光合細(xì)菌研究進(jìn)展

1、光合細(xì)菌研究進(jìn)展摘 要: 光合細(xì)菌分布廣泛，本身無毒，富含蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，得到廣泛應(yīng)用。光合細(xì)菌的分子生物學(xué)研究已開展了 40 多年，在固碳和蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)研究方面取得了豐碩成果。闡述了光合細(xì)菌 cbb 操縱子固碳的分子機制和光合細(xì)菌作為新型蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展，提出了未來的研究重點，為光合細(xì)菌的綜合開發(fā)和利用提供了新思路。關(guān)鍵詞: 光合細(xì)菌; 固氮; CbbR 轉(zhuǎn)錄蛋白; 表達(dá)系統(tǒng)光合細(xì)菌分布廣泛，遍及江河、沼澤、湖泊和海洋等，具有固氮、制氫、固碳、脫硫等作用1。光合細(xì)菌生命力強，容易培養(yǎng)，生長繁殖速度快，本身無毒，富含蛋白質(zhì)、維他命、類胡蘿卜素等1-2。光合細(xì)菌發(fā)現(xiàn)于

2、 19世紀(jì) 30 年代，直到 20 世紀(jì) 70 年代才進(jìn)行了深入、廣泛的研究，極大地推動了光合細(xì)菌的研究3。目前，光合細(xì)菌在固碳和蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)等方面的研究取得了豐碩的研究成果。1 光合細(xì)菌固碳研究光合細(xì)菌生命力旺盛，能夠以好氧、厭氧和光合異養(yǎng)等多種方式生長，在其生長代謝過程中伴隨固碳作用。光合細(xì)菌對二氧化碳的固定是通過卡爾文( Calvin Benson Bassham，CBB ) 循環(huán)，即戊糖磷酸途徑實現(xiàn)1。光合細(xì)菌在自養(yǎng)生長條件下，CBB 循環(huán)中的關(guān)鍵酶可以得到誘導(dǎo)表達(dá)，如核酮糖 1 5 二磷酸羧化酶/加氧酶和磷酸核酮糖激酶。在光合異養(yǎng)條件下，二氧化碳的固定能力是不固定的，與電子受體的還

3、原勢能有關(guān)4。電子受體如二甲亞砜 DMSO 能夠抑制 CBB 循環(huán)酶的生物合成，從而失去固定二氧化碳的能力5。同時，光照強度能夠增強光合細(xì)菌固碳的能力6。光合細(xì)菌固碳對其生長和分泌有機酸以及捕光色素蛋白復(fù)合體、細(xì)菌葉綠素的生物合成都有一定的影響7。光合細(xì)菌對二氧化碳的固定受到 cbb( CBB 循環(huán)中的關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)基因) 操縱子的嚴(yán)格調(diào)控，cbb 操縱子包括cbbI和 cbbII兩個操縱子，分布在基因組的不同位置，表達(dá)受 CbbR 轉(zhuǎn)錄蛋白的激活8。cbbI操縱子編碼 CBB 循環(huán)中的關(guān)鍵酶，主要包括 cbbFI、cbbPI、cbbAI和 cbbLIcbbSI基因。cbbFI基因編碼果糖 1，6

4、 景天庚酮糖 1，7 二磷酸酶、cbbPI基因編碼磷酸核酮糖激酶、cbbAI基因編碼果糖 1，6 景天庚酮糖 1，7 二磷酸醛縮酶、cb-bLIcbbSI基因編碼核酮糖 1. 5 二磷酸羧化酶/加氧酶9。cbbII操縱子除編碼 ccbI操縱子中 cbbFI、cbbPI和cbbAI基因編碼的關(guān)鍵酶的同功酶，其中的 cbbTII基因編碼轉(zhuǎn)酮醇酶、cbbGII基因編碼甘油醛 3 磷酸脫氫酶、cbbMII基因編碼 II 型核酮糖 1. 5 二磷酸羧化酶/加氧酶亞基10。cbbI操縱子的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄蛋白 CbbR 的激活，同時也受 RegA/RegB 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中 RegA 蛋白的調(diào)控8，11。c

