2020分子診斷學(xué)習(xí)題

1、 分子診斷學(xué)習(xí)題一、名詞解釋1、 基因:是有功能的DNA，合成含有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核苷酸序列是遺傳的結(jié)構(gòu)和功能單位。 2、 假基因:或稱偽基因，是基因家族在進(jìn)化過程中形成的無功能殘留物，在真核生物多基因家族中存在因突變而失活，不能表達(dá)出有活性的產(chǎn)物。3、結(jié)構(gòu)基因:指能編碼蛋白質(zhì)或RNA的基因。 4、基因家族:真核細(xì)胞中許多相關(guān)的基因常按功能成套組合被稱為基因家族。5、 管家基因:是指所有細(xì)胞中均要穩(wěn)定表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的。 6、重疊基因:指兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列或者一段DNA序列成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。7、基因組

2、:細(xì)胞中一套完整單體的遺傳物質(zhì)的總和，指生物體全套遺傳信息，包括所有的基因和基因間區(qū)域。 8、人類基因組計(jì)劃:主要任務(wù)是人類的DNA測序，繪制人類基因組圖譜。9、內(nèi)含子:是指真核生物基因轉(zhuǎn)錄區(qū)位于相鄰?fù)怙@子之間的序列及初級轉(zhuǎn)錄后加工之后保留于成熟DNA中的序列和轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)的對應(yīng)序列，屬于非編碼序列。不能參與基因表達(dá)調(diào)控序列。 10、外顯子:是基因(真核生物)轉(zhuǎn)錄區(qū)的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工之后，保留于成熟DNA中的序列和轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)的對應(yīng)序列，屬于編碼序列。11、基因表達(dá):只將來自基因的遺傳信息合成功能性基因產(chǎn)物的過程。 12、核酸分子雜交:互補(bǔ)的核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DN

3、A或RNA分子的過程。13、核酸探針:能識(shí)別特異堿基序列的帶有標(biāo)記的一段DNA或RNA分子。 14、聚合酶鏈反應(yīng)：是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性，低溫退火，及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)個(gè)周期循環(huán)進(jìn)行，使得DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡便省時(shí)等特點(diǎn)。15、巢式PCR：使用兩隊(duì)對引物，一對引物序列在模板的外側(cè)，用于擴(kuò)增含目的基因的大片段，另一對引物序列在模板內(nèi)側(cè)，用于擴(kuò)增目的基因。第一對引物做PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作為第二對引物退火的模板，再進(jìn)行第二輪PCR，這樣經(jīng)過兩次PCR放大，靈敏度得以提高。 16、熒光定量PCR：通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對

4、PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。17、基因芯片：又稱DNA微陣列或DNA芯片，是將大量的特定寡核苷酸或DNA片段做探針，有規(guī)律、高密度地固定排列在支持物上制成陣點(diǎn)，然后與染料標(biāo)記的待測DNA按照堿基配對原則進(jìn)行雜交，再通過檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，并借助計(jì)算機(jī)對各站點(diǎn)信號(hào)進(jìn)行檢測和比較，從而迅速得出所要的信息。18、引物：是人工合成的一對可以分別與兩條模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸序列，其中一條稱上游（或正鏈）引物，另一條引物稱下游（或負(fù)鏈）引物。19、重復(fù)序列：基因序列的拷貝，真核生物細(xì)胞基因組中重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸序列。 20、

5、CpG島：許多基因尤其是管家基因的啟動(dòng)子區(qū)，基因的末端通常存在一些富含雙核苷酸CG的區(qū)域。21、基因多態(tài)性：指同一群體的某一基因座若存在著幾種相同適合度的等位基因，這個(gè)基因座稱為多態(tài)性的基因座。22、轉(zhuǎn)座子：是存在于染色體DNA上能自主復(fù)制和位移的基本單位。23、DNA甲基化：為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表觀。 24、循環(huán)DNA：是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外的部分降解了的機(jī)體內(nèi)源性DNA。25、DNA測序 ：是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。 26、原位雜交：是指特定標(biāo)記的已知順序核酸為

