雙氧水預處理對氧化損傷的H9c2心肌細胞的保護機制

1、雙氧水預處理對氧化損傷的H9c2心肌細胞的保護機制前言心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion in-jury，MIRI）是指心肌缺血/缺氧一段時間，當重新恢復血流或血氧供應后，心肌細胞功能代謝障礙及結構破壞反而較缺血/缺氧時進一步加重、心功能進一步惡化的病理生理過程。細胞內(nèi)既有活性氧等氧化系統(tǒng)，也存在清除活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，不會導致?lián)p傷。然而，缺血再灌注階段會產(chǎn)生大量活性氧，而機體又無法完全清除，這些過量的活性氧就會引起一些重要的生物大分子

2、的氧化損傷，從而誘導心肌細胞凋亡和壞死。目前認為活性氧介導的氧化損傷是引起心肌缺血再灌注損傷的重要原因。然而近年來大量研究表明，H2O2預處理能保護PC12細胞抵抗氧化損傷，抑制氧化損傷導致的細胞凋亡。Guo等研究還發(fā)現(xiàn)活性氧可作為抗氧化酶第二信使激活級聯(lián)反應，增加SOD、CAT等抗氧化酶活性，清除活性氧，從而起到抗氧化損傷的保護作用。對于氧化損傷的H9c2心肌細胞，目前尚不清楚低濃度H2O2預處理是否具有保護作用以及能否上調(diào)抗氧化酶活性。本研究通過構建大鼠H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型，給予低濃度H2O2預處理，以探討低濃度H2O2預處理對氧化損傷的H9c2心肌細胞的保護作用及其機制。目前

3、，對于缺血再灌注損傷的防治尚無有效辦法，本研究在不改變損傷因子性質(zhì)的情況下，通過適宜濃度的活性氧進行預處理，激活機體自身的抗氧化防護機制，從而加強細胞對氧化損傷的抵抗能力，這種主動性抵抗作用將為臨床防治缺血再灌注損傷提供了一種新的思路。1、材料與方法1.1材料大鼠心肌細胞系（H9c2）購自中國科學院細胞中心。高糖DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、Hoechst 33258購自Sigma公司，CCK8試劑盒購自江蘇碧云天公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，An-nexin V-FITC/PI細胞凋亡

4、試劑盒購自奧地利Bender MedSys-tems公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.2實驗方法和步驟1.2.1細胞培養(yǎng)和預處理方法將H9c2心肌細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選對數(shù)生長期的細胞進行實驗研究。H2O2預處理按以下步驟實施：25μmol/LH2O2作用90分鐘后，換為含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，PBS漂洗2遍，然后給予2%FBS的高糖DMEM稀釋配置的400μmol/LH2O2處理6h。1.2.2丙二醛（MDA）測定收集四組細胞，分別用200μL的1%Triton X-100進行充分裂解

5、，15,000轉(zhuǎn)/分離心10min，收集上清，取100μL上清，嚴格按照MDA試劑盒說明書操作，測定各管吸光度，按照公式計算得出各組MDA含量。1.2.3總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定收集三組細胞，分別用200μL的1%TritonX-100進行充分裂解，15,000轉(zhuǎn)/分，離心10min，取50μL上清，嚴格按照T-SOD試劑盒說明書操作，BCA法測定樣品蛋白濃度，酶標儀檢測各組吸光度，按照公式計算出各組的SOD活性。1.2.4CCK8法檢測細胞存活率將H9c2心肌細胞按6×104/ml接種于96孔板，每孔100μL，細胞融合生長至80%左右，實驗分組

6、要求處理各組細胞，每孔加入10μL的CCK8液繼續(xù)培養(yǎng)2h，在酶標儀450nm處，測定每孔的吸光度值，從而計算H9c2細胞的存活率。1.2.5Hoechst33258染色觀察凋亡形態(tài)變化按照5×104/ml接種于24孔板，細胞融合生長至60%左右，經(jīng)過相應處理，棄舊培養(yǎng)液，PBS輕輕漂洗1次，加入4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS漂洗1次，2.5μg/ml的Hoechst 33258室溫避光染色15分鐘，PBS輕輕漂洗3次，每次5分鐘，然后每孔加400μLPBS上熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.2.6Annexin-V/PI雙染色流式細胞儀檢測凋亡率采用25cm2培養(yǎng)瓶

7、培養(yǎng)心肌細胞，細胞生長至70%左右給予不同處理后，進行胰酶消化，離心收集細胞，4預冷無菌的PBS漂洗細胞2遍，每組取總數(shù)為1×106/ml的細胞待檢測，用250μL結合緩沖液重懸細胞，并使其濃度為2-5×105/ml，取190μL細胞懸液加入10μL的Annexin V-FITC，間隔3分鐘，再加入10μL濃度為20μg/ml的碘化丙錠（PI），混勻后于室溫避光孵育15min，在流式反應管中加入400μLPBS，輕輕混勻，上流式細胞儀檢測分析。1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料均采用x±s表示。多樣本

