小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較

1、小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較及電泳法測定蛋白含量 一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握利用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)小麥的方法；2.了解酶的制備及活力測定的一般原理與方法；3.掌握淀粉酶的活力測定技術(shù)，了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化；4.鞏固對721或722S型分光光度計和離心機(jī)的熟練使用；5.靈活運(yùn)用3，5-二硝基水楊酸比色法測定樣品中還原糖含量的原理和方法；6.掌握SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳法；二.實(shí)驗(yàn)原理種子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在。淀粉酶是一種水解酶，它能使淀粉水解為麥芽糖，催化反應(yīng)為：2（C6H10O5）+n H2O-n C12H22O11麥芽糖具有還原性，與3，5-二硝基水楊酸在供熱的條件下

2、生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，棕色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比，因此可利用比色法測定還原糖的量。休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌發(fā)后，酶活力逐漸增強(qiáng)，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長而增加。三.實(shí)驗(yàn)步驟1.種子發(fā)芽小麥種子浸泡2.5h后，放入25恒溫箱內(nèi)發(fā)芽。2.酶液提取取發(fā)芽第三天或者第四天的幼苗8株，放入研缽中，加入石英砂少許，加入PH6.8磷酸鹽緩沖液10ml，研磨至勻漿狀。在室溫下靜置20min，攪拌幾次。提取液1500rpm離心7min。上清倒入量筒，測定酶提取液總體積，并將酶液稀釋10倍。取干燥種子或者浸泡2.5h后的種子8粒作為對照，步驟同上。3.SDS-PA

3、GE聚丙烯酰胺電泳法測定蛋白條帶。4.酶活力的測定（1）取大試管6支，按照下表加入各試劑（1）取大試管6支，按照下表加入各試劑將各試管搖勻，放入37水浴鍋中保溫3min，立即向各試管中加入DNS試劑2ml。（2）取出各管，放入沸水浴中加熱5min，流水冷卻至室溫，加水稀釋至25mL，充分混勻后1:1稀釋。用空白管做對照，在520nm處測定各管OD值，并對3和4、5和6管分別取平均值作為萌發(fā)前和萌發(fā)后的OD值。四.計算 根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，即 A標(biāo)準(zhǔn)/A未知=C標(biāo)準(zhǔn)/C未知 可推導(dǎo)出C酶液=A酶液/A標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)8粒的總活力=C酶n酶V酶A為光吸收值；C酶=酶液管的麥芽糖濃度;n

4、酶=酶液稀釋倍數(shù);V酶=提取酶液總體積。五蛋白質(zhì)濃度測定-考馬斯亮藍(lán)G250染色法蛋白質(zhì)定量測定溶液 0管 酶液（萌發(fā)前） 酶液（萌發(fā)后）蛋白液/mL - 0.1 0.10.9%生理鹽水/mL 1.0 0.9 0.9蛋白質(zhì)染色液/mL 5.0 5.0 5.0輕輕搖勻，5min后以0管調(diào)空白，595nm分光光度法測光密度值。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）酶活力的測定萌發(fā)前萌發(fā)后酶提取液總體積9ml8ml酶液最終稀釋后測定的小麥萌發(fā)前與萌發(fā)后的OD值空白標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)前萌發(fā)后123456OD值0.2480.2170.1850.6120.669平均值0.2480.2010.641n酶=10（25/0.5）2=1000

5、 ，A標(biāo)準(zhǔn)=0.248，C標(biāo)準(zhǔn)=0.001%，1、 萌發(fā)前：A酶液=0.201， V酶=9.0mlC酶液=A酶液/A標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)=0.201/0.2480.001%8粒的總活力=C酶n酶V酶=0.07292、萌發(fā)后：A酶液=0.641， V酶,=8.0ml，C酶液=A酶液/A標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)=0.641/0.2480.001%8粒的總活力=C酶n酶V酶=0.207（2）蛋白質(zhì)濃度的測定 萌發(fā)前萌發(fā)后1234OD值0.1040.1210.0640.128平均值0.1130.096小麥萌發(fā)前：A蛋白質(zhì)=0.113由標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.0081X 0.0515，R2=0.9842可知，x為20.3086，由于酶液被稀釋了10倍，所以，蛋白質(zhì)濃度為203.086g/ ml。小麥萌發(fā)后：A蛋白質(zhì)=0.096由標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.0081X 0.0515，R2=0.9842可知，x為 18.2099，由于酶液被稀釋了10倍，所以，蛋白質(zhì)濃度為182.099g/ ml。七、討論由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出小麥萌芽后淀粉酶的活力會比萌芽前明顯增強(qiáng)，小麥種子在萌發(fā)過程中淀粉酶活力升高，淀粉被大量水解為小分子糖，那么就可以提供較多的能量供應(yīng)萌發(fā)時候的細(xì)胞分裂以及細(xì)胞生長使用，同時還能夠?yàn)榧?xì)胞的生命活動提供原料，能夠更快地將儲存的有機(jī)物中的能量釋放出來，保