分析耐冬山茶最佳胚狀體和胚性愈傷產(chǎn)生條件

1、分析耐冬山茶最佳胚狀體和胚性愈傷產(chǎn)生條件耐冬山茶(Camellia japonica)系指分布于青島地區(qū)的山茶野生種群或栽培群體,為山茶科山茶屬常綠小喬木或灌木,作為第三紀(jì)殘遺植物,此群體具有豐富的遺傳變異性.耐冬山茶可耐-10以下低溫,是我國(guó)北方地區(qū)珍稀的室外冬春兩季開花常綠植物,觀賞價(jià)值極高1.目前耐冬山茶僅分布于山東青島及附近島嶼,野生植株只有幾千株,栽培植株數(shù)量也不甚多2.對(duì)于這個(gè)古老、珍貴的觀賞種群,在園林中應(yīng)用越來越廣泛,因此,擴(kuò)大耐冬山茶的種質(zhì)資源數(shù)量是目前育種工作的重點(diǎn).組織培養(yǎng)技術(shù)是快速、高效繁殖山茶的重要途徑.山茶組織培養(yǎng)的方式主要為外植體材料(芽、莖段、葉片和子葉等)的愈

2、傷組織 直 接 和 間 接 誘 導(dǎo)等3,4.耐冬山茶未成熟胚胚狀體培養(yǎng)再生繁殖體系(也稱體胚培養(yǎng))是通過胚狀體直接誘導(dǎo)或愈傷組織間接誘導(dǎo),可在較短的時(shí)間內(nèi)獲得再生頻率高的植株,成本低,有利于種質(zhì)資源保存、大規(guī)模生產(chǎn)耐冬山茶及實(shí)現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化5.相比直接誘導(dǎo)胚狀體方式,通過胚性愈傷誘導(dǎo)的胚狀體可形成數(shù)量較多的植株,其中胚性愈傷的形成是誘導(dǎo)胚狀體的關(guān)鍵環(huán)節(jié).本實(shí)驗(yàn)采用不同激素組合,對(duì)不同時(shí)期采集的耐冬山茶不同部位幼胚進(jìn)行胚狀體和胚性愈傷誘導(dǎo),分析最適宜產(chǎn)生胚狀體和胚性愈傷的條件,為耐冬山茶胚狀體再生繁殖體系奠定基礎(chǔ).1 材料與方法.1.1 實(shí)驗(yàn)材料.實(shí)驗(yàn)所用的耐冬山茶植株栽植于青島市植物園實(shí)

3、驗(yàn)田內(nèi),2012年4月進(jìn)行異花授粉,89月分別采集授粉后15周、17周、19周和21周的幼果,以剝除果皮和種皮后分段的幼胚作為外植體.1.2 培養(yǎng)方法.1.2.1 不同實(shí)驗(yàn)材料組合.授粉后13周左右,耐冬山茶幼胚基本成型,可以進(jìn)行分段培養(yǎng).為排除胚芽生長(zhǎng)的影響,分別將授粉后15周、17周、19周和21周的幼果內(nèi)幼胚去除上端胚芽部分,留取中段和下端部分,每部分再平均分成4塊,接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng).每瓶接種一類幼胚(4個(gè)小塊),每類幼胚接種10瓶.1.2.2 不同激素配制組合誘導(dǎo) 培養(yǎng)基 的基本培養(yǎng)基為MS,附加蔗糖30g/L,瓊脂粉8g/L.培養(yǎng)基配方以誘導(dǎo)胚狀體為主進(jìn)行設(shè)計(jì),不同的激素組

4、合如表1所示.培養(yǎng)基調(diào)pH至5.8,121滅菌20min.表1誘導(dǎo)耐冬山茶胚狀體和胚性愈傷的激素組合.1.2.3 外植體消毒和培養(yǎng)采來的幼果先用流水沖洗干凈,再小心剝出種子,自來水沖洗干凈后放入無菌水中.在超凈工作臺(tái)中,處理過的種子先用75%酒精浸泡20s,再用無菌水沖洗2遍,然后使用0.1%的HgCl2消毒浸泡7min,最后用無菌水沖洗56遍.將分段的幼胚接種于不同組合的培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為25、光照光強(qiáng)為25003000lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng),光照時(shí)間為12h/d.每7d觀察一次,30d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生胚狀體和胚性愈傷的數(shù)量及產(chǎn)生胚狀體/胚性愈傷的幼胚塊數(shù)量.2 結(jié)果與分析幼胚接種1周左右開始膨大

