酵母雙雜實驗步驟

1、.2.1.1 酵母雙雜交2.1.1.1 Gateway入門克隆設計Gateway引物時，在上游引物的5端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5-GGGG序列是保護堿基，防止引物的重要部分被降解，下劃線加粗的部分是在整個的Gateway克隆中可以保存下來的序列，3端的堿基N是為了保證經(jīng)過入門載體構(gòu)建目的載體時閱讀框的正確性，一般建議為C。通過PCR擴增獲得帶有attB位點的基因片段，擴增體系和條件見3.2.2.2，其

2、中將退火溫度改為65。獲得擴增產(chǎn)物后對其進行回收純化，測定純化后DNA的質(zhì)量和濃度后進行下一步的BP反應，反應體系如下：attB-PCR產(chǎn)物（10 ng/L）1-7LpDONR221 (150 ng/L)1LTE buffer, pH 8.0補足8L將上述混合物加入離心管中，加入2L BP反應酶，加入之前需將其在渦旋儀上輕輕振蕩兩次，所有組分混勻離心后，25反應1h，加入1L蛋白酶K后，混勻離心，37反應10min終止BP反應，將BP反應產(chǎn)物參照3.2.2.6進行轉(zhuǎn)化，由于pDONR221載體為Kan抗性，所以選用含有50g/mL Kan抗生素的LB平板進行陽性克隆篩選，參照3.2.2.7檢測

3、陽性克隆，然后根據(jù)3.2.2.8中的方法提取重組質(zhì)粒，測定質(zhì)量和濃度后送至測序公司進行測序。進行BP反應時，需注意以下幾項：(1) 對于BP反應來說，最高效的是采用線性的attB-PCR產(chǎn)物和超螺旋的attP入門載體；(2) 為了提高BP反應的效率，可以將建議的25反應1h適當延長至4-6h，可以將效率提高2-3倍，或者延長至過夜反應，可以將效率提高5-10倍，對于長片段克隆來講，適當?shù)难娱L反應時間是非常必要的；(3) 提高體系中PCR產(chǎn)物的量可以增加反應效率，但每10L體系中PCR產(chǎn)物最好不要超過250ng。2.1.1.2 誘餌載體構(gòu)建重組的入門載體測序正確后，通過LR反應來構(gòu)建酵母雙雜交的

4、誘餌載體，LR反應體系如下：入門載體 (50-150 ng)1-7LpDEST32 (150 ng/L)1LTE buffer, pH 8.0補足8L將上述混合物加入離心管中，加入2L LR反應酶，加入之前需將其在渦旋儀上輕輕振蕩兩次，所有組分混勻離心后，25反應1h，加入1L蛋白酶K后，混勻離心，37反應10min終止BP反應，將LR反應產(chǎn)物參照3.2.2.6進行轉(zhuǎn)化，由于pDEST32載體為Gen抗性，所以選用含有50g/mL Gen抗生素的LB平板進行陽性克隆篩選，參照3.2.2.7檢測陽性克隆，然后根據(jù)3.2.2.8中的方法提取重組質(zhì)粒，測定質(zhì)量和濃度。LR反應注意事項：對于LR反應來

5、說，最高效的是超螺旋的入門載體和目的載體進行反應，但對于超過10kb的載體，將載體線性化可能反而會提高反應的效率；為了提高LR反應效率，可以適當延長反應時間，這對于大于10kb的質(zhì)粒非常有必要。2.1.1.3 轉(zhuǎn)化酵母細胞轉(zhuǎn)化前需小量制備MaV203酵母感受態(tài)細胞，步驟如下：(1) 將保存的MaV203菌株在YPAD平板上劃線，30培養(yǎng)2天；(2) 挑取酵母菌單克隆至10mL YPAD液體培養(yǎng)基中，30，230rpm過夜培養(yǎng)；(3) 將過夜的酵母培養(yǎng)液在50mL的YPAD液體培養(yǎng)基中稀釋至OD600為0.4左右，30，230rpm繼續(xù)培養(yǎng)2-4h；(4) 室溫下2500rpm離心5min收集菌

6、體，棄上清，加入40mL 1TE（pH7.5）重懸；(5) 室溫下2500rpm離心5min收集菌體，棄上清，加入2mL1LiAc/0.5TE重懸；(6) 室溫靜置孵育10min；(7) 立即用于下游的酵母小量轉(zhuǎn)化實驗。酵母感受態(tài)細胞制備完成后，按照表3-2中的組合進行轉(zhuǎn)化，通過以下步驟將組合載體轉(zhuǎn)入酵母細胞中：(1) 向每個1.5mL離心管中加入1g質(zhì)粒、100g變性鮭魚精DNA以及100L酵母感受態(tài)細胞；(2) 加入700L的1LiAc/40% PEG-3350/1TE并上下顛倒混勻，30孵育30min；(3) 加入88L的DMSO，混勻，然后42熱擊7min；(4) 在微量離心機中瞬時離

7、心10s，棄去上清；(5) 加入1mL1TE重懸菌體后瞬時離心，棄上清；(6) 加入50-100L1TE重懸菌體，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30培養(yǎng)2天。表3-2 酵母轉(zhuǎn)化組合Table3-2 Sets of plasmids used in yeast transformation assayLEU2 PlasmidTRP1 PlasmidPurpose1nonenoneNegative transformation control2pEXP32/Krev1pEXP22/RalGDS-wtStrong positive interaction control3pEXP32/Krev

