易寧更年顆粒制備工藝、質(zhì)量控制及初步藥效學研究

1、易寧更年顆粒制備工藝、質(zhì)量控制及初步藥效學研究更年期 (Menopause)通常是指卵巢功能旺盛狀態(tài)逐漸衰退直至完全消失的一個過渡時期 , 而更年期綜合征 (Menopausal syndrome, MPS) 則是大多數(shù)婦女在更年期隨著月經(jīng)周期、 激素水平等的變化所導致的一系列以自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主 , 且伴有神經(jīng)心理癥狀的一組癥候群。 在此期間 , 隨著性激素水平的變化大多數(shù)婦女都會伴有不同程度的疾病, 如：月經(jīng)失調(diào)、抑郁、情緒波動大、乳腺癌、煩躁失眠、性器官性功能減弱、免疫功能下降等一系列綜合征。并且隨著社會發(fā)展節(jié)奏和人口老齡化的提高, 越來越多的人們受到更年期綜合征疾病的影響。本研究

2、中的易寧更年方為一經(jīng)驗方, 由女貞子、墨旱蓮、哈蟆油、當歸和川芎五味藥材組成, 具有補腎益精、 滋陰養(yǎng)血、行氣開郁的功效 , 用于女性進入圍絕經(jīng)期或卵巢功能下降導致的一系列癥狀。且該方一直以湯劑用于臨床, 治療婦女圍絕經(jīng)期綜合征具有很好的療效。由于其存在服用不便 , 劑量不準 , 質(zhì)量不穩(wěn)定等不足而導致不能進一步推廣。本研究選用的顆粒劑服用、儲運、攜帶方便, 服用量減少 , 且質(zhì)量穩(wěn)定 , 適合機械化生產(chǎn)。因此 , 擬根據(jù)藥材主要有效成分對處方藥物進行提取, 濃縮 , 制成顆粒劑 , 建立其質(zhì)量標準并進行藥效學初步研究。目的結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代化實驗技術(shù)優(yōu)化易寧更年顆粒(YiningGen

3、gnian Granules,YNGN)的制備工藝；建立易寧更年顆粒的質(zhì)量標準；觀察成品的初步穩(wěn)定性； 建立小鼠免疫低下模型評價工藝改變前后藥效學的差異：為該制劑的工藝優(yōu)化以及進一步的臨床研究提供可靠的理論依據(jù)。方法1. 易寧更年顆粒工藝優(yōu)化本研究根據(jù)藥材的主要功效成分, 選取高效液相色譜法 (HPLC法)測定特女貞苷含量 , 以特女貞苷含量和浸膏得率為綜合評價指標, 通過正交試驗篩選墨早蓮和女貞子藥材浸泡時間、加水量、提取時間與提取次數(shù)； 根據(jù)當歸和川芎揮發(fā)油的提取量考察加水量、 粒度、提取時間對水蒸氣蒸餾提取工藝的影響：為保持揮發(fā)油的性質(zhì)采用環(huán)糊精進行包合, 并根據(jù)包合前后揮發(fā)油利用率篩選

4、包合工藝的環(huán)糊精和揮發(fā)油的加入比例、包合溫度和包合時間；最后將藥液合并,濃縮 , 干燥 , 選擇合適的輔料將得到的各中間體進行合并制粒, 并根據(jù)相關(guān)規(guī)定對顆粒休止角、 堆密度、臨界相對濕度等進行驗證；采用免疫低下模型小鼠對工藝改變前后的免疫功能藥效學進行初步比較。2. 易寧更年顆粒質(zhì)量標準根據(jù)中國藥典 2010 版一部要求 , 采用薄層色譜法 (TLC) 進行女貞子、當歸和墨早蓮進行定性鑒別。同上根據(jù)中國藥典2010版一部要求 , 采用 HPLC法進行哈蟆油定性鑒別和特女貞苷的含量測定。哈蟆油定性鑒別色譜條件分別為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(AgilentHC-C18柱) ；水為流動相；

5、檢測波長為 215nm。色譜柱：流速：0.7ml/min 。檢測時間 30min。理論板數(shù)按 1- 甲基海因峰計算應不低于2000。特女貞苷含量測定色譜條件為： 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(AgilentHC-C18柱), 以甲醇 - 水(35 ：65) 為流動相 , 檢測波長為 224nm,流速為 1.0ml/min,檢測時間 30min, 柱溫為 30。初步穩(wěn)定性：取模擬市售包裝的成品制劑在室溫條件下放置三個月 , 分別取 0 個月、 1 個月、 2 個月、 3 個月這四個時間點 , 在相同的色譜條件下進行含量測定。根據(jù)中國藥典 2010 版檢查顆粒劑的一般考察項目：如性狀、粒度、水分

6、、溶化性、裝量差異、重金屬和砷鹽等。3. 易寧更年顆粒初步藥效學選用昆明種雌性小鼠 , 采用前三天連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺(80mg/kg)(CY), 后每周強化注射一次的方法建立小鼠免疫低下模型。試驗動物分組及給藥劑量分別為：模型組 ( 等體積的溶劑 ) 、易寧更年顆粒高劑量組 ( 含生藥材 9.6 g/kg) 、中劑量組 ( 含生藥材 6.4 g/kg) 、低劑量組 ( 含生藥材 3.2 g/kg)、原工藝湯劑組 ( 含生藥材 6.4 g/kg)和陽性對照組 (3.3 g/kg),造模的同時開始灌胃給藥 , 每天一次 , 連續(xù)給藥 15 天 (d) 后, 分別觀察原工藝湯劑組、模型組、陽性藥物

