩(wěn)定范圍曲線的制作管號123450處理pH8910111210A5100.1670.1710.1310.01900圖3酸堿穩(wěn)定范圍曲線由上述數(shù)據(jù)和圖3可知，堿性磷酸酶在本實驗條件下的酸堿穩(wěn)定范圍為pH值8-9，在pH值為9時最為穩(wěn)定。在高PH下酶的活力受到很大的影響，曲線呈下降趨勢。2.3 最適溫度及熱穩(wěn)定性實驗2.3.1 溫度活性曲線表10 溫度活性曲線制作管號

19、1230反應(yīng)溫度25378037A5100.1710.2120.0340圖4 溫度-活性曲線由上述數(shù)據(jù)與圖4可知，堿性磷酸酶在本實驗條件下的最適溫度為37，溫度為80高溫時，酶部分失活，曲線下降。2.3.2 熱穩(wěn)定性測定表11 熱穩(wěn)定范圍曲線制作管號1230熱處理溫度25378025A5100.2140.20300圖5 熱穩(wěn)定范圍曲線由上述表中數(shù)據(jù)與圖5可知，堿性磷酸酶在本實驗條件下的熱穩(wěn)定范圍為25-37之間，在37時最為穩(wěn)定，酶活最高，在高溫情況下酶不穩(wěn)定，部分失活，曲線快速下降。2.4 抑制劑類型鑒別表12抑制劑類型曲線制作管號123450最終底物濃度2468160A5100.2530.

20、2870.4030.4940.3960圖6 抑制劑類型曲線由圖6可知，抑制劑Km值測定曲線y=4.111x+1.985，計算Km值等,2.071mmol/L，與未加抑制劑時的Km值相比較，表明該抑制劑屬于反競爭性抑制。3. 結(jié)論與討論3.1 結(jié)論通過本實驗，可知堿性磷酸酶在本次的實驗條件下Km值為3.154，最適pH值為10，在本實驗條件下的酸堿穩(wěn)定范圍為pH值8-9，在pH值為9時最為穩(wěn)定。在高PH下酶的活力受到很大的影響。在本實驗條件下堿性磷酸酶的最適溫度為37，溫度為80高溫時，酶失活，酶活下降直至0，堿性磷酸酶在本實驗條件下的熱穩(wěn)定范圍為25-37之間，在37時最為穩(wěn)定，酶活最高，在低于最適溫度時，酶活很低，隨溫度的升高酶活隨之上升，直到最適溫度達(dá)到最大，在高溫情況下酶不穩(wěn)定，部分失活，曲線快速下降。此次實驗采用的抑制劑類型屬于反競爭性抑制。3.2 討論 此次試驗過程中，我們嚴(yán)格按照實驗室原則與規(guī)范的實驗步驟進(jìn)行操作，純化后的堿性磷酸酶濃度很高，在后面測定酶學(xué)性質(zhì)過程沒有稀釋到合適的濃度，導(dǎo)致第一次測出來的吸光度較大，不能很好地處理數(shù)據(jù)，但是經(jīng)過有效地稀釋跟重復(fù)試驗后得到了期望的結(jié)果，盡管實驗過程中注意實驗條件的控制，但是仍然有不準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)出現(xiàn)，出現(xiàn)了誤差，導(dǎo)致做出來的圖線性關(guān)系不是較好，在之