STR微衛(wèi)星SSR

1、STR (short tandem repeat,Contents,1、何為STR,1.1 STR的發(fā)現(xiàn),真核生物基因組中廣泛存在著串聯(lián)重復(fù)序列。 根據(jù)重復(fù)單位大小的不同，Tautz(1993)將重復(fù)序列 分為3類：衛(wèi)星序列、小衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星序列。衛(wèi) 星序列通常存在于異染色質(zhì)，主要分布在著絲粒區(qū) 域。其重復(fù)單位達(dá)上千個(gè)堿基，重復(fù)程度可達(dá)到 103107次(Debrauwere et a1，1997)。與衛(wèi)星序列 相比，小衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星序列的重復(fù)單位要短，重 復(fù)程度也小。對(duì)于小衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星序列的區(qū) 分，并沒有特別明確的界限。通常將重復(fù)單位超過 10或l5 bp、位點(diǎn)長(zhǎng)度約在05100 k

2、b的稱為小衛(wèi) 星序列；而那些重復(fù)單位只有15 bp，長(zhǎng)度僅為幾 百bp的位點(diǎn)稱為微衛(wèi)星序列。二者之間還有一些 過渡類型,20世紀(jì)80年代后期,Marshfield醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)的James和俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)的Wis等人分離出來一種比小衛(wèi)星DNA具有更短重復(fù)單元的衛(wèi)星DNA，被稱為微衛(wèi)星DNA（micro satellite DNA），又被稱作短串連重復(fù)(Short Tandem Repeats, STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序(Simple Sequence Repeat, SSRs), 每單元長(zhǎng)度在16bp之間，廣泛分布于基因組中，其中富含A-T堿基對(duì)。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成與分布,微衛(wèi)星序列被分為3

3、種類型： 單一型:ATATATATATATATATATATATAT 復(fù)合型: ATATATCACACACACACACAC 間斷型: ATATATCA ATATATCA ATATATA,1.2 微衛(wèi)星DNA的構(gòu)成,1.3 STR的分布,在基因組中平均50kb就有一個(gè)重復(fù)序列。據(jù)GeneBank等數(shù)據(jù)庫資料統(tǒng)計(jì)人類23對(duì)染色體上至少分布著7 901個(gè)STR位點(diǎn),每對(duì)染色體的STR位點(diǎn)分別超過100個(gè),其中1、2號(hào)染色體的位點(diǎn)均超過600個(gè),性染色體上的已知位點(diǎn)數(shù)在264個(gè)以上,隨著人們對(duì)STR的進(jìn)一步研究,其數(shù)目還會(huì)不斷增加,1.4 STR突變的可能機(jī)制,目前認(rèn)為滑鏈錯(cuò)配是短串聯(lián)重復(fù)序列突變的主要

4、機(jī)制。 在DNA復(fù)制合成的過程中，新生鏈和模板鏈之間在微衛(wèi)星重復(fù)區(qū)域可能發(fā)生錯(cuò)配，使得一個(gè)或者幾個(gè)重復(fù)單位形成環(huán)狀，未能參與配對(duì)。如果未配對(duì)的重復(fù)單位位于新生鏈，則最終得到的新生鏈未配對(duì)重復(fù)單位數(shù)目比模板鏈多。反之，如果未配對(duì)的重復(fù)單位位于模板鏈，則最終得到的新生鏈未配對(duì)重復(fù)單位數(shù)目比模板鏈少,2.STR的特點(diǎn),種類多、分布廣，并按孟德爾共顯性方式在人群中世代相傳。在基因組中平均50kb就有一個(gè)重復(fù)序列，突變率低（ 0.04%）。 在人群中高度多態(tài)，其多態(tài)信息含量容量超過70%。其多態(tài)性表現(xiàn)為正常人群的不同個(gè)體某一基因位點(diǎn)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)可不一樣，同一個(gè)體的兩個(gè)同源染色體上重復(fù)次數(shù)也可以不一

5、樣，即微衛(wèi)星DNA拷貝數(shù)在人群中是可變的。 具有遺傳連鎖不平衡現(xiàn)象,均可被轉(zhuǎn)錄，有些編碼蛋白質(zhì)，而另一些則位于非轉(zhuǎn)譯區(qū)的5端和3端不編碼蛋白質(zhì)。 屬于不穩(wěn)定的DNA序列，其數(shù)目在某些遺傳病中有擴(kuò)大現(xiàn)象，而這種擴(kuò)增并非是減數(shù)分裂的重組造成，擴(kuò)大可發(fā)生在減數(shù)分裂過程中，由一代傳遞給另一代，也可發(fā)生在有絲分裂中，導(dǎo)致嵌合體形成。與成熟人體細(xì)胞比較，微衛(wèi)星DNA在胚胎時(shí)期有絲分裂很不穩(wěn)定。 在不同基因位點(diǎn)上的微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列可以不同，也可以相同,嵌合體形成的機(jī)理示意圖有絲分裂不分離（A，B）及染色體的丟失（C,3.STR的應(yīng)用,微衛(wèi)星DNA 作為遺傳標(biāo)記具有很大的優(yōu)越性。近年來隨著研究的不斷深入

