EMSA試驗(yàn)成功的關(guān)鍵講義(doc7頁(yè))(正式版)

1、EMSA 試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素:1.1. 試驗(yàn)設(shè)計(jì) , 主要是你用藥品刺激細(xì)胞時(shí) ,設(shè)計(jì)的藥品濃度和時(shí)間剃度的問(wèn)題 ,這個(gè)很關(guān)鍵 , 很多同學(xué)不注意這一點(diǎn) ,最后試驗(yàn)確實(shí)是拿不到陽(yáng)性結(jié)果 ,比如我一前一個(gè)朋友用藥物處理SGC7901 細(xì)胞 ,就是因?yàn)闀r(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)的不好 EMSA 試驗(yàn)結(jié)果是陰性的 ,后來(lái)根據(jù)自己藥品刺激的特性重新設(shè)計(jì)了刺激時(shí)間剃度 ,最終得到陽(yáng)性結(jié)果 ! 所以這個(gè)設(shè)計(jì)很關(guān)鍵 !給一個(gè)個(gè)人的實(shí)驗(yàn)總結(jié)希望能幫助大家: 一是受體結(jié)合類的直接刺激激活信號(hào)通路的方法，一般達(dá)到EMSA 核轉(zhuǎn)運(yùn)高峰的時(shí)間比較短，大概控制在30min-2h 之間，很多時(shí)候都是在45min 和 1h 達(dá)到高峰， 當(dāng)

2、然還有合適的濃度！二是是你用的是藥物刺激產(chǎn)生受體可能時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些,因?yàn)樗幬镞€有一個(gè)滲透和刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的過(guò)程.時(shí)間可以長(zhǎng)一些 , 主要根據(jù)自己的藥物刺激特性確定時(shí)間點(diǎn).2. 核蛋白樣品的制備 ;制備蛋白樣品的關(guān)鍵是:1. 注意用專用的和核蛋白抽提試劑來(lái)做,才能使制備的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和構(gòu)像.2. 掌握好核蛋白的濃度和純度 ,尤其是濃度 . 能入核的蛋白本來(lái)就不是很多, 所以核蛋白的濃度往往不會(huì)很高 ,但是EMSA 試驗(yàn)對(duì)核蛋白的濃度要求還是聽(tīng)高的! 一般要求在1ug/ul 以上 ! 有時(shí)候稍微低于這個(gè)數(shù)量級(jí)也可以,但是不能太低 ,否則影響結(jié)合反應(yīng)拿不到結(jié)果. 這就要求核蛋白抽提盡

3、量避免核蛋白的損失.同時(shí) ,一般制備核蛋白的材料為細(xì)胞和組織, 細(xì)胞要比組織好做的多,最重要的是用細(xì)胞得到核蛋白的純度比組織要高很多. 而組織抽提后雜蛋白相對(duì)較多 !雜蛋白多會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果不容易得到EMSA 陽(yáng)性結(jié)果 !3. 探針的制備 :又很多站友都在問(wèn)我生物素標(biāo)記到3端還是5端 ,其實(shí)我覺(jué)得最好還是兩端都標(biāo)記 ,這樣才能更好的提高靈敏度, 國(guó)內(nèi)的標(biāo)記技術(shù)我還不是很了解,我們這邊的探真都是國(guó)外定做的 ,還算可以 ,其制作程序如下 : 合成寡核苷酸 - 標(biāo)記生物素 - 純化 - 退火合成雙鏈 .也是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程 .4.EMSA 實(shí)驗(yàn)技術(shù) . 這一點(diǎn)主要是操作的細(xì)節(jié)問(wèn)題! 下面會(huì)更細(xì)的談到

4、.技術(shù)要點(diǎn) :關(guān)于技術(shù)要點(diǎn) ,我在這里只提一下關(guān)鍵的幾點(diǎn)需要注意的細(xì)節(jié)操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制膠 必須是非變性 PAGE凝膠 ,我們實(shí)驗(yàn)室一般用 6.5% 的非變性膠 .制膠很重要 ,直接影響電泳的效果 !一般控制在 5 分鐘凝固的效果 .10X TBE 1.0ml40% Acrylamide （40% 聚丙烯酰胺）3.3ml50% Glycerol （ 50% 甘油）1.0mldH2O （蒸餾水）14.8mlTEMED（四甲基乙二氨）20 l脫氣 10min10% AP （過(guò)硫酸氨）120 l總量 20.0ml2. 一般試劑盒包括的試劑l 10X Binding Buffer

