miR-155在樹突狀細(xì)胞抗白念珠菌固有免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究

1、mir-155在樹突狀細(xì)胞抗白念珠菌固有免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究白念珠菌(candidaalbicans,c.albicans)作為一類條件致病菌,主要寄居在人體的皮膚和粘膜(如口腔、消化道和陰道)表面。在機(jī)體免疫功能正常時(shí),白念珠菌與免疫系統(tǒng)維持相對穩(wěn)態(tài),不會引發(fā)感染;而當(dāng)機(jī)體的免疫功能受到抑制時(shí),白念珠菌與機(jī)體共存的穩(wěn)態(tài)被打破,白念珠菌迅速繁殖,由共生菌轉(zhuǎn)為致病菌。白念珠菌感染作為最常見的真菌感染,可有不同的臨床表現(xiàn),輕者常引發(fā)局部粘膜損傷,重者可穿透組織、侵入外周血液循環(huán),表現(xiàn)為播散性念珠菌病,嚴(yán)重威脅患者生命。近些年來,由于抗生素濫用的現(xiàn)象仍未得到有效解決,且腫瘤放化療患者以及

2、hiv感染病人的日益增多,導(dǎo)致白念珠菌感染的發(fā)病率不斷增高,而且播散性感染的病死率居高不下,這些至今仍是難以解決的臨床問題。因此,研究白念珠菌的致病機(jī)制、特別是深入研究機(jī)體免疫系統(tǒng)抗白念珠菌感染的調(diào)控過程,可為其相關(guān)的感染性疾病的治療提供幫助。機(jī)體抵抗白念珠菌感染的第一道防線是由樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,dcs)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等組成的固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以在第一時(shí)間通過非特異殺傷的方式清除致病菌,但持續(xù)時(shí)間不長而且不具備免疫記憶功能。dcs作為專職的抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,apcs),其表面表達(dá)較高水平的模式識別受體(patte

3、rnrecognitionreceptors,prrs)。這些prrs的主要生物學(xué)功能在于可以識別病原體表面的保守結(jié)構(gòu),即病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,pamps),并由此開啟針對病原體感染的免疫應(yīng)答。白念珠菌細(xì)胞壁的pamps一旦被dcs表面的prrs識別,可迅速活化dcs,分泌多種炎癥因子和趨化因子,促進(jìn)對白念珠菌的非特異性免疫清除。dcs的活化機(jī)制十分復(fù)雜,其核心事件是nf-b、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(nucleartranscriptionfactoractivationprotein-1,ap-1)等轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位,最

4、終調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。另一方面,dcs還可以通過prrs吞噬病原體,并將病原體抗原加工、遞呈給t細(xì)胞,誘導(dǎo)t細(xì)胞分化,指導(dǎo)后續(xù)的特異性免疫應(yīng)答的類型和持續(xù)時(shí)間。固有免疫是獲得性免疫的起點(diǎn)和驅(qū)動,而獲得性免疫可在固有免疫的基礎(chǔ)上發(fā)揮更持久且具有記憶功能的免疫效應(yīng)。值得注意的是,機(jī)體抗白念珠菌的免疫應(yīng)答過程需要多種機(jī)制的精細(xì)調(diào)控,若免疫反應(yīng)強(qiáng)度過弱,則無法有效清除病原體;但若免疫應(yīng)答強(qiáng)度過高或持續(xù)時(shí)間太長,則容易導(dǎo)致機(jī)體組織的炎癥性損傷。micrornas(mirnas)是一類長度約20個堿基左右的單鏈非編碼rna,可以與靶基因mrna的3非編碼區(qū)(3utr)的堿基不完全互補(bǔ)結(jié)合,導(dǎo)

5、致mrna發(fā)生降解,或者直接抑制mrna的蛋白質(zhì)翻譯過程,從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)作用。mirnas的作用特點(diǎn)是一個mirna可以同時(shí)在轉(zhuǎn)錄后水平對多個基因進(jìn)行調(diào)節(jié),而一個基因的表達(dá)強(qiáng)度也可以受到多個mirnas的調(diào)節(jié),mirnas對靶基因的調(diào)節(jié)具有明顯的時(shí)空特異性。近些年來,越來越多的研究表明,mirnas在免疫細(xì)胞的發(fā)育和免疫應(yīng)答的進(jìn)程中發(fā)揮不可忽視的調(diào)控作用。在前期的研究中,我們采用microrna芯片分析了白念珠菌刺激單核源dcs內(nèi)mirnas的表達(dá)譜變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種mirnas異常表達(dá),其中mir-155表達(dá)顯著上調(diào)。再者,以往的研究表明mir-155在抗細(xì)菌、病毒的免疫反應(yīng)中具有

6、活躍的調(diào)節(jié)功能,但目前mir-155在真菌感染免疫中的生物學(xué)功能尚不明確?；谝陨涎芯勘尘?本課題探討了mir-155在樹突狀細(xì)胞抗白念珠菌感染的固有免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。第一部分熱滅活的白念珠菌對樹突狀細(xì)胞及cd4+th細(xì)胞的活化作用及功能影響目的:研究白念珠菌感染對樹突狀細(xì)胞的成熟及其功能的影響,進(jìn)而對cd4+th細(xì)胞的活化和分化的影響。方法:采用磁珠分選的方法從人外周血中分離cd14+單核細(xì)胞和cd4+th細(xì)胞,加入gm-csf和il-4誘導(dǎo)cd14+單核細(xì)胞分化為未成熟的dcs。用熱滅活的白念珠菌刺激dcs,檢測dcs的成熟表面標(biāo)志物的表達(dá)及炎癥因子il-1、il-6、il

