細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

1、細 胞 培 養(yǎng) Cell Culture,第四章 細胞培養(yǎng)的基本技術(shù),4.1 基本操作技術(shù)和要求,培養(yǎng)前準(zhǔn)備 制訂試驗計劃和操作程序 準(zhǔn)備各種器材物品 培養(yǎng)室和超凈臺的消毒 0.2%新潔爾滅托洗地面 紫外燈照射30-60分鐘 以75%乙醇擦拭無菌操作臺面,培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作,洗手和著裝 徹底洗手 以75%乙醇消毒手和前臂 可穿經(jīng)紫外線照射30min的一般清潔工作服。 無菌培養(yǎng)操作 一切操作都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進行。 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上

2、放置桌面,培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作,無菌操作中常犯的錯誤,吸管、剪刀等碰到其他器皿,無菌操作中常犯的錯誤,正確的拿管姿勢,錯誤的拿管姿勢,拿吸管時手碰到無菌區(qū),無菌操作中常犯的錯誤,培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花,4.2 原代培養(yǎng),將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài),細 胞 和 組 織 培 養(yǎng),計 數(shù) 細 胞,細胞數(shù)/m

3、l=計數(shù)16格稀釋倍數(shù) 104,原理： （1）計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。 （2）血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm20.1mm=1.0 x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。 （3）存活測試之步驟為dye exclusion（染料排除），利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色

4、。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料；因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準(zhǔn)確,兩 個 概 念,原代培養(yǎng) 直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。 傳代培養(yǎng) 細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次

5、稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去,培養(yǎng)細胞的取材,理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng),組 織 塊 培 養(yǎng) 法,新鮮取材的組織中 細胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內(nèi)的環(huán)境中，小塊組織的細胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長。 組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng),58,培 養(yǎng) 要 點,材料新鮮 嚴(yán)格無菌操作 剔除脂肪等附著組織

6、 組織塊剪小（直徑1mm） 擺放開（間距5mm,常 犯 的 錯 誤,操作中不換器械 沖洗次數(shù)不夠 組織碎片太大 組織塊擺放太密 培養(yǎng)液加入太多,消 化 培 養(yǎng) 法,消化培養(yǎng)法所用的酶有多種，目前應(yīng)用最廣的是胰蛋白酶。它是一種內(nèi)切酶，可專一水解有精胺酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵。從而消除妨礙細胞生長的細胞間質(zhì)，包括基質(zhì)、纖維等，使細胞分散，易于貼壁并從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝物 消化法適用于組織量大的原代培養(yǎng)。胰蛋白酶液適用于消化間質(zhì)少的組織，如羊膜、胚胎、上皮、肝和腎等組織及傳代細胞,59,55,切成1-2mm3小塊,20-60min,培 養(yǎng) 要 點,36合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%） 合

7、適的消化時間：消化時，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止（通常為37，20-40分鐘,常 犯 的 錯 誤,水浴鍋未預(yù)熱,組織塊太大,胰蛋白酶消化不足或過度,吹打用力過重,常 犯 的 錯 誤,4.3 傳代培養(yǎng)和細胞系的維持,傳 代 細 胞 培 養(yǎng),細胞在原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細胞株，或大量的同種細胞，當(dāng)培養(yǎng)細胞形成致密的單層后需進行傳代培養(yǎng),63,首次傳代注意事項,細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于傳代。 傳代時不同的細胞有不同的消化時間，因而要根據(jù)需要注意觀察及時處理。 首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利

8、于細胞生存和增殖,63,細 胞 傳 代 方 法,根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有3種 懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l/22/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代 半懸浮生長細胞傳代 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代 貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液,64,貼壁生長細胞傳代方法,吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 PBS洗一次 加入12 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)） 靜置210

9、min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測） 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液 吸取1/101/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi) 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi) 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),Trypsin消化細胞,未消化細胞,細胞消化過程,培 養(yǎng) 要 點,嚴(yán)格的無菌操作 適度消化,細胞培養(yǎng)中需要注意的問題,培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細胞生長，不能盲目增加每單位體積的細胞濃度 PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0 培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10,細胞培養(yǎng)中需要注意的問題,容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.20.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的,在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。 去除死細胞 溫度控制：動物細胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5，細胞生長緩慢；溫度高于37.5，細胞存活力降低,細胞系的維持,細胞系檔案要記錄好； 細胞系的傳代、換液一般都有自身的規(guī)律性，在維持傳代時要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性； 多種細胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，以防細胞之間交叉污染； 每一種細胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備,65,培養(yǎng)細胞的純化,自然純化 人工純化,酶消化法 機械刮除法