5、bbR 基因位于 cbbFI基因的上游，DNase I 印跡分析表明 CbbR 轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合到 cbbI操縱子啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點的 10 bp 和 70 bp 區(qū)之間。DNase I 印跡也證明了 RegA 轉(zhuǎn)錄蛋白也能結(jié)合到 cbbI操縱子啟動子區(qū)域，存在兩個 DNA 結(jié)合位點，一個位于啟動子調(diào)節(jié)區(qū)的 301 bp 和 415 bp 區(qū)域之間，另一個與 CbbR 蛋白結(jié)合位點重疊。RegA 和 CbbR 蛋白自身能夠形成四聚體，RegA 蛋白能夠促進(jìn) CbbR 蛋白與啟動子的結(jié)合，但RegA 與啟動子的結(jié)合不需要 CbbR 蛋白的參與12。研究表明，CbbR 和 RegA 蛋白對 cbbI操

6、縱子的調(diào)控需要RuBP 蛋白的參與，RuBP 能促進(jìn) CbbR 和 RegA 蛋白的相互作用和增強 CbbR 蛋白與啟動子的結(jié)合13-14，如圖1 所示。其中，CbbR、RegA 與 RuBP 蛋白共同作用才能使得 cbbI操縱子基因轉(zhuǎn)錄，在缺少 RuBP 蛋白的情況下，CbbR 和 RegA 蛋白不能調(diào)控 cbbI操縱子基因的表達(dá)。目前，常見用于固碳研究的光合細(xì)菌有類球紅細(xì)菌Rhodobacter ( R ) sphaeorides、莢 膜 紅 細(xì) 菌 Rhodobacter( R ) capsulatus 和沼澤紅假單胞菌 Rhodopseudomonas( R )palustris。R

7、sphaeorides CbbR 轉(zhuǎn)錄 蛋 白 的 大 小 約 為33. 2 KDa，R capsulatus CbbR1 和 CbbR2 轉(zhuǎn)錄蛋白的大小分別約為 31. 77 KDa 和 33. 7 KDa，R palustris CbbR轉(zhuǎn)錄蛋白的大小約為 35. 09 KDa。利用 DNAMAN 軟件分析 CbbR 序列表明 CbbR 蛋白具有相對較高的保守性，如圖 2 所示。其中，莢膜紅細(xì)菌 R capsulatus CbbR1和 CbbR2 轉(zhuǎn)錄蛋白的絕對同源性達(dá)到 36. 31%。圖中黑色框代表 RegA 蛋白 DNA 結(jié)合位點，白色框代表 CbbR 蛋白 DNA 結(jié)合位點。圖 1

8、 CbbR、RegA 蛋白對 cbbI操縱子表達(dá)的調(diào)控模式圖中 R capsulatus SB1003 1 和 R capsulatus SB1003 2 分別表示莢膜紅細(xì)菌R capsulatus SB1003 CbbR1 和 CbbR2 轉(zhuǎn)錄蛋白。圖 2 CbbR 轉(zhuǎn)錄蛋白的保守性分析cbbII操縱子的表達(dá)也受轉(zhuǎn)錄蛋白 CbbR 和 RegA 的調(diào)控，與 cbbII操縱子的調(diào)控有所不同15-16。DNase I 印跡分析表明，CbbR 轉(zhuǎn)錄蛋白的 DNA 結(jié)合位點位于 cbbII操縱子啟動子的 +38 bp 和 227 bp 區(qū)域之間，但 CbbR轉(zhuǎn)錄蛋白對 cbbII操縱子的調(diào)控能力比較

9、弱。RegA 蛋白在啟動子的 227 bp 和 1025 bp 區(qū)域之間存在 4 個DNA 結(jié)合位點，在光合細(xì)菌任何生長條件下都能提高cbbII操縱子的表達(dá)。而 ReA 轉(zhuǎn)錄蛋白在 cbbI操縱子啟動子的 227 bp 和 545 bp 區(qū)域之間僅存在一個能夠提高 cbbI操縱子表達(dá)的結(jié)合位點。此外，RegA 蛋白對cbbII操縱子的調(diào)控比 CbbR 蛋白更為重要。2 光合細(xì)菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究光合細(xì)菌具有表達(dá)膜蛋白的天然優(yōu)勢，自身含有豐2 四川理工學(xué)院學(xué)報( 自然科學(xué)版) 2012 年 10 月富的膜蛋白17。光合細(xì)菌參與光合作用的蛋白多數(shù)屬于膜蛋白，如捕光色素蛋白復(fù)合體 1( LH1) 、L

