島津LC-10AT型HPLC操作規(guī)程推薦

1、1,第一節(jié) 島津LC-10AT型HPLC操作規(guī)程,2,目的:規(guī)范島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。 范圍:適用于島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。 職責(zé):操作員對本規(guī)程的實施負責(zé),3,一、 系統(tǒng)組成,本系統(tǒng)由1個LC-10ATvp溶劑輸送泵、Rheodyne 7725i手動進樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機,4,二、 準備,1 、準備所需的流動相，用合適的0.45m濾膜過濾，超聲脫氣20min。 2 、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的色譜柱（注意方向）和定量環(huán)。 3、 配制樣品和標準溶液，用合適的0.45m濾膜過濾。（

2、注意腐蝕性與有機系的的溶劑） 4 、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常,5,接通電源，依次開啟不間斷電源、 泵、檢測器，待泵和檢測器自檢結(jié)束后，打開打印機、電腦顯示器、主機，最后打開色譜工作站,三、 開機,6,四、 參數(shù)設(shè)定,1、 波長設(shè)定：在檢測器顯示初始屏幕時，按func鍵1次，波長數(shù)字鍵閃動，輸入所需波長值，按Enter鍵確認。按CE鍵退出到初始屏幕。 2 、流速設(shè)定：在泵顯示初始屏幕時，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（流速一般為超過1ml/min），按Enter鍵確認。按CE鍵退出,7,五、 更換流動相并排氣泡,1： 將管路的吸濾器放入裝有準備好的流動相的儲液瓶

3、中； 2 ：逆時針轉(zhuǎn)動泵的排液閥180，打開排液閥； 3 ：按泵的purge鍵，pump指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的高流速沖洗，3min（可設(shè)定）后自動停止，一般視管路無氣泡即可。 4 ：將排液閥順時針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。 5 ：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。 6 ：如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設(shè)流速為5ml/min，按pump鍵，沖洗3min后再按pump鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值,8,六、 平衡系統(tǒng),1、查看基線： 1.1：按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開“在線色譜工作站”軟件， 1.2：輸入實驗信息并設(shè)定各項

4、方法參數(shù)后， 1.3：按下“數(shù)據(jù)收集”頁的 按鈕,9,六、 平衡系統(tǒng),2 、 2.1 ：按泵的pump鍵，泵啟動，pump指示燈亮。用檢驗方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動相。 2.2 ：檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。 2.3 ：觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。 2.4 ：觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲為0.001mV時，可認為系統(tǒng)已達到平衡狀態(tài)，可以進樣,10,七、 進樣,1 、進樣前按檢測器zero鍵調(diào)零，按軟件中 零點校正 按鈕校正基線零點，再按一下

5、查看基線 按鈕使其彈起。 2 、用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量即可以進樣了。 3、含量測定的對照溶液和樣品供試溶液每份至少進樣2次,11,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計算,系統(tǒng)適用性實驗：三個重要指標 分離度（加強）：一般應(yīng)1.5。 重復(fù)性：兩次譜圖的峰面積應(yīng)相差不超過1%。 理論塔板數(shù)：應(yīng)規(guī)定的理論塔板數(shù)目。 拖尾因子：0.95T1.05 保留時間：對照與樣品的主成分保留時間應(yīng)大致一致。 RSD： 3,12,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計算,1、內(nèi)標法 用含對照品和內(nèi)標物質(zhì)的對照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式算出校正因子（f）： 其中 As和Ar分別為內(nèi)標物質(zhì)和對照品的峰面積或峰高，ms和

6、mr分別為加入內(nèi)標物質(zhì)和對照品的量,13,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計算,2、外標法： 用含對照品的對照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計算比值（r）：r=mr/Ar（其中 mr和Ar分別為對照品的量和相應(yīng)的峰面積或峰高。 ） 再根據(jù)供試品溶液的色譜峰響應(yīng)值，計算供試品中被測成分的含量（mi）：mi=rAi（其中 Ai為供試品溶液中被測成分的峰面積或峰高）。 必要時，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標示量折算成標示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量折算成百分含量,14,九、 清洗管路及進樣口,1、分析完畢后，先關(guān)檢測器和數(shù)據(jù)處理機，再用經(jīng)濾過和脫氣的適當溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用過

7、含鹽流動相，則先用水，然后用甲醇-水沖洗，沖洗前先按（4.1.14.1.2）操作，再用分析流速沖洗，各種沖洗劑一般沖洗1530分鐘，特殊情況應(yīng)延長沖洗時間；并且用水沖洗密封圈三次,15,九、 清洗管路及進樣口,2、 沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可使用進樣閥所附專用沖洗接頭。 3 、關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動相、柱壓，使用小時數(shù)，儀器完好狀態(tài)等,16,特殊情況】：譜流路系統(tǒng)，從泵、進樣器、色譜柱、到檢測器通池，在分析完畢后，均應(yīng)按（5.1）充分沖洗，特別是用過含鹽流動相的，更應(yīng)注意先用水，再用甲醇-水，充分沖洗,九、 清洗管路及進樣