6、探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交27、Southern-blot雜交：Southern印跡雜交，具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，按堿基互補(bǔ)的原則特異性地雜交成雙鏈 28、Western-blot：免疫印跡通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或者生物組織樣本進(jìn)行著色29、Northern-blot雜交：Northern印跡雜交，將一種RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法 30、蛋白芯片：指大量探針分子固定于支持物上與帶熒光標(biāo)記的DNA等其他樣本分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息31、斷裂基因：在真核生物基因組中，基因是不連續(xù)的

7、，在基因的編碼區(qū)域內(nèi)部含有大量的不編碼序列，從而打斷了對應(yīng)量蛋白質(zhì)的氨基酸序列 32、操縱子：Operon，指啟動(dòng)基因/操縱基因和一系列緊密連鎖的結(jié)構(gòu)基因的總稱33、啟動(dòng)子：是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列、富含RNA聚合酶的特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，多數(shù)位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄 34、增強(qiáng)子：指增加同它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列35、分子標(biāo)志物：患者體內(nèi)發(fā)生具體的基因改變或者正常人體中的個(gè)體特異基因、基因多態(tài)性等 36、雙向凝膠電泳（2-DE）：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（第一向）和分子量（第二向）的不同進(jìn)行分離、電泳后根據(jù)蛋白質(zhì)的上樣量對膠進(jìn)

8、行考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色或者熒光染色，然后用相關(guān)軟件分析37、DNA甲基化： 為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn) 38、癌基因：人類或者其他動(dòng)物細(xì)胞固有的基因，又稱轉(zhuǎn)化基因，激活后可促使正常細(xì)胞癌變、侵襲及轉(zhuǎn)移 二、英譯漢1、biochip：生物芯片又稱蛋白質(zhì)芯片或基因芯片 2、complementary DNA：互補(bǔ)DNA3、annealing：退火 4、hybrization：雜交5、expressed vector：表達(dá)載體 6、multiplex PCR：多重PCR 7、FRET：熒光共振能量轉(zhuǎn)移 8、HGP：人類基因組計(jì)劃9、RFLP：限制性片段

9、長度多態(tài)性10、pyrosequencing：焦磷酸測序11、branched DNA：分支DNA 12、cloning vector：克隆載體13、DNA chip：DNA芯片 14、FISH：熒光原位雜交技術(shù)15、enhancer：增強(qiáng)子 16、nested PCR：巢式PCR17、HIV：人類免疫缺陷病毒 18、SSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性19、SNP：單核苷酸多態(tài)性 20、NASBA：核酸依賴性擴(kuò)增檢測技術(shù)21、Genome：基因組 22、COVID-19：2019冠狀病毒23、SARS-CoV-2：新型冠狀病毒 24、Ct ：循環(huán)次數(shù)25、PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 26、RT-PCR：逆轉(zhuǎn)

10、錄PCR27、miRNA： 微小DNA 28、 lncRNA：長鏈非編碼RNA三、判斷題1、基因組是指生物體的全套遺傳信息，包括所有基因和基因間的區(qū)域。錯(cuò)2、Taq酶具有53 聚合酶活性和依賴于聚合作用的35外切酶活性。3、Southern印跡雜交法是鑒定DNA中某一特定的基因片段；而Norhtern印跡雜交法是以檢測某一特定的RNA片段為目的。4、由于PCR具有強(qiáng)大的擴(kuò)增DNA拷貝數(shù)的能力，極微量的模板污染就可以造成假陽性出現(xiàn)，因此防止污染是PCR實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)重要問題。錯(cuò)5、已知序列測序是從頭測序，而未知序列測序通常只需對部分序列進(jìn)行測序。6、探針在載體表面的固定是制備芯片的重要步驟。7、核