10、H2、光化學(xué)反應(yīng)中心( RC) 、類胡蘿卜素和細(xì)菌葉綠素生物合成的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白等，它們的含量達(dá)到光合細(xì)菌總膜蛋白含量的 50 70%。編碼這些蛋白的基因非常有規(guī)律地分布在染色體 I。這些參與光合作用的膜蛋白分布在光合細(xì)菌的 ICM( Intracytoplasm membrane) 系統(tǒng)中。此外，光合細(xì)菌基因組完全測通，遺傳背景和調(diào)控機制清楚18-19。張世靜等20等對光合細(xì)菌研究表明其具有較高的安全性。目前，用于異源表達(dá)蛋白質(zhì)的光合細(xì)菌主要有 R sphaeorides、R capsulatus、脫氮副球菌 Para-coccus denitrificans 和深紅紅螺菌 Rhodos

11、pirillum rubrum等。Graichen 等21于 1999 年成功利用 R sphaeroides 成功表達(dá)了具有良好的生物活性的甲胺脫氫酶。Laible等22于 2004 年利用 R sphaeroides 和 puf 操縱子成功表達(dá)了 APC809 和 APC951 兩種膜蛋白。Roy 等23于2008年成功利用 R sphaeroides 和 puf 操縱子基因表達(dá)了的人G 蛋白受體 GPCRs，放射性配體結(jié)合試驗分析表明純化的 GPCRs 具有良好的活性，這為利用光合細(xì)菌表達(dá)膜蛋白奠定了堅實的基礎(chǔ)。2009 年，Ind 等24以 pIND4 為骨架載體并結(jié)合 pYanni3

12、 的 lacIq調(diào)控基因、pMG160 復(fù)制子和 pJBA24 的 lac 啟動子 PA1 /04 /03構(gòu)建了光合細(xì)菌表達(dá)載體，并利用 R sphaeroides 和 Paracoccus denitrificans表達(dá)了光合細(xì)菌 Che Y6 蛋白。其中，Che Y6 蛋白在 Rsphaeroides 中的表達(dá)量達(dá)到 2. 3 mg 每升細(xì)菌，在 Para-coccus denitrificans 中的含量達(dá)到 1. 3 mg 每升細(xì)菌。該研究為商業(yè)化光合細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建提供了理論和實踐 依 據(jù)。2010 年，Butzin 等25利 用 Rhodospirillumrubrum 表達(dá)了

13、Pseudomonas aeruginosa MscL 和 CycB 膜蛋白、Streptomyces lividans KcsA 膜蛋白，它們在每升細(xì)菌中的表達(dá)量分別達(dá)到 22. 8 23. 4 mg、6. 7 7. 4 mg 和13. 7 14. 4 mg。2010 年，Ha z 等26利用大腸桿菌乳糖操縱子基因和 R sphaeroides puc 操縱子啟動子 pucP 構(gòu)建了光合細(xì)菌用表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有受外源 IPTG和氧氣濃度調(diào)控的雜合啟動子，首次實現(xiàn)了對外源蛋白表達(dá)的精確調(diào)控; 首次建立了一步法從 R sphaeroides 中純化蛋白質(zhì)的方法技術(shù)體系27。2011 年，Z

14、hao z 等2利用 R sphaeroides 和 puc 操縱子建立了新型蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)并表達(dá)了人 防御素 3、GFP 等多個具有生物活性的蛋白質(zhì)，極大地推動了光合細(xì)菌新型蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展和開發(fā)利用。以上光合細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)都是基于 ICM 系統(tǒng)建立，如圖 3 所示。光合細(xì)菌自身膜蛋白和表達(dá)的外源蛋白質(zhì)都將通過 puc 操縱子 PucC 蛋白的裝配作用進(jìn)入 ICM 系統(tǒng)28。R capsulatus 也有望開發(fā)成為一種理想的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)29，2002 年，Kappler和 McEwan 利用 R capsulatus 和 pDorEX 表達(dá)載體表達(dá)了的細(xì)胞色素 C 氧化還原酶30。20

15、05 年，Drepper 等31利用 R capsulatus 和 T7 啟動子表達(dá)了氫化酶。2010年，Katzke 等32利用 R capsulatus 和 T7 啟動子表達(dá)了黃色熒光蛋白 YFP，實驗證明 YFP 在 R capsulatus 和大腸桿菌中表達(dá)量都達(dá)到了 80 mg/L。繼續(xù)優(yōu)化光合細(xì)菌表達(dá)載體和表達(dá)宿主，提高外源蛋白質(zhì)表達(dá)水平，利用光合細(xì)菌表達(dá)具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)將是今后研究的重點。圖 3 光合細(xì)菌 ICM 系統(tǒng)示意圖3 展 望目前，雖然光合細(xì)菌在蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)研究方面取得了較多成果，但仍需進(jìn)一步開發(fā)與完善，主要集中在表達(dá)載體和表達(dá)宿主的優(yōu)化。光合細(xì)菌在固碳方面的