8、口,17,謝謝大家,18,第二節(jié) 島津LC-10AT型HPLC注意事項,19,一、 流動相,1、流動相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍； 2、水相流動相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì),20,二、樣品,1、采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒； 2、用流動相或比流動相弱（若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤海M量用流動相制備樣品液； 3、手動進樣時，進樣量盡量小，使用定量管定量時，進樣體積應(yīng)為定量管的35倍,21,三、色譜柱,1、 使用前仔細閱讀色譜柱附帶的說

9、明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動相類型等； 2、 使用符合要求的流動相； 3、 使用保護柱； 4、 如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇沖洗,22,三、 色譜柱,5、 色譜柱在不使用時，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存； 6、 不要高壓沖洗柱子； 7、 不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱； 使用過程中注意輕拿輕放,23,四、操作過程,1、 開機操作： （1）、打開電源，用Harb相連接時，注意Harb電源，打開計算機，打開Bootp Server（一般啟動時已打開）； （ 2 ）、自上而下打開個組件電源，Bootp Serv

10、er里顯示有信號時（有六行字符），打開工作站（先打開On line）； （3）、打開沖洗泵頭的10異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準,24,四、 操作過程,4 ）、注意各流動相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會自動停泵，注意洗泵溶液的體積，及時加液； （ 5 ）、使用過程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時正確處理各種突發(fā)事件,25,四、 操作過程,2、 先以所用流動相沖洗系統(tǒng)一定時間（如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相），正式進樣分析前30min 左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命； 3、 建立色譜操作方法，注意保存

11、為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實驗結(jié)果,26,四、 操作過程,4、 使用手動進樣器進樣時，在進樣前和進樣后都需用洗針液洗凈進樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進樣前必須用樣品液清洗進樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡； 5、 溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護，當發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌,27,四、操作過程,6、 實驗結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過程中關(guān)閉D燈、W燈； 7、 關(guān)機時，先關(guān)閉泵、檢測器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組

12、件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān),28,四、操作過程,8、 使用者須認真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問題及時向老師報告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器,29,自己總結(jié)的12條注意事項,以下12條注意事項是自己在安裝和使用液相色譜儀中的經(jīng)驗得出的，可能存在某些片面性，如有不當之處請多提寶貴建議,30,1、流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細的膜過濾)。 2、流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用,31,3、不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進液。 4、使用緩沖溶液時，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管

13、路及柱子一小時，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上,32,5.長時間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉。 6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑(如甲醇)等清洗進樣器,33,7.C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。 8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過濾器管路過濾器單向閥檢查 并清洗。 清洗方法：以異丙醇作溶劑沖洗；放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10稀硝酸清洗,34,9.氣泡會致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量

14、避免產(chǎn)生氣泡。 10.如果進液管內(nèi)不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相 的清洗,35,11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。 12.更換流動相時應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊清洗，然后插入新的 流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下,36,謝謝大家,37,第三節(jié) 高效液相色譜中常遇見的問題及處理方法,38,一、 保留時間變化,1.柱溫變化 2.等度與梯度間未能充分平衡 3.緩沖液容量不夠 4.柱污染 5.柱內(nèi)條件變化 6.柱快達到壽命,1.柱恒溫 2.至少用10倍柱體積的流動相平衡柱 3.用25mmol/L的緩沖液 4.每天沖

15、洗柱 5.穩(wěn)定進樣條件,調(diào)節(jié)流動相 6.采用保護柱,39,二、 保留時間縮短,1.流速增加 2.樣品超載 3.鍵合相流失 4.流動相組成變化 5.溫度增加,1.檢查泵,重新設(shè)定流速 2.降低樣品量 3.流動相PH值保持在37.5檢查柱的方向 4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀 5.柱恒溫,40,三、 保留時間延長,1.流速下降 2.硅膠柱上活性點變化 3.鍵合相流失 4.流動相組成變化 5.溫度降低,1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡 2.用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱 3.流動相PH值保持在37.5檢查柱的方向 4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀 5.柱恒溫,41,四、 出現(xiàn)肩峰或分叉,1.

16、樣品體積過大 2.樣品溶劑過強 3.柱塌陷或形成短路通道 4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 5.進樣器損壞,1.用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% 2.采用較弱的樣品溶劑 3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品 5.更換進樣器轉(zhuǎn)子,42,五、 鬼峰,1.進樣閥殘余峰 2.樣品中未知物 3.柱未平衡 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 5.水污染(反相,1.每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗 2.處理樣品 3.重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜) 4.每天新配,用抗氧化劑 5.通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水,43,六、

17、 基線噪聲,1.氣泡(尖銳峰) 2.污染(隨機噪聲) 3.檢測器燈連續(xù)噪聲 4.電干擾(偶然噪聲) 5.檢測器中有氣泡,1.流動相脫氣,加柱后背壓 2.清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑 3.更換氘燈 4.采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等) 5.流動相脫氣,加柱后背壓,44,七、 峰拖尾,1.柱超載 2.峰干擾 3.硅羥基作用 4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 5.柱塌陷或形成短路通道 6.死體積或柱外體積過大 7.柱效下降,1.降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相 2.清潔樣品,調(diào)整流動相 3.加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品 4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品 5.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 6.連接點降至最低,對所有連接點作合適調(diào)整,盡可能采用細內(nèi)徑的連接管 7.用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱,45,八、峰展寬,1.進樣體積過大