5、（10X結(jié)合反應(yīng)液） (-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸競(jìng)爭(zhēng)物） (-20 oC)l 6X Loading Buffer（ 10X上樣緩沖液） (4 oC)l Cold oligonucleotides（非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性寡核苷酸）(-20 oC)l Biotin-Labeled Probe（生物素標(biāo)記探針）(-20 oC)l Streptavidin-HRP （鏈霉親核素 -HRP） (4oC)l 2Blocking Buffer （ 2 封閉液） (4 oC)l 5Washing Buffer （ 5 洗滌液） (4 oC)l Equilibration So

6、lution（平衡液） (4 oC)l Binding-membrane（結(jié)合反應(yīng)膜） (RT)3. 結(jié)合反應(yīng)每次結(jié)合反應(yīng)需1-5 l核蛋白 ( 根據(jù)核蛋白濃度而定) ，根據(jù)不同的核提取物濃度加入核提取物用量，用雙蒸蒸餾水將終體積調(diào)節(jié)到15l（ 1 ） 結(jié)合反應(yīng)體系：10X 結(jié)合反應(yīng)液1.5 lPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0 l細(xì)胞核提取物 * ?l雙蒸水 * ?l混勻室溫靜置20 分鐘生物素標(biāo)記的探針0.5 l總量 15l混勻室溫靜置20 分鐘或以上。（ 2 ）特異性反應(yīng)確認(rèn)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系：10X 結(jié)合反應(yīng)液1.5 lPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0 l細(xì)胞核提取物?

7、 l未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性寡核2.0 l雙蒸水 * ?l混勻室溫靜置20 分鐘生物素標(biāo)記的探針0.5 l總量 15l混勻室溫靜置20 分鐘或以上。其中 :探針用量 : 這相當(dāng)于 10-50fmoles 的 DNA 探針。我們通常是最少50fmol.蛋白樣品用量 : 一般用量在2-20ug( 控制在 1-5 l)蛋白 , 總體系 15ul.細(xì)胞核抽屜物濃度都比較低,組織的一般都比較高,因?yàn)殡s蛋白較多 .poly(dI:dC)(dI:dC):它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結(jié)構(gòu)， 可抑制蛋白對(duì)標(biāo)記探針的非特異結(jié)合，避免假?gòu)?fù)合物。在凝膠遷移反應(yīng)中加入 poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提

8、液中其它DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的非特異結(jié)合。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí)，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過(guò) 50-100ng 。對(duì)核 抽提液 : 每 2-3ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性寡核: 做為競(jìng)爭(zhēng)的探真來(lái)說(shuō),其實(shí)就是沒(méi)有標(biāo)記的轉(zhuǎn)爐銀子的寡核苷酸 ,用量一般是正常探真的50-100 倍. 再這里我引申的解釋一下其他的對(duì)照的含義: . 常規(guī)反應(yīng) (含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針)； 陰性對(duì)照反應(yīng) ( 核蛋白標(biāo)記探針 ); 陽(yáng)性對(duì)照 ( 核蛋白標(biāo)記探針 ) 探針冷競(jìng)爭(zhēng)

9、反應(yīng) (含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記探針 100 倍量的未標(biāo)記探針 )； 突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng) ( 含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的 核蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記探針 100 倍量的未標(biāo)記突變探針 )； Super-shift 反應(yīng) ( 含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體 ).4. 預(yù)電泳和電泳： 0.25X TBE 在冰上 120V 預(yù)電泳 1 小時(shí) ; 務(wù)必?fù)Q掉預(yù)電泳的緩沖液 , 用新的 0.25X TB 低溫下 150V，電泳約 60 分鐘。 注意橫壓電泳的時(shí)候注意電流的數(shù)字變化 ,記錄開(kāi)始電泳和電泳結(jié)束的電流數(shù)據(jù)的變化 !5. 電轉(zhuǎn)運(yùn)在 0.5X TBE 中 390mA

