基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究.ppt

1、研究背景,子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs），是婦科常見疾病之一，組織學上雖然是良性的，但卻有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等惡性生物學行為。藥物及手術(shù)治療復發(fā)率均高。究其原因主要是EMs的病因及發(fā)病機制尚未完全明了,自1921年Sampson首先提出子宮內(nèi)膜種植學說以來，在EMs眾多的病因及發(fā)病機制中，種植學說雖被大多數(shù)學者所接受，但它無法解釋盆腔外EMs的發(fā)生，也無法解釋多數(shù)育齡婦女存在經(jīng)血逆流，但僅少數(shù)（10%-15%）發(fā)病,越來越多的研究表明EMs與高血壓、糖尿病、精神分裂癥等一大類疾病一樣被認為受多基因遺傳及多因素的影響?，F(xiàn)今的研究表明，子宮內(nèi)膜碎片必須通過粘附、侵襲及血管

2、形成，方可以生存、生長。這一過程的完成是由在位內(nèi)膜的不同生物學特征，即基因差異決定的,因此，當前的研究重點在于尋 找和鑒定EMs相關(guān)的遺傳基因,PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，是繼P53基因之后發(fā)現(xiàn)的在人類腫瘤中突變率最高的基因。也是子宮內(nèi)膜腺癌中發(fā)現(xiàn)的突變率最高的基因，被認為是子宮內(nèi)膜的“看家基因” 。研究發(fā)現(xiàn)PTEN與子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病如EMs的發(fā)病密切相關(guān),PTEN通過調(diào)控細胞周期，抑制細胞分化,抑制細胞粘附和遷移，誘導凋亡等參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

3、內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜可能因抑癌基因PTEN失活而表現(xiàn)出與正常內(nèi)膜不同的生物學特性,如細胞粘附增強，凋亡減少，血管形成能力增強，從而容易在異位部位存活并生長，繼而引起相應(yīng)的癥狀和體征,PTEN基因突變、雜合性缺失及多態(tài)性 改變與多種腫瘤如食道癌、膀胱癌等的發(fā)病密切相關(guān)。其基因突變、雜合性缺失與EMS的相關(guān)性研究報道也較多，而PTEN多態(tài)性與EMS的相關(guān)性研究才處于探索階段,PTEN-9C/G (以下簡讀為-9C/G）單核苷酸多態(tài)性(SNP)及 PTENS4-/+（以下簡讀為IVS4-/+)為PTEN基因最常見的兩個多態(tài)性位點，此兩個位點多態(tài)性的改變與食道癌、鼻咽癌的相關(guān)性研究已見報道。國內(nèi)外目前尚

4、無此兩個位點多態(tài)性的改變與EMs的相關(guān)性研究報道,PTEN-9C/G SNP位于PTEN翻譯起始點上游的第9位核苷酸處，CG的替換使得G周期性地出現(xiàn) ，它非常接近翻譯時使核糖體停留在閱讀框架內(nèi)的交感序列，因此CG的替換可能影響PTEN的表達。 PTENS4-/+為第4內(nèi)含子的一個插入性多態(tài)，可能通過不同剪切及通過與其它位點連鎖來影響其基因表達,本研究首次采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性 片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)對PTEN -9C/G及IVS4-/+基因進行

5、分型，旨在探討此兩個位點的多態(tài)性與EMs 的關(guān)系,材 料 與 方 法,主要實驗儀器及設(shè)備 名稱 型號 生產(chǎn)廠家 潔凈工作臺 上海力申科學儀器有限公司 高速離心機 TG19A.WS 美國BECKMAN公司 低溫離心機 TGL-16H 珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司 普通冰箱 BCD-130H 青島海爾股份有限公司 電子天平 PB3002-S 瑞士Mettler公司 PCR擴增儀 PTC一200 美國MJReseareh公司 Eppendorf移液器 0.1-1000ul 德國Eppendorf公司 紫外掃描儀 GelDoe1000 美國BioRad公司 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 DYY-III3 北京市六一儀器

6、廠 電泳槽 Sub一CellModel96 美國BioRad公司 凝膠成像分析儀 AlphaImagerTM2200 美國Alpha Innotech公司,主要實驗試劑 試劑名稱 生產(chǎn)廠商 全血基因組DNA提取試劑盒 北京博大泰克公司 引物合成 上海生工 DNA膠回收試劑盒 北京博大泰克公司 PCR純化試劑盒 上海生工 蛋白酶K (Germany)Merck公司 限制性內(nèi)切酶AflII New England Biolabs 限制性內(nèi)切酶DraII New England Biolabs 100bp DNA ladder 華美生物工程公司,研究對象,EMs組： 86人，無腫瘤性及遺傳性疾病病史