8、均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩間均數(shù)的多重比較采用LSD檢驗，以P2、結果2.1H2O2預處理對氧化損傷H9c2細胞存活率的影響400μmol/LH2O2處理H9c2心肌細胞6h，造成H9c2細胞的存活率降低至（60±5）%，與正常對照組（100%）相比，兩者有顯著性統(tǒng)計學差異（P2.2H2O2預處理對H9c2細胞氧化損傷的影響正常對照組（CTL組）H9c2細胞的MDA含量比較低為1.9±0.33nmol/mg，損傷組MDA的含量明顯升高達6.8±0.56nmol/mg，與損傷組比較，25μmol/LH2O2

9、預處理后的MDA水平明顯升高達4.8±0.4nmol/mg（P0.05），PC組與損傷組相比，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）（見圖2.A）。CTL組H9c2細胞的SOD活性為176±6.48U/mg，損傷組細胞的SOD活性顯著降低達122±11.73U/mg；與損傷組比較，PC組SOD活性明顯升高，數(shù)值為160±10.27U/mg（P2.3H2O2預處理減輕氧化損傷誘導的凋亡細胞形態(tài)學變化正常對照組的H9c2細胞，光鏡下細胞呈梭桿形，排列整齊，肌束樣，細胞間隙緊密（圖3A），熒光顯微鏡下細胞核呈現(xiàn)大小均一，均勻熒光，無

10、核固縮，為體積稍大的暗染核形態(tài)（圖3B）；400μmol/LH2O2處理6h，導致細胞皺縮、細胞外觀形態(tài)扭曲（圖3A），細胞核染色質(zhì)凝集，核固縮，核碎裂，呈現(xiàn)體積小而亮的核形態(tài)（圖3B）；而25μmol/LH2O2預處理能明顯減輕400μmol/LH2O2引起的以上形態(tài)變化（圖3A和圖3B）。2.4H2O2預處理減少氧化損傷心肌細胞凋亡率流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，正常對照組凋亡率為（1.25±0.14）%，損傷組凋亡率為（14.8±1.06）%，損傷組與正常對照組相比較有統(tǒng)計學差異（P3、討論溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)、冠狀動脈搭橋術

11、等方法廣泛用于臨床急性心肌梗死的治療，對于恢復心肌的灌注、縮小心肌梗死范圍、保護心功能起著重要作用，但同時也出現(xiàn)了嚴重的再灌注損傷,研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死冠脈再通后大約25%的心肌細胞死亡。如何防治心肌缺血再灌損傷，引起了人們高度的重視。目前認為活性氧是缺血再灌注損傷的重要發(fā)病學環(huán)節(jié)，是引起心肌缺血再灌注的關鍵誘導因素。在缺血再灌注損傷中，復灌時期會產(chǎn)生大量活性氧，導致細胞膜脂質(zhì)過氧化、DNA損傷以及心肌細胞凋亡。H2O2是活性氧家族的重要成員之一，有關缺血再灌注損傷的研究多采用高濃度的H2O2來模擬氧化損傷模型。然而活性氧（ROS）除了具有促氧化損傷的不利影響外，最近研究還現(xiàn)低濃度活性氧具有信

12、號轉(zhuǎn)導和促細胞增殖作用，而高濃度活性氧促細胞死亡，且呈現(xiàn)明顯劑量效應關系。本研究采用400μmol/LH2O2作用6小時來構建H9c2心肌細胞的氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2對H9c2心肌細胞無細胞毒性，經(jīng)過25μmol/LH2O2對H9c2心肌細胞進行90分鐘的預處理，細胞存活率明顯升高，細胞凋亡明顯減少，顯示低濃度H2O2預處理具有顯著的心肌保護作用。Mo等對氧化損傷的PC12細胞中也發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2有明顯的細胞保護作用?；钚匝跏侵冈谏矬w內(nèi)與氧代謝有關的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱，氧化性質(zhì)非?；顫?，ROS能導致心肌細胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)和降解、脫氧核糖

13、核酸斷裂以及線粒體功能障礙。生理條件下，機體不斷產(chǎn)生活性氧，而體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)不斷清除活性氧，兩者處于動態(tài)平衡中，不會損害機體；然而當出現(xiàn)有害刺激時，才會產(chǎn)生大量活性氧，抗氧化系統(tǒng)清除能力有限，最終導致氧化損傷的發(fā)生。過量的活性氧與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，例如動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死和心力衰竭等，因此有很多學者在著手研究減輕活性氧損傷的策略。但是，近來有很多研究證實適量的活性氧是一種重要的介導保護作用的信號分子，具有積極的生理作用。Penna等認為適量ROS可作為信號分子，參與缺血前處理和缺氧后處理的心臟保護作用信號通路，介導心肌保護作用。活性氧還是缺血后處理心肌保護作用信號通路的組成部分，參與傳導抗凋亡的保護作用。本研究中低濃度H2O2對氧化損傷的心肌細胞保護的同時，伴有SOD活性明顯升高，提示H2O2預處理可能通過增加SOD的活性，進而抵御氧化損傷。綜上所述，25μmol/LH2O2預處理可以增加心肌細胞存活率，減少細胞凋亡形態(tài)的發(fā)生，降低氧化損傷的凋亡率，增加SOD的活性，減少MDA的含量，對于氧化損傷的H9c2心肌細胞具有很好的保護作用，其機制可能是適量的活性氧作為抗氧化酶的信號分子