10、 電轉(zhuǎn)移 40 分鐘 , 注意轉(zhuǎn)運(yùn)膜的選擇 , 有一種離子加強(qiáng)型的轉(zhuǎn)運(yùn)效果比較好 ! 我當(dāng)初選擇過(guò)一般的和離子加強(qiáng)型的 ,還是離子加強(qiáng)型結(jié)合效果好 !6. 紫外交聯(lián) : 正規(guī)的應(yīng)該是紫外交聯(lián)儀的使用 ,但是很多單位沒(méi)有交聯(lián)儀 ,那就用無(wú)菌操作臺(tái)上的紫外等下10cm 處交聯(lián) 10 分鐘就可以了 ! 這個(gè)數(shù)據(jù)是我做了好多次試驗(yàn)才摸索出來(lái)的!條件比較成熟 !可以借鑒 !7. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括 Blocking Buffer 30 分鐘封閉 , Streptavidin-HRP 標(biāo)記 , Washing Buffer 洗滌 ; Equilibration Solution 平衡 , 這些按照規(guī)定操作即

11、可 ! 沒(méi)有太多的細(xì)節(jié) , 只 是 注 意 兩 點(diǎn) , 一 是 期 間 結(jié) 合 膜 的 表 面 一 定 不 能 干 燥 ! 二 是Streptavidin-HRP 不能加在膜上 ,而是加在液體中混韻后在將膜放在液體中孵浴 .8. 化學(xué)發(fā)光圖像顯示兩種方法 :化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像與檢測(cè)和感光膠片沖印成像操作基本和 Western試驗(yàn)操作相當(dāng) , 只是這個(gè)膜是一次性的,不能重復(fù)使用 , 一定保存好圖片 !由于跑得是非變性凝膠 ,蛋白保持天然構(gòu)想和活性 ,所以代條很可能是一塊一塊的而不像WB 那樣很規(guī)整的一條細(xì)線,這個(gè)很正常 !希望大家交流討論 !人生最大的幸福，莫過(guò)于連一分鐘都無(wú)法休息零碎的時(shí)間實(shí)在可

12、以成就大事業(yè)珍惜時(shí)間可以使生命變的更有價(jià)值時(shí)間象奔騰澎湃的急湍，它一去無(wú)返，毫不流連一個(gè)人越知道時(shí)間的價(jià)值，就越感到失時(shí)的痛苦得到時(shí)間，就是得到一切用經(jīng)濟(jì)學(xué)的眼光來(lái)看，時(shí)間就是一種財(cái)富時(shí)間一點(diǎn)一滴凋謝，猶如蠟燭漫漫燃盡我總是感覺(jué)到時(shí)間的巨輪在我背后奔馳，日益迫近夜晚給老人帶來(lái)平靜，給年輕人帶來(lái)希望不浪費(fèi)時(shí)間，每時(shí)每刻都做些有用的事，戒掉一切不必要的行為時(shí)間乃是萬(wàn)物中最寶貴的東西，但如果浪費(fèi)了，那就是最大的浪費(fèi)我的產(chǎn)業(yè)多么美，多么廣，多么寬，時(shí)間是我的財(cái)產(chǎn)，我的田地是時(shí)間時(shí)間就是性命，無(wú)端的空耗別人的時(shí)間，知識(shí)是取之不盡，用之不竭的。只有最大限度地挖掘它，才能體會(huì)到學(xué)習(xí)的樂(lè)趣。新想法常常瞬息即逝，必須集中精力，牢記在心，及時(shí)捕獲。每天早晨睜開(kāi)眼睛，深吸一口氣，給自己一個(gè)微笑，然后說(shuō)：“在這美妙的一天，我又要獲得多少知識(shí)??！” 不要為這個(gè)世界而驚嘆，要讓這個(gè)世界為你而驚嘆！如果說(shuō)學(xué)習(xí)有捷徑可走，那也一