6、,對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的研究不僅具有重要的理論意義, 而且還具有較好的應(yīng)用前景,3.1 STR用于基因定位及構(gòu)建遺傳連鎖圖譜,由于微衛(wèi)星重復(fù)單位數(shù)量多，重復(fù)單位片段短，且重復(fù)程度不一樣，同一類微衛(wèi)星可分布在整個(gè)基因組的不同位置上，可將隨機(jī)PCR標(biāo)記沿著染色體錨定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微衛(wèi)星標(biāo)記來源于基因本身的序列，因而通過對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的定位，也就相應(yīng)地定位了其來源基因。 遺傳連鎖圖譜是利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析來反應(yīng)遺傳標(biāo)記之間的相對(duì)關(guān)系?，F(xiàn)在使用最廣泛的是微衛(wèi)星標(biāo)記,3.2 STR用于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定,因?yàn)镾TR廣泛存在于基因組中,具有高度多態(tài)性、雜合性和穩(wěn)定性。當(dāng)把幾個(gè)STR位

7、點(diǎn)聯(lián)合分析后,可以得到相當(dāng)高的累積個(gè)體識(shí)別率和父權(quán)排除率,3.3 STR用于遺傳學(xué)多態(tài)性研究,STR標(biāo)記多位于非編碼區(qū),變異一般不影響人體的結(jié)構(gòu)與功能,突變?cè)谶M(jìn)化過程中受自然選擇壓力較小,以近乎穩(wěn)定的速率傳遞且不斷積累,形成多樣性。 通過研究STR多態(tài)性,變異速率以及比較序列間差異、人群間差異,分析不同人群間的遺傳距離,就可從分子生物學(xué)角度揭示人類的起源、遷徙、進(jìn)化等歷史進(jìn)程,目前,根據(jù)STR標(biāo)記、Y染色體DNA等的研究,大多數(shù)分子遺傳學(xué)家支持現(xiàn)代人類單起源學(xué)說,認(rèn)為現(xiàn)代人類起源于20萬年前的非洲原始部落,然后向世界各地遷徙。但也有學(xué)者支持現(xiàn)代人類多起源,認(rèn)為除非洲外,亞洲、歐洲也可能是人類發(fā)

8、源地,3.4 STR用于種質(zhì)鑒定和品種分類,由于微衛(wèi)星座位的復(fù)等位性，使它易于鑒別同一物種的不同基因型。Guilford等利用（GA）15（GT）15作為探針篩選蘋果基因組文庫，證明了這些重復(fù)序列的多態(tài)性，并且利用3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記就能足以區(qū)分21個(gè)蘋果品種。Akagi等利用高度多變的含（AT）n的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，成功地區(qū)分了59個(gè)親緣關(guān)系極近的粳稻品種,3.5 STR在疾病診斷和治療中的應(yīng)用,國外學(xué)者曾在科學(xué)雜志發(fā)表論文顯示，用微衛(wèi)星分析方法，可以直接從病人尿液中的脫落細(xì)胞檢出早期癌變細(xì)胞，準(zhǔn)確率達(dá)95%。程書鈞院士他們采用美國報(bào)道的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)36例中國人膀胱癌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星異常

9、檢出率只有文獻(xiàn)報(bào)道的一半，即意識(shí)到這可能是由于東西方人種之間的差異(或病因?qū)W上的不同)所致，因此不再照搬西方人的研究結(jié)果。 自己著手研究并得出結(jié)論:作為一種無創(chuàng)傷性手段，尿沉渣DNA微衛(wèi)星分析對(duì)于膀胱癌的篩查和早期診斷具有一定意義；與美國報(bào)道的診斷組合的不同，反映了人種差異和可能的病因?qū)W差異,4. STR分子標(biāo)記技術(shù)（舉例,STR標(biāo)記技術(shù)是一種通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來鑒別生物內(nèi)在核苷酸排布及其外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù),4.1 原理與方法,根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端序列的保守性，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，以檢測(cè)、分析微衛(wèi)星序列多態(tài)性；并確定基因排布序列及表型

10、，最終達(dá)到成功鑒定種子純度的目的。 簡(jiǎn)而言之，就是通過對(duì)樣本DNA多態(tài)性的分析，從而來得到樣本DNA序列以及在遺傳性狀上的調(diào)控和差異,實(shí)驗(yàn)儀器,4.1.1 DNA的提?。–TAB法,4.1.2 PCR,SSR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)CMD(Cotton Marker Database)已公布的序列來設(shè)計(jì)相對(duì)SSR引物,熒光PCR,結(jié)果分析,A.利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析。 B.分析結(jié)果,4.2 STR標(biāo)記的主要特點(diǎn),1）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子； （2）具有較多的等位性變異； （3）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠； （4）周期短，包括發(fā)芽時(shí)間，一般收到樣品后8天左右可得結(jié)果,5）無論葉片還是莖桿均可用于檢驗(yàn)； （6）技術(shù)難度低，一般技術(shù)人員經(jīng)培訓(xùn)就可上崗操作； （7）引物開發(fā)比較困難，成本較高,5. 展望,微衛(wèi)星DNA的研究近年來已取得