5、,2周左右開始出現(xiàn)胚性愈傷,胚性愈傷呈現(xiàn)淡黃綠色,生長(zhǎng)較一般的愈傷組織緩慢,質(zhì)地松軟,表面有瘤狀凸起,細(xì)胞排列緊密.3周左右就能夠區(qū)分直接誘導(dǎo)的胚狀體和愈傷組織,此時(shí)的胚狀體基本發(fā)育到子葉胚階段,顏色為淡黃綠色或乳黃色(圖1).在對(duì)出現(xiàn)胚性愈傷和胚狀體的幼胚塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上,還進(jìn)一步確定了產(chǎn)生這兩類組織的具體數(shù)量.其中胚性愈傷根據(jù)耐冬山茶中誘導(dǎo)出現(xiàn)的形態(tài)特點(diǎn),以組團(tuán)為單位進(jìn)行了統(tǒng)計(jì).2.1 授粉15周后的胚狀體和胚性愈傷誘導(dǎo)從表2可看出,對(duì)于胚狀體誘導(dǎo)率最高的組合為1.0mg/L 6-BA激素培養(yǎng)基對(duì)于末段幼胚誘導(dǎo)和1.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA誘導(dǎo)末段幼胚,最低誘導(dǎo)率出

6、現(xiàn)在添加1.0mg/L IBA激素培養(yǎng)基對(duì)中段幼胚的誘導(dǎo)組合中.在對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)中,誘導(dǎo)率達(dá)60%以上的激素配方和幼胚部位組合包括5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA誘導(dǎo)末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA誘導(dǎo)中段幼胚,1.0mg/L 6-BA對(duì)中段幼胚誘導(dǎo)率高達(dá)75%.表明,較低濃度的6-BA及其與NAA組合對(duì)早期幼胚胚狀體誘導(dǎo)率效果較好,而6-BA與較低濃度IBA組合有利于胚性愈傷的誘導(dǎo).2.2 授粉17周后的胚狀體和胚性愈傷誘導(dǎo)授粉17周后采集的幼胚接種后,對(duì)于胚狀體的誘導(dǎo)率最高

7、的組合仍然是1.0mg/L 6-BA和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA對(duì)于末段幼胚的誘導(dǎo),但總體數(shù)量較授粉15周后接種的幼胚增多(表3).添加1.0mg/L 6-BA激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的末段誘胚和5.0mg/L 6-BA+ 0.5mg/L IBA誘導(dǎo)的中段幼胚所產(chǎn)生胚性愈傷的塊數(shù)最多,在6-BA+NAA的兩種激素組合中的培養(yǎng)基中和0.5mg/L IBA激素的培養(yǎng)基中對(duì)于胚性愈傷的誘導(dǎo)率最低.這再次證明了6-BA、NAA和IBA的不同組合對(duì)于耐冬山茶幼胚的作用效果差異明顯.2.3 授粉19周后的胚狀體和胚性愈傷誘導(dǎo).和前兩次誘導(dǎo)胚狀體組合不同的是,19周接種的幼胚胚狀體數(shù)量除在有

8、1.0mg/L 6-BA激素誘導(dǎo)的 末 段 幼 胚 中 最 高 外,在1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA激素誘導(dǎo)的中段和末段幼胚中也很高(表4).但胚性愈傷的誘導(dǎo)率總體上較前兩次的數(shù)量略有降低,最高誘導(dǎo)率出現(xiàn)在2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA激 素 組 合 的 幼 胚 中 段 部 位 和1.0mg/L 6-BA的幼胚末段部位.2.4 授粉21周后的胚狀體和胚性愈傷誘導(dǎo).此階段對(duì)于胚狀體的誘導(dǎo)率表現(xiàn)趨勢(shì)和15、17周的類似,只是數(shù)量上有所上升,添加1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA激素的MS培養(yǎng)基對(duì)于末段幼胚的胚狀體誘導(dǎo)效果最佳,其次為1.0mg/L

9、6-BA的激素對(duì)于末段幼胚的胚狀體誘導(dǎo)可達(dá)45%以上,對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率最低的激素組合為僅添加生長(zhǎng)素的兩種不同濃度IBA的配方(表5).大于60%的胚性愈傷的誘導(dǎo)組合為5.0mg/L 6-BA+ 0.5mg/L IBA誘導(dǎo)末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+ 1.0mg/L IBA誘導(dǎo)幼胚中段部位.3結(jié)論3.1接種時(shí)間對(duì)胚狀體和胚性愈傷的誘導(dǎo).從4個(gè)不同接種時(shí)期對(duì)于耐冬山茶的胚狀體和胚性愈傷的誘導(dǎo)情況來看,隨著幼果成熟時(shí)間的延長(zhǎng),8個(gè)不同的激素組合對(duì)于胚狀體的誘導(dǎo)率基本呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),這表明發(fā)育成熟度高的幼胚對(duì)于胚狀體的誘導(dǎo)能力較強(qiáng).但胚性愈傷的誘導(dǎo)效果與幼果成熟度關(guān)系不太大,這可能與授粉后152