8、1pEXP22/RalGDS-m1Weak positive interaction control4pEXP32/Krev1pEXP22/RalGDS-m2Negative interaction control5pDEST32pDEST22Negative self-activation control6Bait plasmidpDEST22Test of self-activation2.1.1.4 自激活檢測轉(zhuǎn)化完成后，可以進行誘餌載體的自激活檢測，同時確定文庫篩選時的3AT濃度，具體步驟如下：(1) 從SC-Leu-Trp平板上挑取4個包含重組誘餌載體和pDEST22載體的單克隆，在

9、一個新的SC-Leu-Trp分別劃線，同時，分別挑取表3-2中組合1到5的2個單克隆作為對照，30培養(yǎng)18h；(2) 將SC-Leu-Trp作為樣板影印至包含不同3AT濃度（0 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 和100 mM）的SC-Leu-Trp-His平板上，迅速進行影印清潔2-3次，30培養(yǎng)24h；(3) 24h后，再次進行影印清潔2-3次，然后繼續(xù)放于30培養(yǎng)約2天（40-44h）后，進行觀察，可以抑制包含重組誘餌載體和空獵物載體的酵母細胞生長的最低3AT濃度即為篩庫時所用的3AT濃度，如果這個濃度為100mM，則表明誘餌載體本身存在自激活作用，篩庫不能

10、進行，若低于100mM，則篩庫可以進行。2.1.1.5 文庫篩選進行文庫篩選之前，需將重組誘餌載體按照3.2.4.3中的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入MaV203中，在SC-Leu平板上篩選陽性克隆。然后進行文庫篩選級別的酵母感受態(tài)細胞制備，制備過程如下：(1) 接種含有誘餌載體的酵母菌于20 mL SC-Leu培養(yǎng)基中，30過夜培養(yǎng)；(2) 翌日早上，將培養(yǎng)液加入300 mL SC-Leu液體培養(yǎng)基中至濃度為2106 cells/mL (OD600 =0.10)，30繼續(xù)培養(yǎng)直至培養(yǎng)液濃度達到2107 cells/mL (OD600 =0.50)；(3) 室溫1000-1500g離心5分鐘收集菌體，30 mL

11、無菌水重懸后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中；(4) 1000-1500g 室溫離心5分鐘，棄上清，加入1.5 mL 1TE/1LiAc重懸；(5) 立即將感受態(tài)細胞用于轉(zhuǎn)化。將文庫轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細胞的步驟如下：(1) 加1 g文庫DNA和50 g高質(zhì)量鮭魚精DNA至每個1.5 mL離心管中，共加30個管，每個管里加入50 L重懸的酵母感受態(tài)細胞。注意：文庫DNA和鮭魚精DNA的總體積不能超過20 L，最好不超過10 L；(2) 加300 L除菌的40% PEG-3350/1LiAc/1TE 至每個離心管中，翻轉(zhuǎn)離心管充分混合，30孵育30min；(3) 加DMSO到10% (40 L每管)，然后翻

12、轉(zhuǎn)混勻，42熱擊10min；(4) 從一個轉(zhuǎn)化管中取出100 L轉(zhuǎn)化液，用滅菌生理鹽水按照1:100和1:1000進行稀釋，每個稀釋倍數(shù)涂100 L至10-cm的SC-Leu-Trp板子上；(5) 將30個管中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂到30個15-cm含有合適的3AT的SC-Leu-Trp-His平板上，30培養(yǎng)3天；(6) 計算10-cm SC-Leu-Trp板子上的克隆數(shù)，最好平板上長有20到300個克隆，通過下面的公式計算轉(zhuǎn)化效率：每個轉(zhuǎn)化反應的克隆數(shù)=單個平板上的克隆數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化總體積/單個平板上涂的菌液體積；(7) 對每個SC-Leu-Trp-His+3AT平板進行影印清潔；(8) 30繼

13、續(xù)培養(yǎng)2-3天后，初步篩選出陽性的His+克隆。2.1.1.6 報告基因檢測將SC-Leu-Trp-His+3AT平板上長出來的His+克隆子以及3.2.4.3中的轉(zhuǎn)化組合2-6重培養(yǎng)的新鮮菌落，用無菌水稀釋到同一濃度（一個直徑1mm菌落加入30L無菌水中，用血球計數(shù)板將所有稀釋液調(diào)整至同一濃度）。檢測HIS3基因和URA3基因表達情況時，將每個菌落稀釋液吸取3L點至SC-Leu-Trp-His+3AT，SC-Leu-Trp-Ura以及SC-Leu-Trp+5FOA（0.2%）平板上，30培養(yǎng)3-5天。檢測lacZ基因表達情況時，吸取3L每個菌落的稀釋液點至YPAD（覆蓋NC膜）平板上，30培

14、養(yǎng)2天，準備進行X-gal實驗。X-gal實驗的步驟如下：(1) 稱取10mg X-gal溶解在100L DMF中，溶解后加入10mL的Z buffer中，同時加入60L -巰基乙醇，混勻備用；(2) 將兩張直徑125-mm的Whatman541濾紙疊放在直徑15-cm的培養(yǎng)皿中，用約8mL的上述X-gal溶液完全浸潤，并將氣泡移除；(3) 用鑷子將YPAD平板表面的帶有菌落的NC膜輕輕取出，完全浸潤在液氮中20-30s，然后將凍過的NC膜輕輕放在上述準備好的濾紙上面，移除氣泡，然后輕輕將培養(yǎng)皿中多余的液體倒出；(4) 蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，放置于37孵育，孵育時將培養(yǎng)皿傾斜一個很小的角度，從而避免X-gal在濾紙上過多的累積