7、組及高、 中、低劑量易寧更年顆粒對免疫低下模型小鼠各項指標的影響。免疫器官臟器指數(shù)：給藥15d 后, 禁食 12 小時 , 稱重 , 處死 , 剝?nèi)∨K器稱重；碳粒廓清功能：末次給藥 1h 后、尾靜脈注射稀釋后的印度墨汁, 于 2 min、10 min 后內(nèi)眥采血 , 置于 0.1%碳酸鈉溶液中 , 于 600nm處測定吸光度。脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗： 末次給藥后無菌取脾 , 調(diào)整細胞濃度后于37孵箱孵育 68h 后加入刀豆蛋白4h 后于 490 nm 處測定吸光度；血清溶血素水平：給藥7d 后, 用雞紅細胞進行免疫 , 末次給藥后 , 眼眶采血、分離血清 , 加入一定量的雞紅細胞和補體進行培育 ,

8、 于 540 nm處測定吸光度： NK細胞活性：無菌取脾 , 調(diào)整細胞濃度、加入MTT作為對照進行培育 , 最后于 490 nm 處測定吸光度。結(jié)果1.易寧更年顆粒工藝優(yōu)化墨旱蓮和女貞子正交設(shè)計水提取優(yōu)化結(jié)果為：稱取一定量的女貞子和墨旱蓮浸泡0.5 h, 第一次加水量為 10 倍量 , 提取 2h, 第二次加水為 8倍量 , 提取 1 h, 過濾 , 合并兩次濾液；當歸和川芎揮發(fā)油提取和包合優(yōu)化結(jié)果為：將當歸和川芎飲片一起合提, 加 5 倍量水提取 5 小時收集揮發(fā)油與濾液 , 濾液過濾后與女貞子和墨早蓮濾液合并；當歸、川芎揮發(fā)油包合最佳工藝為：-CD：油為 8：1 時, 在 40下攪拌 3

9、h, 放冷后于 4冰箱靜置 24 h, 抽濾 , 干燥；將所有藥液進行混合、濃縮、干燥 , 合并揮發(fā)油包合物和哈蟆油細粉 , 加入 15%比例的預膠化淀粉作為輔料 , 用 95%的乙醇制粒得到成品。2. 易寧更年顆粒質(zhì)量標準TLC定性鑒別供試品中女貞子、 墨旱蓮、當歸的斑點清晰 , 且陰性無干擾 , 具有良好的專屬性。哈蟆油的HPLC法鑒別供試品與對照品 1- 甲基海因峰相對應出有峰, 陰性無干擾 , 專屬性良好。采用 HPLC法測定易寧更年顆粒中特女貞苷的含量, 結(jié)果為每袋含量不少于25 mg。方法學驗證結(jié)果顯示：方法準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好, 能夠有效地分離供試品中的各成分 , 該方法具有良好

10、的專屬性。穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示： 三個月內(nèi)薄層鑒別、 顆粒劑常規(guī)項目檢查、 含量檢查指標均符合要求 , 且特女貞苷含量基本保持穩(wěn)定。顆粒劑常規(guī)檢查項目結(jié)果：休止角小于 30, 堆密度為 0.49, 流動相良好；水分均低于6%；粒度考察不能過一號篩和能過 5 號篩總共不超過15%；融化性檢查結(jié)果顯示其在5 分鐘內(nèi)能很好的溶解 , 并呈混懸狀態(tài)；吸濕性在 60%以下時較好：裝量差異根據(jù)成品規(guī)格小于7%：重金屬和砷鹽檢測結(jié)果顯示供試品中砷鹽的斑點比標準砷斑淺, 重金屬溶液的顏色較標準液淺。3. 易寧更年顆粒初步藥效學采用腹腔注射一定劑量環(huán)磷酰胺能夠有效抑制小鼠的免疫系統(tǒng)功能 , 成功地建立免疫低下小鼠

11、模型：對于選取的免疫低下模型小鼠免疫學功能指標顯示： 易寧更年顆粒不同劑量組能夠有效地提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)；增強免疫低下小鼠的碳粒廓清功能 , 促進刀豆蛋白 A(ConA)誘導的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力 , 提高血清溶血素水平和天然殺傷細胞 (NK 細胞 ) 活性。且在擬定的臨床給藥 20 倍劑量組優(yōu)選后的易寧更年顆粒比原湯劑組各免疫學功能指標均提高；較模型組各指標有所提高且具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05), 雖然較陽性藥物組略低 , 但無統(tǒng)計學差異 (P>0.05) 。結(jié)論通過正交試驗篩選的易寧更年顆粒制備工藝優(yōu)化方案較原工藝其主要功效成分特女貞苷含量有明顯的增加 , 藥效學試驗也進一步驗證了優(yōu)選工藝的科學性；所建立的HPLC法準確、穩(wěn)定、專屬性和重現(xiàn)性好；能夠作為易寧更年顆粒中特女貞苷含量的測定方法； 質(zhì)量標準中的定性鑒別具有良好的專屬性和重現(xiàn)性；初步藥效學研究表明： 通過