11、酸純度測定中，若DNA樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。錯(cuò)8、瓊脂糖凝膠電泳法的操作方法簡單，能對PCR產(chǎn)物的長度和序列進(jìn)行鑒定，是應(yīng)用最廣泛的檢測PCR產(chǎn)物的方法。9、各種地中海貧血的表型都很相似，但基因?qū)W發(fā)病機(jī)理完全不同，診斷方法也不盡統(tǒng)一。10、尋找腫瘤特異性基因表型標(biāo)志進(jìn)行腫瘤基因診斷，對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，以及腫瘤的預(yù)防和治療具有至關(guān)重要的意義。11、真核生物基因組可分為細(xì)胞核基因組和細(xì)胞器基因組。錯(cuò)12、大腸桿菌DNA聚合酶不具有35核酸外切酶活性。13、菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交，常用于基因克隆的篩選。14、PCR結(jié)果較易受到各種自身

12、和外部因素的影響。所以，應(yīng)該制定一套適應(yīng)當(dāng)前基因診斷實(shí)驗(yàn)的基本要求并使PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序。錯(cuò)15、化學(xué)降解法是目前最通用和有效的測序技術(shù)。16、雜交是DNA芯片技術(shù)中除DNA方陣構(gòu)建外最重要的一步。17、核酸純度測定中，若DNA樣品中含有RNA，則A260/A280比值偏高。18、瓊脂糖凝膠電泳適宜分離小片段(2kb的DNA或RNA)。19、鐮狀細(xì)胞貧血是由于珠蛋白基因中最常見的錯(cuò)義突變引起的疾病之一。20、基因表型標(biāo)志是指基因本身突變和表達(dá)異常，能反映癌前啟動(dòng)階段的變化。三、問答題1. 分別簡述原核生物基因組，真核生物基因組，病毒基因組及人類基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。(1)原核生物基因組單一

13、閉環(huán)雙鏈分子 類核基因組相對較小，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。基因組所含基因數(shù)量，并且較多形成操縱子結(jié)構(gòu)。編碼序列幾乎都是連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄之后不需要剪接。編碼序列約占基因組的50%。非編碼序列主要是一些調(diào)控序列多拷貝基因很少，除了編碼rRNA的基因，編碼蛋白質(zhì)的基因大多只有一個(gè)拷貝?；蚪M中含有可移動(dòng)序列(2)真核生物基因組DNA是線性分子，以染色質(zhì)或染色體存在，末端存在端粒結(jié)構(gòu)，染色體數(shù)量是一定的，體細(xì)胞一般是二倍體。多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一般是單順反子。基因在基因組中散在分布 被大量不含編碼信息的基因間序列間隔開，多種基因家族，串聯(lián)相隔很遠(yuǎn)，分別表達(dá)。多為斷裂基因。大量順式作用元件包括增強(qiáng)子和沉默子。編碼序列不

14、到10%，人類不到2%，不同生物重要區(qū)別，生物進(jìn)化的標(biāo)尺?；蚪M包含大量重復(fù)序列(高等或中等重復(fù)序列）蛋白質(zhì)編碼序列大多屬于單一序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是單順反子mRNA 含有大量可移動(dòng)序列。(3)病毒基因組只有一種核酸，大部分是一條單鏈或雙鏈分子核酸大小差別大，通常是DNA病毒的核酸分子較大，而RNA 病毒的分子較小大部分序列為編碼序列，非編碼序列及基因間隔區(qū)很少具有啟動(dòng)子和操縱子結(jié)構(gòu)噬菌體基因組中沒有內(nèi)含子，感染真核細(xì)胞的病毒基因組中含有內(nèi)含子堿基組成相差較大，存在稀有堿基及重復(fù)基因等。(4)人類基因組GC含量平均41%，存在GC豐富區(qū)和貧乏區(qū)染色體短臂的重組率比長臂高，在染色體末端從重組率高，著絲