10、1周幼胚發(fā)育成熟度較一致有關(guān).3.2 激素對(duì)胚狀體和胚性愈傷的誘導(dǎo).耐冬山茶胚狀體在含有1.0mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上,未成熟胚較易形成胚狀體,其中單獨(dú)添加1.0mg/L 6-BA的培養(yǎng)基和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA組合的培養(yǎng)基總體對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率最高.濃度大于2.0mg/L 6-BA的培養(yǎng)基對(duì)于胚狀體形成不利.單獨(dú)添加IBA的培養(yǎng)基對(duì)于胚狀體誘導(dǎo)效果最弱.添加稍高濃度的6-BA+IBA的組合及低濃度的6-BA培養(yǎng)基對(duì)于耐冬山茶胚性愈傷的誘導(dǎo)效果最佳,2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/LNAA的激素組合和0.5mg/L IBA對(duì)于胚性愈傷形成影響效果最低.由此可

11、見,胚狀體誘導(dǎo)需要較低濃度細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的協(xié)同作用,胚性愈傷的形成則需要稍高濃度的細(xì)胞分裂素的促進(jìn).3.3 外植體部位對(duì)胚狀體和胚性愈傷的誘導(dǎo)總體來看,耐冬山茶胚狀體在幼胚的末段部位發(fā)生較多,而胚性愈傷在幼胚的中段部位較易形成.胚狀體一般一個(gè)幼胚段只有12個(gè),但胚性愈傷在每個(gè)幼胚段上的數(shù)量呈組團(tuán)狀分布,數(shù)量較多.胚性愈傷接種到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,極易形成胚狀體,可以快速獲得大量的胚狀體再生植株.同時(shí),研究中還發(fā)現(xiàn)幼胚表面形成的胚狀體較切口面為多,但胚性愈傷多在切口處形成.4 討論耐冬山茶果實(shí)成熟的時(shí)間為10月份左右,授粉12周以內(nèi)的幼胚尚未凝固成型,不利于區(qū)分不同部位進(jìn)行誘導(dǎo).本實(shí)驗(yàn)中授粉1

12、521周的幼果處于8月上旬至9月上旬,此期間幼胚已經(jīng)成型,子葉表皮細(xì)胞分化能力較高,因此胚狀體的形成能力也較強(qiáng).植物組培過程中,褐化現(xiàn)象比較普遍,耐冬山茶在誘導(dǎo)胚狀體過程中未出現(xiàn)明顯褐化現(xiàn)象,但在幼胚切口邊緣的愈傷組織 呈現(xiàn)梅紅色,這可能與物種特異性有關(guān),有待于進(jìn)一步的解剖觀察分析6.在對(duì) 山 茶 屬 植 物 胚 狀 體 研 究 中,茶 梅 (C.sasanqua)、防 城 金 花 茶 (C.chrysantha var.longistyla)等多個(gè)物種胚狀體都是在1.0mg/L 6-BA +低濃度NAA的激素組合條件下易誘導(dǎo)發(fā)生,但發(fā)生率一般都在50%以下7-9.這和本實(shí)驗(yàn)對(duì)于胚狀體直接誘導(dǎo)

13、的結(jié)果相似,只是物種不同,激素濃度有所差異.在對(duì)茶樹(C.sinensis)體胚研究中發(fā)現(xiàn),在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加一些滲透調(diào)節(jié)劑,如5001000mg/L甜菜堿,體胚的發(fā)生率會(huì)提高10.實(shí)驗(yàn)中,耐冬山茶胚性愈傷的誘導(dǎo)率普遍較高,間接誘導(dǎo)的胚性愈傷可以再進(jìn)一步誘導(dǎo)為胚狀體,這比直接誘導(dǎo)胚狀體更能夠獲得更多的再生苗.在 對(duì) 金 花 茶 體 胚 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) 中,MS +1.5mg/L 2,4D +0.5mg/L KT的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率高,這與本實(shí)驗(yàn)采用的組合差異有所不同,耐冬山茶中對(duì)于其他激素組合誘導(dǎo)培養(yǎng)基還有待于嘗試11.目前山茶屬中對(duì)于其他物種胚性愈傷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)可以為山茶屬植物通過胚性愈傷誘導(dǎo)的胚狀體快速繁殖方式提供參考.參考文獻(xiàn):1王仁卿,張治國(guó),石竹,等.青島山茶的多樣性研究.生態(tài)學(xué)分析J.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999,34(1):109-1162王奎玲.耐冬山茶種質(zhì)資源研究D.北京:北京林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2006:25-263Ponsamuel J,Samson N P,Ganeshan P S,et al.Somatic embryo-genesis and plant regeneration from the immature cotyledonarytissues of culti