現(xiàn)代分子診斷技術(shù)ppt課件

1、利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測(cè)樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對(duì)，以判斷有無互補(bǔ)的同源核酸序列的存在 核酸探針 是指帶有標(biāo)記的某一特定DNA或RNA片斷，能與待測(cè)樣本中單鏈核酸分子互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而檢測(cè)同源序列 探針標(biāo)記物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類,分離雜交探針的方法： 提取某一病原微生物株系的染色體DNA 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶解 得到的酶解片段克隆進(jìn)一質(zhì)粒載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫 文庫中重組質(zhì)粒的插入片段即可用來分別同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA進(jìn)行雜交、篩選,核酸雜交的靈敏度和可靠性極高 用探針直接同糞

2、便樣品、尿樣、血樣、喉洗液和組織樣品中的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，且無需預(yù)先純化DNA 若樣品中的目標(biāo)分子非常少，則需通過PCR將目的序列擴(kuò)增，再進(jìn)行雜交檢測(cè) 從理論上講，用DNA雜交來診斷疾病可用于對(duì)所有的致病微生物的檢測(cè),4、非同位素標(biāo)記探針,32P的缺點(diǎn)： 半衰期短，僅13天 操作起來比較危險(xiǎn) 必須要有特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備進(jìn)行操作 放射性垃圾的處理繁瑣,非放射性雜交檢測(cè)系統(tǒng)： 通過酶促反應(yīng)將某種底物轉(zhuǎn)變成生色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到放大信號(hào)的目的 采用將生物素（biotin）標(biāo)記的核苷酸摻入DNA的方法制備探針 生物素標(biāo)記的DNA在室溫下至少可保存一年 檢測(cè)發(fā)光和顏色變化可在幾小時(shí)內(nèi)完成,B,B,

3、生物素,加入鏈霉素抗生物蛋白,加入生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶,探針,目的DNA,加入不同的生色或化學(xué)發(fā)光底物,熒光標(biāo)記的引物直接進(jìn)行PCR檢測(cè),DNA,引物1,引物2,熒光染料,PCR,層析,熒光檢測(cè),游離引物,分子夾心探針檢測(cè),發(fā)出熒光,分子夾心探針(沒有熒光,熒光團(tuán),猝滅劑,目的DNA,與目的DNA雜交,TaqMan探針技術(shù),原理： 利用Taq酶的3 5外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)，由于探針與模板特異性結(jié)合，熒光的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量,3,5,5,3,R,上游引物,下游引物,5,3,3,5,R,TaqMan探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制,瘧疾的分子診斷,檢測(cè)是否存在瘧原蟲 抽取血樣進(jìn)行鏡檢

4、 免疫診斷:ELISA檢測(cè)瘧原蟲蛋白或抗體 無法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染 DNA雜交診斷,例一,DNA的雜交探針是一段瘧原蟲的高度重復(fù)的DNA序列 具體的分離過程： 構(gòu)建一個(gè)瘧原蟲的核基因文庫 用標(biāo)記的瘧原蟲核DNA作探針去篩選核基因文庫 選出那些雜交信號(hào)最強(qiáng)的克隆 用這些選出來的片段作探針，與瘧原蟲及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為DNA探針的可靠性,錐蟲的檢測(cè),錐蟲在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細(xì)胞 顯微鏡檢新鮮血液 取新鮮血液感染未攜帶錐蟲的寄生蟲,30-40天后殺死昆蟲,鏡檢昆蟲的腸道 免疫檢測(cè):假陽性高,例二,PCR檢測(cè)

5、針對(duì)錐蟲特有的一段188bp的DNA序列設(shè)計(jì)引物，特異地從錐蟲基因組中擴(kuò)增得到188bp的條帶,二、細(xì)菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù),抗生素的不合理使用 DNA雜交 PCR檢測(cè) 噬菌體介導(dǎo),DNA雜交,設(shè)計(jì)16SrRNA為探針 16SrRNA在細(xì)菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性 特異性不是很好 必須結(jié)合PCR技術(shù),PCR檢測(cè),nested PCR 針對(duì)目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計(jì)多對(duì)引物 每對(duì)引物都能特異的擴(kuò)增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加,模板,使用外引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增,使用內(nèi)引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,巢式PCR原理示意圖,

6、PCR技術(shù)也會(huì)產(chǎn)生假陽性 新擴(kuò)增的目的DNA特異性不強(qiáng) 退火溫度過低 模板中雜質(zhì)的污染 假陰性 存在Taq酶的抑制劑 模板量過少 模板DNA純度不夠,原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) 在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對(duì)待測(cè)的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過原位雜交進(jìn)行檢測(cè) 不僅能檢測(cè)出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位,原位雜交（nucleic acid hybridization in situ） 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測(cè)特異的DNA或RNA序列 細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNA-DNA RNA-DNA 三類雜交 RNA-RNA 該法優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核

7、酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài),有,噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測(cè),將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測(cè)樣品 噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和ATP，就會(huì)有熒光產(chǎn)生 結(jié)核菌的檢測(cè) 抗藥性菌株的檢測(cè),熒光素酶,熒光素ATP,熒光,利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯,噬菌體基因,熒光素酶基因,宿主細(xì)菌,噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測(cè),第三節(jié) DNA指紋,每個(gè)人體細(xì)胞內(nèi)都含有23對(duì)染色體，每條染色體中部含有一個(gè)DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在DNA分子中存在三種類型：?jiǎn)慰截愋蛄?、中等程?/p>

8、重復(fù)序列、高度重復(fù)序,每個(gè)重復(fù)序列在300個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要DNA帶的附近，所以也稱衛(wèi)星DNA，其中的重復(fù)序列單元?jiǎng)t稱為“小衛(wèi)星DNA” “小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星DNA “中有一小段序列則在所有個(gè)體中都一樣，稱為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來作為分子探針與不同個(gè)體的DNA進(jìn)行分子雜交，就會(huì)出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專一性和特異性，因此稱作“DNA指紋” 通過對(duì)人類基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間9999的堿基序列都相同，而剩下的0.01%的堿基特征序列則來自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定,所羅門的審判,大家都聽

9、說過所羅門的審判這樣一件故事： 兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是 所羅門就命令一名侍衛(wèi)把那個(gè)孩子帶來，要用劍將其 辟成兩半分給他們兩， 結(jié)果假母親同意所羅 門的判決，而孩子真 正的母親卻懇求侍衛(wèi) 饒了孩子的性命，她 解釋說：“把孩子給了 假母親，總比讓孩子 慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了,滴骨驗(yàn)親法,以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。 三國時(shí)代（公園220280年）謝承著會(huì)稽先賢傳中的以弟血滴兄骨可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時(shí)一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨,合血法,等到了明代，更是采用了“合血法”