16、研究取得的進(jìn)展為其應(yīng)用奠定堅實的理論基礎(chǔ)。利用光合細(xì)菌固碳、固氮的原理處理污水將是未來光合細(xì)菌應(yīng)用研究的一個重要領(lǐng)域。此外，光合細(xì)菌已成為現(xiàn)代生物技術(shù)研究的重點，在諸多方面得到了一定的應(yīng)用，如生物制氫、生物醫(yī)藥、保健品、水產(chǎn)養(yǎng)殖等33。隨著光合細(xì)菌分子生物學(xué)研究的發(fā)展，光合細(xì)菌將會得到越來越廣泛的應(yīng)用。參 考 文 獻(xiàn):1 Wu J，Bauer C E RegB/RegA，a global redox-re-sponding two-component systemJ Adv Exp MedBiol，2008，631: 131-1482 Zhao Z，Hu Z，Nie X，et al A nov

17、el Rhodobactersphaeroides expression system for real-time evaluationof heterologous protein expression levelsJ ProteinPept Lett，2011，18( 6) : 568-572第 25 卷第 5 期 趙志平等: 光合細(xì)菌研究進(jìn)展33 Imhoff J F，Petri R，Suling J Reclassification of spe-cies of the spiral-shaped phototrophic purple non-sul-fur bacteria of

18、the alpha-Proteobacteria: description ofthe new genera Phaeospirillum gen nov ，Rhodovibriogen nov ，Rhodothalassium gen nov and Roseospiragen nov as well as transfer of Rhodospirillum fulvumto Phaeospirillum fulvum comb nov ，of Rhodospiril-lum molischianum to Phaeospirillum molischianumcomb nov ， of

19、Rhodospirillum salinarum toRhodovibrio salexigensJ Int J Systematic Bacteriol-ogy，1998，48 ( 3) : 793-7984 Gibson J L，Tabita F R The molecular regulation ofthe reductive pentose phosphate pathway in Pro-teobacteria and CyanobacteriaJ Arch Microbiol，1996，166( 3) : 141-1505 Wang X，F(xiàn)alcone D L，Tabita F

20、R Reductive pentosephosphate-independent CO2fixation in Rhodobactersphaeroides and evidence that ribulose bisphosphatecarboxylase / oxygenase activity serves to maintain theredox balance of the cellJ J Bacteriol，1993，175( 11) : 3372-33796 Hauruseu D，Koblizek M The influence of light oncarbon utiliza

21、tion in aerobic anoxygenic phototrophsJ Appl Environ Microbiol，2012 doi: 10 1128 /AEM 01747-127 Rudolf C，Grammel H Fructose metabolism of thepurple non-sulfur bacterium Rhodospirillum rubrum:effect of carbon dioxide on growth，and production ofbacteriochlorophyll and organic acids J EnzymeMicrob Tech

22、nol，2012，50( 4-5) : 238-2468 Dubbs J M，Bird T H，Bauer C E，et al Interaction ofCbbR and RegA * transcription regulators with theRhodobacter sphaeroides cbbIPromoter-operator regionJ J Biol Chem，2000，275( 25) : 19224-192309 Gibson J L，F(xiàn)alcone D L，Tabita F R Nucleotide se-quence，transcriptional analysi

23、s，and expression ofgenes encoded within the form I CO2fixation operonof Rhodobacter sphaeroidesJ J Biol Chem，1991，266( 22) : 14646-1465310 Chen J H，Gibson J L，McCue L A，et al Identifica-tion，expression，and deduced primary structure oftransketolase and other enzymes encoded within theform II CO2fixat

24、ion operon of Rhodobacter sphae-roidesJ J Biol Chem，1991，266 ( 30 ) : 20447-2045211 Wang D，Zhang Y，Pohlmann E L，et al The poorgrowth of Rhodospirillum rubrum mutants lackingRubisCO is due to the accumulation of ribulose-1，5-bisphosphateJ J Bacteriol，2011，193 ( 13 ) :3293-330312 Dangel A W，Tabita F R