7、，術(shù)后病檢證實為子宮內(nèi)膜異位癥的患者。 對照組： 64人，同期因輸卵管阻塞繼發(fā)不孕、 宮外孕及子宮脫垂等手術(shù)，術(shù)后病檢排除EMs，且無腫瘤性及遺傳性疾病病史的患者,標本采集,采集每位研究個體的外周血3ml，EDTA抗凝，置4冰箱保存，并于采血后1周內(nèi)提取符合條件的研究對象的外周血白細胞DNA,DNA的提取,用微量全血基因組DNA提取試劑盒，提取全基因組DNA,100l裂解液 20lRNaseA/蛋白酶K ， 55溫浴30min,12000 rpm離心1min， 棄盡上清 ,100lTE,10000 rpm離心1.5min, 棄上清,300l 紅細胞裂解液,300l 抗凝全血 等體積紅細胞裂解液

8、,加入10l3MnaAC、 1250l結(jié)合緩沖液 加入600l漂洗液,加入30l ddH2O洗脫， -20保存24小時 將所提DNA進行Agarose電泳泳,PTEN的基因分型,采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進行基因分型,PTEN IVS4-/+引物: 上游引物：5-GGG GGT GAT AAC AGT ATC TA-3 下游引物：5-CTT TAT GCA ATA CTT TTT CCT A-3,PCR反應(yīng)體系,72延伸1min,58退火45s,94變性30s,94預變性5min,35個循環(huán)后， 72繼續(xù)延伸5min,PCR反應(yīng)條件,擴增產(chǎn)物為 403bp,

9、PTEN IVS4-/+ PCR產(chǎn)物酶切電泳后判斷基因型,純化PCR產(chǎn)物10l 經(jīng)限制性內(nèi)切酶 AflII (2l) 于37酶切過夜,行2.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀下觀 察判斷基因型,/-純合型顯示403bp 一條電泳帶， +/+純合型顯示335bp和73bp 兩條電泳帶， -/+雜合型顯示403bp、335bp和73bp 三條電泳帶,PTEN -9C/G 引物為: 上游引物：5-GCA GCC GTT CGG AGG ATT-3 下游引物：5-GCCGCAGAA,ATG GAT ACA GG-3,PTEN -9C/G PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同擴增PTEN IVS4-/+,PTEN -

10、9C/G PCR產(chǎn)物 酶切電泳后判斷基因型,純化PCR產(chǎn)物10l 經(jīng)限制性內(nèi)切酶 DraII (10l) 于37酶切過夜,行2.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀下觀 察判斷基因型,C/C純合型顯示371bp的 一條電泳帶 G/G純合型顯示266bp和105bp 兩條電泳帶 C/G雜合型顯示371bp、266bp和105bp 三條電泳帶,統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 比較基因型頻率的觀察值與預期值，并進行卡方檢驗行Hardy-Weinberg平衡分析。病例組與對照組的基因型及等位基因分布采用卡方檢驗，用OR值及其95%可信區(qū)間，分析PTEN -

11、9C/G、IVS4-/+ 多態(tài)性與EMs的關(guān)系,結(jié) 果,一. 研究對象的一般特征： 1. 平均年齡 EMS組：35.47.69歲 對照組： 35.612.24歲 兩組比較，平均年齡差異無統(tǒng)計學意義(t=0.122,P0.05,2. 家族史 EMs陽性家族史， EMs組為24.4% ，對照 組僅10.9% ，兩者相比有統(tǒng)計學意義 (2=4.392,P0.05) 。 EMs陽性家族史明顯增加EMs的發(fā)病風險， OR值2.6308（95%CI=0.8117-5.1771,二.PTEN基因S4 - /+擴增產(chǎn)物Afl酶切電泳結(jié)果 PTEN S4 - /-純合型產(chǎn)生403bp 一條電泳帶 PTEN S4

12、+ /+純合型產(chǎn)生335bp和 73bp 兩條電泳帶 PTEN S4 - /+雜合型產(chǎn)生403b、335bp、 73bp三條電泳帶,Fig.1 Genotype pattern for PTEN IVS4(-/+)polymorphism analyzed by PCR-AflII digestion. Lane 1:+/+homozygous genotype, Lane 2:-/-homozygous genotype, Lane 3，4，5,and 6:-/+heterozygous genotype,三. PTEN基因-9C/G 擴增產(chǎn)物DraII酶切電泳結(jié)果: C/C純合型產(chǎn)生371

