大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離,指結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物,一、微生物,90%以上的微生物是對(duì)人類有利的,微生物的類群,細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有: 鞭毛和菌（纖）毛莢膜細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)擬核區(qū)(類核區(qū),1、細(xì)菌的構(gòu)造,圖1-3 細(xì)菌的結(jié)構(gòu),繁殖方式：分裂繁殖（20min分裂一次,2、菌落,單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù),菌落,細(xì)菌的菌落特征因種而異,碳源 氮源 生長(zhǎng)因子 無機(jī)鹽 水,微生物需要的五大類營(yíng)養(yǎng)要素物質(zhì),3、培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是人工方法配制而成的，是微

2、生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),1）培養(yǎng)基的成分,a）細(xì)菌培養(yǎng)基： 特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化鈉 酸堿度：中性偏堿 （b）霉菌培養(yǎng)基： 特殊成分：無機(jī)物或添加蔗糖的豆芽汁 酸堿度：中性偏酸,2）培養(yǎng)基的種類,1）按物理性質(zhì)分: a.固體培養(yǎng)基 通常加瓊脂，作為凝固劑 （凝固劑的要求：不被微生物利用，又可使培養(yǎng)基固化，且不影響培養(yǎng)基中的其他營(yíng)養(yǎng)物被細(xì)菌吸收） 作用：分離（純化）細(xì)菌、計(jì)數(shù)、保留菌種等 b.液體培養(yǎng)基 不加瓊脂等凝固劑其它成分與固體培養(yǎng)基相同 作用：培養(yǎng)細(xì)菌,液體培養(yǎng)基,表面生長(zhǎng),均勻混濁生長(zhǎng),沉淀生長(zhǎng),固體培養(yǎng)基：菌落,2）根據(jù)化學(xué)成分分 合成培養(yǎng)基成分明確 天然培養(yǎng)基成分不明

3、確,3）按培養(yǎng)基的用途分類,a基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）:含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要的基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是上面提及的天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 b營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如血液、血清或生長(zhǎng)因子等。用以培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的微生物,c、選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng),如 尿素固體培養(yǎng)基可以分離以尿素為氮源的微生物。 d、鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物,如 伊紅和美藍(lán),和大腸桿菌的代謝產(chǎn)物結(jié)合,使菌落呈深紫色,并帶有金屬光澤,可以用來鑒別大腸桿菌

4、,二、無菌操作技術(shù),1、概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物,2、無菌技術(shù)包括： （1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著 和手進(jìn)行 清潔和消毒 ； （2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基 等器具進(jìn)行 滅菌 ； （3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操 作應(yīng)在 酒精燈火焰附近 進(jìn)行； （4）避免已滅菌處理的材料用具 與 周圍物品 相接觸,1）消毒定義： 利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程,3、消毒與滅菌的概

5、念及兩者的區(qū)別,2）滅菌的定義,以化學(xué)或物理方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無菌的過程。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù),3）具體無菌處理方法： （a）消毒,1）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)先用 紫外線 進(jìn)行物理消毒，然后用 酒精 增強(qiáng)消毒效果。 2）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用 酒精 進(jìn)行消毒。 3）日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法。 4）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法,巴氏消毒法是法國(guó)科學(xué)家巴斯德創(chuàng)建的一種食品保鮮方法，最早是為了延長(zhǎng)法國(guó)葡萄酒的保質(zhì)期。這是一種能將絕大多數(shù)的細(xì)菌殺死的低溫消毒方法。 牛奶消毒也用巴氏消毒法。 具體

6、措施：牛奶在62.8攝氏度下30分鐘。 優(yōu)點(diǎn)：最大限度地保持了牛奶的品質(zhì)，顏色，味道和營(yíng)養(yǎng),b)滅菌,1）灼燒滅菌 接種環(huán)、玻璃刮刀 試管口 2）高壓蒸氣滅菌： 1kg/cm2壓力、121、15min,培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、取樣器的頭、移液管、三角刮刀、接種環(huán)、鑷子、無菌水、培養(yǎng)基,高壓蒸汽滅菌不會(huì)破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分,三、分離細(xì)菌方法,1、劃線分離法（P20） （視頻） 1）灼燒接種環(huán)； 2）接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物 3）在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng) 基上劃線。 劃線的方法很多，但無論采用那種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落,2、涂布分離法,1) 稀

7、釋菌液 （10-5 10-7倍） 用無菌吸管吸取1ml細(xì)菌培養(yǎng)液加入另一個(gè)盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此制成10-1倍的稀釋液。 3) 涂布 用無菌吸管取0.1ml稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上。再將玻璃刮刀放在酒精燈火焰上灼燒，待刮刀冷卻后，在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個(gè)平面上。 4) 培養(yǎng) 將培養(yǎng)皿倒置，在37恒溫箱中培養(yǎng)2448h,1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的,2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實(shí)

8、驗(yàn)操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒,思考,四、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 1、大腸桿菌 （1）特性： 革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌 （2）用途： 基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具 2、培養(yǎng)： LB液體培養(yǎng)基 擴(kuò)大培養(yǎng) LB固體培養(yǎng)基 分離,3、分離,培養(yǎng)基滅菌,將LB液體和固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌,將滅菌后冷卻到60的LB固體培養(yǎng)基倒入滅菌過的培養(yǎng)皿中，制作平面培養(yǎng)基,將大腸桿菌從斜面接種到LB液體培養(yǎng)基中，然后在37搖床中震蕩培養(yǎng)12h,用接種環(huán)取震蕩培養(yǎng)后的菌液，并在固體培養(yǎng)基上劃線，然后將劃線后的培養(yǎng)皿倒置與37的恒

9、溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1224h，觀察劃線末端的菌落生長(zhǎng)情況,用接種環(huán)取單菌落，用劃線法接種于斜面上，在37的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再放入4的冰箱中保存,倒平板技術(shù),微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),菌種的保存 接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4冰箱保存,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60 左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度,思考,可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可進(jìn)行倒平板了,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰,通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基,3.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么,空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么,操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染