7、-23、tnf-和ifn-的分泌。然后將負(fù)載了白念珠菌的dcs與cd4+th細(xì)胞共培養(yǎng),通過流式細(xì)胞術(shù)檢測th細(xì)胞的活化及ifn-、il-17等細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果:熱滅活的白念珠菌可以顯著上調(diào)dcs表面的成熟標(biāo)志物cd83、cd86的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞因子il-1、il-6、il-23、tnf-和ifn-的釋放。負(fù)載白念珠菌的dcs與cd4+th細(xì)胞共培養(yǎng)后,t細(xì)胞表面的活化標(biāo)志物cd69表達(dá)上調(diào),胞內(nèi)細(xì)胞因子ifn-、il-17的分泌水平明顯升高。結(jié)論:熱滅活的白念珠菌可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟,并誘導(dǎo)cd4+th細(xì)胞活化分化,發(fā)揮有效的抗真菌效應(yīng)。第二部分熱滅活的白念珠菌可以上調(diào)樹突狀細(xì)胞內(nèi)

8、mir-155的表達(dá)目的:研究熱滅活白念珠菌能否促進(jìn)mir-155的表達(dá)和分泌。方法:用熱滅活的白念珠菌刺激dcs,qrt-pcr檢測胞內(nèi)mir-155的表達(dá)。收集白念珠菌刺激dcs后的培養(yǎng)上清液,并提取外泌體,檢測上清液和外泌體中mir-155的表達(dá)。通過qrt-pcr檢測白念珠菌刺激dcs后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子的變化情況,以及在dcs、單核細(xì)胞、thp-1細(xì)胞和raw264.7細(xì)胞中mir-155的表達(dá)變化。結(jié)果:熱滅活的白念珠菌可以顯著上調(diào)dcs內(nèi)mir-155的表達(dá),并且白念珠菌刺激dcs的培養(yǎng)上清及外泌體中mir-155表達(dá)也明顯上調(diào)。白念珠菌誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢,

9、而mir-155的表達(dá)呈持續(xù)上升趨勢,后期與炎癥因子的表達(dá)趨勢相反。此外,在單核細(xì)胞、thp-1和raw264.7細(xì)胞內(nèi),白念珠菌同樣可以持續(xù)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)mir-155的表達(dá)。結(jié)論:熱滅活的白念珠菌可以持續(xù)上調(diào)mir-155的表達(dá),且mir-155可以通過外泌體分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中。同時(shí)白念珠菌刺激下炎癥因子的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢,在炎癥后期與mir-155的表達(dá)趨勢相反。第三部分mir-155對dcs分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究目的:探究mir-155對白念珠菌誘導(dǎo)的dcs分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用以及分子機(jī)制。方法:將mir-155的模擬體和抑制體轉(zhuǎn)染dcs,然后加入熱滅活的白念珠菌,分別

10、采用qrt-pcr和elisa檢測炎癥因子il-6、il-23、tnf-和ifn-的變化。采用生物信息學(xué)軟件targetscan、mirdb和microrna.org預(yù)測mir-155的靶基因,并通過westernblotting和熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測mir-155對靶基因的調(diào)節(jié)作用,最后轉(zhuǎn)染sirna干擾靶基因的表達(dá),檢測對下游炎癥因子分泌的影響。結(jié)果:轉(zhuǎn)入mir-155的模擬體后,白念珠菌誘導(dǎo)的炎癥因子il-6、il-23、tnf-和ifn-的分泌明顯降低;而轉(zhuǎn)入mir-155的抑制體后,炎癥因子的變化趨勢與之相反。在白念珠菌刺激的dcs中,mir-155可以與轉(zhuǎn)錄因子nf-bp65

11、和上游bcl10的3utr端靶向結(jié)合抑制其表達(dá)。此外,干擾bcl10可明顯抑制nf-b信號通路的激活,減弱白念珠菌上調(diào)炎癥因子的表達(dá)能力。結(jié)論:在白念珠菌感染中,持續(xù)表達(dá)上調(diào)的mir-155對炎癥因子的分泌具有明顯的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,其作用機(jī)制可能與靶向抑制bcl10及nf-bp65的表達(dá),進(jìn)一步影響nf-b通路的激活有關(guān)。第四部分白念珠菌活化的dcs內(nèi)mir-155表達(dá)上調(diào)的機(jī)制研究目的:探究熱滅活白念珠菌上調(diào)mir-155表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。方法:加入dectin-1的激動劑,采用qrt-pcr檢測mir-155的表達(dá)變化。在白念珠菌刺激dcs前加入dectin-1的抑制劑或sirna預(yù)處理,然后檢測mir-155的表達(dá)變化。分別采用細(xì)胞免疫熒光、westernblotting檢測熱滅活白念珠菌刺激dcs后轉(zhuǎn)錄因子nf-bp65的核轉(zhuǎn)位情況以及mapk信號通路相關(guān)分子的磷酸化表達(dá)。在白念珠菌刺激的dcs之前預(yù)先加入nf-b或mapk信號通路的特異性抑制劑,研究這兩條通路對白念珠菌上調(diào)mir-155表達(dá)的影響。結(jié)果:加入dectin-1的激動劑可以明顯上調(diào)mir-155的表達(dá),而加入dectin-1受體的特異性阻斷劑或sirna均會抑制白念珠菌上調(diào)mir-155表達(dá)的能力。熱滅活的白念珠菌可以促進(jìn)nf-bp65的磷