25、 Protein-protein interac-tions between CbbR and RegA ( PrrA) ，transcrip-tional regulators of the cbb operons of RhodobactersphaeroidesJ Mol Microbiol，2009，71 ( 3 ) : 717-72913 Tichi M A，Tabita F R Metabolic signals that lead tocontrol of CBB gene expression in Rhodobacter cap-sulatusJ J Bacteriol，20

26、02，184 ( 7 ) : 1905-191514 Dangel A W，Gibson J L，Janssen A P，et al Resi-dues that influence in vivo and in vitro CbbR func-tion in Rhodobacter sphaeroides and identification ofa specific region critical for co-inducer recognitionJ Mol Microbiol，2005，57( 5) : 1397-141415 Dubbs J M，Tabita F R Interact

27、ions of the cbbIIpro-moter-operator region with CbbR and RegA ( PrrA)regulators indicate distinct mechanisms to controlexpression of the two cbb operons of RhodobactersphaeroidesJ J Biol Chem，2003，278 ( 18 ) :16443-1645016 Romagnoli S，Tabita F R A novel three-protein two-component system provides a

28、regulatory twist on anestablished circuit to modulate expression of the cb-bI region of Rhodopseudomonas palustris CGA010J J Bacteriol，2006，188( 8) : 2780-279117 Golecki J，Drews G，Buhler R The size and numberof intramembrane particles in cells of the photosyn-thetic bacterium Rhodopseudomonas capsul

29、ata stud-ied by freeze-fracture electron microscopyJ Cyto-biologie，1979，18( 3) : 381-38918 Naylor W T，Addlesee H A，Gibson D C L The pho-tosynthesis gene cluster of Rhodobacter sphaeroidesJ Photosynthesis research，1999，62121-6213919 趙志平，胡宗利，梁 巖，等 紫細(xì)菌光合機構(gòu)及光合作用基因的表達(dá)調(diào)控J 微生物學(xué)通報，2008，35( 5) : 830-83520 張世

30、靜，曾煥泰，陳惠年，等 光合細(xì)菌對小白鼠毒性測試及生殖生長觀察J 福建師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版，1998，17( 2) : 75-8121 Graichen M E，Jones L H，Sharma B V，et al Heter-ologous expression of correctly assembled methyla-mine dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides4 四川理工學(xué)院學(xué)報( 自然科學(xué)版) 2012 年 10 月J J Bacteriol，1999，181( 14) : 4216-422222 Laible P D，Scott

31、 H N，Henry L，et al Towards high-er-throughput membrane protein production forstructural genomics initiativesJ J Struct FunctGenomics，2004，5( 1-2) : 167-17223 Roy A，Shukla A K，Haase W，et al EmployingRhodobacter sphaeroides to functionally express andpurify human G protein-coupled receptorsJ BiolChem，

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33、lum rubrum J Protein Expr Purif，2010，70 ( 1) : 88-9426 Hu Z，Zhao Z，Pan Y，et al A powerful hybrid pucoperon promoter tightly regulated by both IPTG andlow oxygen levelJ Biochemistry ( Mosc) ，2010，75( 4) : 519-51227 Zhao Z，Hu Z，Liang Y，et al One-step purification offunctional light-harvesting 2 comple

34、x from Rhodobact-er sphaeroidesJ Protein Pept Lett，2010，17 ( 4 ) :444-44828 Choudhary M，Kaplan S DNA sequence analysis ofthe photosynthesis region of Rhodobacter sphaeroides2 4 1J Nucleic Acids Res，2000，28 ( 4 ) : 862-86729 Katzke N，Bergmann R，Jaeger K E，et al Heterolo-gous high-level gene expressio

35、n in the photosyntheticbacterium Rhodobacter capsulatusJ Methods MolBiol，2012，824251-26930 Kappler U，McEwan A G A system for the heterolo-gous expression of complex redox proteins inRhodobacter capsulatus: characterisation of recombi-nant sulphite: cytochrome c oxidoreductase from Star-keya novellaJ

36、 FEBS Lett，2002，529 ( 2-3 ) : 208-21431 Drepper T，Arvani S，Rosenau F，et al High-leveltranscription of large gene regions: a novel T ( 7 )RNA-polymerase-based system for expression offunctional hydrogenases in the phototrophic bacteriumRhodobacter capsulatusJ Biochem Soc Trans，2005，33( Pt 1) : 56-5832 Katzke N，Arvani S，Bergmann R，et al A novel T7RNA