13、bp的一條電泳帶 G/G純合型產(chǎn)生266bp和105bp兩條電泳帶 C/G雜合型產(chǎn)生371bp、266bp和105bp 三條電泳帶,Fig.2 Genotype pattern for PTEN -9C/G polymorphism analyzed by PCR-DraII digestion. Lane 1, 4 and 6: C/G heterozygous genotype, Lane 2 and 3: G/G homozygous genotype, Lane 5: C/C homozygous genotype,四.PTEN IVS4-/+多態(tài)位點的基因型分布,Table 2. P

14、TEN -9C/G Genotype Hardy-Weinbery examination in two Groups,五.PTEN-9C/G多態(tài)位點的基因型分布,六.PTEN-9C/G 基因型分布與EMs的發(fā)病風險,七.PTEN IVS4-/+基因型分布與EMs 的發(fā)病風險,八.PTEN單體型與EMs的發(fā)病風險,討 論,一.研究對象的一般特征 1. 平均年齡 EMS組：35.47.69歲 對照組：35.612.24 兩組比較，平均年齡差異無統(tǒng)計學意義(t=0.122,P0.05) 說明病例組與對照組年齡分布具有可比性,2. 家族史 陽性家族史,EMs組為24.4% ，對照組為10.9%，兩者

15、相比有統(tǒng)計學意義(2=4.392,P0.05) 。 OR值2.6308（95%CI=0.8117-5.1771),說明EMs陽性家族史明顯增加EMs的發(fā)病風險 。 進一步證實了EMs的家族遺傳傾向,二.分析 PTEN基因-9C/G SNP及IVS4-/+基因型及等位基因頻率分布情況 本研究中PTEN-9C/G SNP的基因型分布在EMs病例組及對照組中均符合Hardy-Weinbery平衡，表明研究對象具有群體代表性,PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例組及對照組中均不符合Hardy-Weinbery平衡，可能的原因有：突變、選擇、隨機遺傳漂變、遷移及遺傳異質(zhì)性,本研究人群中，PTEN

16、IVS4-/+雜合型(73.5%)明顯高于另兩種類型（-/-10.9%，+/+15.6%），這是Hardy-Weinbery平衡計算中影響其遺傳平衡的主要因素，可能跟遺傳選擇中的雜合子優(yōu)勢有關(guān)，具體原因有待進一步研究,本研究對照組中-9C/G SNP的基因型分布（C/C 90.6%、C/G9.4%、 G/G 0.0%）與日本人群(C/C 95.0%,C/G 5.0%,G/G 0%)相似；而IVS4-/+多態(tài)的基因型分布（-/-10.9%、-/+73.5%、+/+15.6%）與美國人群(-/-43.1%,-/+45.7%,+/+11.2%)有顯著差別,在不同種族不同地區(qū)人群中PTEN基因的多態(tài)性

17、可能分布相似或存在差異,三.分析PTEN-9C/G基因型分布與EMS發(fā)病風險 合并PTEN-9C/G及G/G基因型與C/C基因型相比，攜帶G等位基因(C/G+G/G)不改變EMs的發(fā)病風險，與張小愛及 Ge 等分別在PTEN-9C/G多態(tài)性與鼻咽癌 及食道癌中的研究結(jié)果一樣,位于PTEN非編碼區(qū)的-9CG多態(tài)性改變可能不改變抑癌基因PTEN的功能，不增加EMs的發(fā)病風險,四.分析PTENIVS4-/+基因型分布與EMs的發(fā)病風險 在合并PTEN IVS4基因-/+和-/-后與+/+相比，病例組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05,PTENS4基因多態(tài)性中，突變型(+/+)可能降低EMs的發(fā)病風險。這與S4+/+基因型降低食管癌的發(fā)病風險的報道一致，但與IVS4+/+基因型可增加較年輕者患乳腺癌的風險的報道不同,在不同類型腫瘤中, PTEN S4多態(tài)性發(fā)揮不同的作用, 同時也存在不同人群中這一多態(tài)存在著對腫瘤易感性的差異的可能性。因此有必要在某一確定的人群中進行不同類型疾病的研究, 來評價PTEN S4多態(tài)性的作用,五.分析PTEN單體型與EMs的發(fā)病風險 在PTEN-9C/G和IVS4-/+ 構(gòu)成的單體中：-9C/IVS4-為EMs病例組中最常見 -9C/IVS4+為對照組中最常見,與對照組中最常見的單體型-9C