15、粒部分的重組率低，女性重組率比男性重組率高的多重復(fù)序列的含量分布不均，包括段散布元件SINE,長散布元件LINE ，長末端重復(fù)序列LTR，衛(wèi)星DNA ，Tn ，長片段型重復(fù)序列基因數(shù)量有2.6萬個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因數(shù)量有數(shù)百個(gè)與疾病相關(guān)的基因。2.何為核酸探針？試述核酸探針種類和優(yōu)缺點(diǎn)(1)核酸探針是一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。(2)DNA 探針：在質(zhì)粒載體可以無限擴(kuò)增，制備方法簡便，穩(wěn)定性好，不易降解，標(biāo)記方法多且方法成熟。cDNA 探針：不含內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，尤其適用于基因表達(dá)的研究。RNA 探針：可降低非特異性雜交重復(fù)性低，反應(yīng)效率高，不穩(wěn)定

16、，標(biāo)記方法復(fù)雜。寡核苷酸探針：特異性好，短時(shí)間內(nèi)可大量制備，雜交效率高，減少堿基間的錯(cuò)配。3.簡述HBV 分子診斷主要方法和臨床意義(1)分子診斷方法：PCR，核酸分子雜交法，支鏈DNA技術(shù)，雜交捕獲法，基因芯片法和核酸測序法等(2)分型方法：FQ-PCR PCR -反向雜交法，PCR-PFLP, DNA測序和基因芯片(3)耐藥基因檢測：FQ-PCR 核酸雜交和基因芯片等(4)臨床意義：HBV 感染的早期診斷 監(jiān)測治療效果 判斷病情，指導(dǎo)制定合理的治療方案 在乙型肝炎病毒檢測中的應(yīng)用4.試述雙脫氧終止法DNA測序的原理利用DNA聚合酶以單鏈或雙鏈DNA為模板。以脫氧核苷三磷酸( dNTP )為

17、底物，其中一種dNTP帶放射性核素標(biāo)記或者是引物末端核素標(biāo)記，在四組相互獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的2,3-雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP) 作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對原則，在測序引物引導(dǎo)下合成四組有序梯度的互補(bǔ)DNA 鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后識(shí)讀待測DNA互補(bǔ)序列5.試述化學(xué)裂解法DNA測序原理。將一個(gè)待測DNA片段5磷酸基做放射性標(biāo)記，標(biāo)記后的DNA分成四組，在分別采用不同的化學(xué)試劑對不同的堿基進(jìn)行特異性的化學(xué)切割，通過控制化學(xué)反應(yīng)條件，使堿基的斷裂只隨機(jī)發(fā)生在某一特定的位點(diǎn)，從而產(chǎn)生一系列長度不一的5端被標(biāo)記的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾

18、的片段群采用高分辨率的變性聚丙酰胺凝膠電泳分離，在經(jīng)放射自顯影確定各個(gè)片段末端堿基，從而得出目的DNA的核苷酸序列。6.試述聚合酶鏈反應(yīng)原理。答:高溫變性:94左右，目的基因解鏈為單鏈，以作為擴(kuò)增的模板;低溫復(fù)性:55-60，一對特異性引物分別與模板3端互補(bǔ)結(jié)合;室溫延伸:72，延伸反應(yīng);每一循環(huán)使DNA分子擴(kuò)增一倍，n次循環(huán)后，理論上DNA分子可擴(kuò)增2的n次方。7.簡述引物設(shè)計(jì)原則。答序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。引物長度以15-30bp為宜。堿基盡可能隨機(jī)分布。G+C占40-60%，上下游引物因基本一致。引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu));引物間避免有互補(bǔ)序列(二聚體)。引

19、物3端為關(guān)鍵堿基;5端無嚴(yán)格限制。8.試述聚合酶鏈反應(yīng)體系的組成。答:模板，dNTP，引物，耐熱DNA聚合酶及緩沖液(含Ca2+)。9.簡述分子診斷及其應(yīng)用范圍。答:分子診斷:以疾病基因或疾病相關(guān)基因?yàn)闄z測對象屬于病因?qū)W診斷。靈敏度高，便于早期診斷及疾病預(yù)防。以基因分析為基礎(chǔ)，準(zhǔn)確性和特異性高。應(yīng)用范圍:感染性疾病，遺傳性疾病，腫瘤，個(gè)體化醫(yī)療，疾病耐藥性，療效監(jiān)控等。10.常用分子診斷技術(shù)有哪些？答:Northern印記雜交，熒光原位雜交，反轉(zhuǎn)錄PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，基因表達(dá)譜芯片，Western蛋白質(zhì)印跡，免疫組織化學(xué)染色，酶聯(lián)免疫法，酶分析方法，蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術(shù)等。11. 常見

