免疫學(xué)檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、1.0目的：室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）是由實(shí)驗(yàn)室的工作人員采用一系列的方法，連續(xù)的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室工作的可靠程度， 確立報(bào)告能否發(fā)出。旨在檢測(cè)、控制本室常規(guī)工作的精密度，并檢測(cè)其準(zhǔn)確度的改變，提高本室常規(guī) 工作中批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測(cè)的一致性。2.0分析前質(zhì)控：2.1人員培訓(xùn)：實(shí)驗(yàn)是人操作的，因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過(guò)培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識(shí)：2.1.1 檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理 （ELISA原理）；2.1.2 臨床意義；2.1.3熟悉檢測(cè)技巧，了解易出差錯(cuò)的環(huán)節(jié)及難點(diǎn)；2.1.4熟悉檢測(cè)試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；2.1.5熟悉檢測(cè)儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識(shí)。2

2、.1.6某些特殊項(xiàng)目的檢測(cè)如抗 HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。2.2室內(nèi)質(zhì)控血清：采用衛(wèi)生部或省臨床檢驗(yàn)中心制備的質(zhì)控血清2.3試劑盒選擇衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品。2.4試劑盒評(píng)價(jià)：試劑評(píng)價(jià)需要有權(quán)威的血清考核盤（Panel ）進(jìn)行檢測(cè)，價(jià)格昂貴，操作繁瑣，一般實(shí)驗(yàn)室不易開(kāi)展，可以通過(guò)以下信息，了解試劑質(zhì)量。2.4.1根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報(bào)告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計(jì)劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；2.4.2通過(guò)詢問(wèn)試劑包被物的組成，如原料來(lái)源（基因工程

3、或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學(xué)合成），片段的長(zhǎng)短等判斷試劑的優(yōu)劣；2.4.3參考室間質(zhì)評(píng)報(bào)告中對(duì)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績(jī)。2.4.4根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評(píng)價(jià)結(jié)果，了解市場(chǎng)上試劑的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。2.5儀器質(zhì)控：2.5.1移液器：ELISA加樣量?。?-100 u l ）,其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指 示量的水，萬(wàn)分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在土10%以內(nèi)；2.5.2水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測(cè)溫度是否一致，允許有土1C的誤差；2.5.3洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過(guò)2ul ,人工

4、扣板時(shí)，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；2.5.4酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正，使其保持良好的工作性能。酶標(biāo) 儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的 酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為土 1%重復(fù)性達(dá)0.5%。2.6標(biāo)本的米集和保存261標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本會(huì)增加非特異性顯色造成假陽(yáng)性。2.6.2長(zhǎng)菌的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽(yáng)性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。2.6.3抗凝不完全的標(biāo)本

5、因纖維蛋白元的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗 凝劑。2.6.4標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4 C冰箱5天內(nèi)完成測(cè)試。如需保存一周以上則要-20 C冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時(shí)避免氣泡?？缮舷骂嵉够旌?，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。反 復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。2.6.5 ELISA 的靈敏度1 ng/ml水平上，標(biāo)本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗(yàn)用同一管標(biāo)本。3.0分析中質(zhì)控：ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣

6、，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù) 責(zé)才能充分發(fā)揮 ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此，應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。3.1加樣3.1.1加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可 產(chǎn)生氣泡。3.1.2每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染；干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。3.1.3樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩 30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩 混勻。3.1.4如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡

7、的試劑后加樣。3.2溫育3.2.1抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（37 C）,經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)3.2.2 ELISA 邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。水要 浸至板條的1/3處。3.2.3反應(yīng)板不宜疊放，注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定控制，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí) 測(cè)定。3.3洗滌3.3.1手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；2 ）用洗滌液過(guò)洗一遍（即注滿孔后即甩去）；3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動(dòng)；4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復(fù)以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。3.3.2

8、洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。3.4顯色341 HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，3.4.2 一定要按照說(shuō)明書規(guī)定的時(shí)間溫度（一般為37 C, 10-15分鐘）恒定反應(yīng)后終止3.4.3或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá)0.2左右使的時(shí)間而恒定反應(yīng)時(shí)間.3.5酶標(biāo)儀判讀結(jié)果3.5.1顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30分鐘內(nèi)）。3.5.2常見(jiàn)的顯色系統(tǒng)有 OPD和TMB二種，以后者最為常見(jiàn)，而TMB酸

9、不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm TMB終止后顯黃色，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm,二種底物的校正波長(zhǎng)均用 630nm。3.5.3使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置 酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。4.0分析后質(zhì)控：4.1報(bào)告方式4.1.1定性試驗(yàn)：國(guó)內(nèi)外為便于統(tǒng)一計(jì)算，一律按S/COV方式報(bào)告，S為標(biāo)本A值，COV即卩Cut Off值（或COV1 夾心法和間接法以 S/CO店1為陽(yáng)性；競(jìng)爭(zhēng)法與中和法以S/COW 1為陽(yáng)性2 COV的計(jì)算公式以試劑盒說(shuō)明書的為準(zhǔn)常見(jiàn)的有：A）COV=2.1

10、 X N （當(dāng)N不足0.05時(shí)按0.05計(jì)），此公式由P/N2.1換算而來(lái)，常用于夾心法。B）COV=0.5 X N,從抑止率公式換算而來(lái)，常用于競(jìng)爭(zhēng)，中和法。C）COV=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。D）COV=X P+N（C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，但對(duì)廠家要求很高，陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定值要 基本恒定。4.1.2定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。1 用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上。2 現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實(shí)屬不易。4.2記錄4.2.1所有實(shí)

11、驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè)；原始登記表應(yīng)記錄試劑來(lái)源、批號(hào);質(zhì)控血清的來(lái)源及測(cè)定值并注明是否在控；簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名。4.2.2如試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保留，至少與病歷保存期一致4.3定性試驗(yàn)ELISA定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無(wú)關(guān)，因此QC要保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無(wú)法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒所 設(shè)的陰陽(yáng)性對(duì)照作為內(nèi)對(duì)照指示反應(yīng)；另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對(duì)照，與標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)，臨界值 S/C.0 1,高值質(zhì)控血清 S/C.0 10,正常人血清 A值在0.050.07之間。陽(yáng)性質(zhì) 控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為HOOK效應(yīng)監(jiān)控）應(yīng)重做陰性標(biāo)本；陰性對(duì)照失控應(yīng)重做陽(yáng)性標(biāo)本。以表格式記錄每塊板的外對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作為QC資料存檔。4.4定量試驗(yàn)ELISA定量試驗(yàn)常見(jiàn)于腫瘤因子（如AFP, CEA CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量（正常范圍），超出這個(gè)量才呈病理情況，故需定量測(cè)定。定量試驗(yàn)的質(zhì)控方法可參考生 化方式。4.5即刻性質(zhì)控在開(kāi)始進(jìn)行質(zhì)控時(shí)，只需要有3個(gè)質(zhì)控血清測(cè)定值即可進(jìn)