20、核酸分子標(biāo)志物有哪些？（1）DNA分子標(biāo)記物突變基因：最重要，是眾多單基因遺傳病的致病原因。多態(tài)性基因：SNP并不直接致病，而是對疾病的易感性產(chǎn)生影響，有多種檢測方法。等位基因：一個(gè)位點(diǎn)突變，可能產(chǎn)生癌基因，相關(guān)基因的改變往往是腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)。病原生物基因組：直接探查病原體基因存在的狀態(tài)。線粒體DNA：母系遺傳病的重要分子診斷標(biāo)志物。循環(huán)DNA：游離循環(huán)DNA和游離循環(huán)RNA（2）RNA分子標(biāo)記物異常剪接RNA：選擇性剪接或受到內(nèi)源其他RNA的調(diào)節(jié)產(chǎn)生異常轉(zhuǎn)錄本。RNA病毒基因組：RNA病毒感染患者循環(huán)RNA：與循環(huán)DNA類似microRNA與Inc RNA： microRNA促進(jìn)目標(biāo)mR

21、NA的降解或者抑制靶基因蛋白質(zhì)的翻譯。Inc RNA有望成為新型腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。12.簡述酚抽提法分離提取DNA的原理。13.簡述異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA的原理。異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶的活性，酚-氯仿抽提去除蛋白質(zhì)，再通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA抽提。 使用這種方法，不但能得到高質(zhì)量的RNA，而且能同時(shí)分離出細(xì)胞染色體DNA。本法已成為提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA的常規(guī)方法。 14.簡述核酸電泳的原理。瓊脂糖凝膠電泳原理：瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，

22、然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網(wǎng)孔向陽極遷移。在不同條件下電泳適當(dāng)時(shí)間后，大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達(dá)到分離目的，兼具分子篩和靜電效應(yīng)，分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析和制備長度小于1k

23、b的DNA片段。15. 常用核酸標(biāo)記方法有哪些？（1）缺口平移法（Nick Translation)反應(yīng)體系中DNA酶1隨機(jī)在探針DNA上打開缺口;然后利用DNA聚合酶53外切酶活性、在缺口處按53方向切除單核苷酸；同時(shí)DNA聚合酶有53的聚合酶活性，在缺口處3端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記的單核苷酸,隨機(jī)摻入。(2)隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法)利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有53聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA(探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3端為起點(diǎn)

24、。沿模板35方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP，隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中,探針即被標(biāo)記。（3）聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記DNA探針利用Taq DNA聚合酶和標(biāo)記的dNTP，以起始模板合成高比活性的雙鏈或單鏈DNA探針。該法簡便快速、效率高、重復(fù)性好，可大量制備。（4）末端標(biāo)記法5末端加成標(biāo)記法：先用堿性磷酸酶（AP)去掉dsDNA5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP的y-磷酸轉(zhuǎn)移加到DNA片段5-OH上。3末端加成標(biāo)記法：在探針3-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)帶標(biāo)記的a-32PdNTP。T4聚合酶替代法16.試述熒光定量PCR原理。FQ-PCR的熒光標(biāo)記物可分為哪兩種？ Taqma

25、n技術(shù)的原理是什么？l 原理：通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)用Ct值表示。 初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值）。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量l 標(biāo)記物：熒光染料：SYBR Green I 熒光探針：Taqmanl Taqman技術(shù)的原理：TaqMan探針的5端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)R，3標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)Q，當(dāng)探針完整時(shí)，由于熒光共振能量的傳遞原理，R集團(tuán)發(fā)射的熒光被Q基團(tuán)淬滅，因此檢測不到熒光在擴(kuò)增的過程中，Taq DNA聚合酶沿著模板移動(dòng)合成新鏈，當(dāng)移動(dòng)