教學(xué)計劃法醫(yī)物證學(xué)第七章白細(xì)胞血型

1、第七章第七章 白細(xì)胞血型白細(xì)胞血型 第一節(jié) 概述 一、概念 （一）人類白細(xì)胞膜上的抗原分類： 1、紅細(xì)胞血型抗原，如 ABH 抗原等。 2、白細(xì)胞本身特有的抗原，如 CD4 、CD8 等。 3、與其他組織共有的同種抗原，即人類白細(xì)胞抗 原（Human Leukocyte Antigen, HLA ）。 1、在研究小鼠的腫瘤移植時發(fā)現(xiàn)有一種抗原支配著移 植的成敗，這種代表個體特異性的同種抗原稱為 移 植抗原或組織相容性抗原或組織抗原。 機(jī)體內(nèi)與排斥反應(yīng)有關(guān)的 20多個抗原系統(tǒng)中，能 引起強(qiáng)而迅速排斥反應(yīng)的抗原稱為 主要組織相容性 抗原。 2、編碼這些抗原的基因位于同一染色體片段上，形成 一組緊密

2、連鎖的基因群，稱為 主要組織相容性復(fù)合 體（MHC ）。 人類：HLA 系統(tǒng) ；小鼠：H-2系統(tǒng)；狗：DL-A 系統(tǒng). MHC 編碼產(chǎn)物稱為MHC 抗原或MHC 分子，HLA 。 （二）（二） 主要組織相容性復(fù)合體主要組織相容性復(fù)合體( MHC ) 3、HLA 系統(tǒng)是人類最復(fù)雜的顯性遺傳多態(tài)性系統(tǒng)， 也是迄今為止人類基因組中基因密度最高的區(qū)域。 重要功能： （1）參與、控制、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；對異體移植物的 排斥；腫瘤監(jiān)視；參與自身免疫疾病的發(fā)生等。 （2） 法醫(yī)學(xué)的個體識別和親權(quán)鑒定。 二、HLA研究簡史 1958年Dausset 發(fā)現(xiàn)HLA-A 2抗原，標(biāo)志著 HLA 研究的開始 1962年V

3、an Rood發(fā)現(xiàn)了4a，4b雙等位基因 開辟了白細(xì)胞分型的道路 1964年召開第一屆國際組織相容性研討會 揭開了HLA 研究國際大協(xié)作的序幕 1965年確定了HLA 是人類主要組織相容性 抗原 1974年證實(shí)了HLA 系統(tǒng)位于人類第6號染色 體上 1999年人類基因組計劃將HLA 編碼基因全 部解密 三、HLA-類與類抗原結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分布 （一） HLA- 類抗原的結(jié)構(gòu) 1、HLA- 類基因產(chǎn)物為HLA-A 、B和C抗原，是糖蛋白，由重 鏈和輕鏈兩條多肽鏈構(gòu)成，以非共價鍵連接； 2、輕鏈為 2微球蛋白（2 -microglobulin ， m ）, 由15號染色體長 臂上的 2m 基因控制，沒

4、有多態(tài)性。 3、重鏈（鏈）由 HLA-A 、B、C 基因控制產(chǎn)生，具有多態(tài)性； 分為5個區(qū)域： 1結(jié)構(gòu)域、 2結(jié)構(gòu)域、 3結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和 胞漿區(qū)。 羧基端插入細(xì)胞膜，氨基端大部分有利于細(xì)胞膜表面，分為3 個結(jié)構(gòu)域，從氨基端向細(xì)胞膜依次為1、 2、 3 結(jié)構(gòu)域， 3結(jié)構(gòu)域較恒定， 1、2結(jié)構(gòu)域具有高度可變性，形成多態(tài) 性。 4、1和2結(jié)構(gòu)域形成抗原決定槽，類抗原分子中的抗原決定 槽兩端是封閉的，只可以提呈8-9 個氨基酸的短肽。 （二） HLA- 類抗原的結(jié)構(gòu) 1、類基因產(chǎn)物為HLA-DR 、DQ 、DP 抗原，為跨膜糖蛋白， 由鏈和鏈構(gòu)成。DR 鏈無多態(tài)性， DQ 鏈和 DP 鏈有多 態(tài)性。

5、 鏈均有多態(tài)性。 2、 鏈和鏈在細(xì)胞膜外折疊成4個結(jié)構(gòu)域： 1、 2、 1 和 2； 類抗原多態(tài)性由離細(xì)胞膜最遠(yuǎn)的1和1所決定。 3、類抗原分子中的抗原決定槽兩端是開放的，可以提呈 15-24 個氨基酸的長肽。 （三） HLA抗原的細(xì)胞分布 1、HLA- 類抗原分布廣泛，幾乎分布于所有的有核細(xì)胞表面， 以淋巴細(xì)胞上的密度最高。正常情況下，心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞 HLA 抗原極少或沒有。 血漿中有可溶性HLA- 類抗原，可能為細(xì)胞膜代謝產(chǎn)物。 成熟紅細(xì)胞上沒有HLA-A 、B、C、DR 抗原，幼稚紅細(xì)胞卻 有；年輕紅細(xì)胞上有少量HLA 抗原。 血小板自身帶有HLA- 類抗原，還可以從血漿中吸附可溶 性

6、HLA- 類抗原。 2、HLA- 類抗原分布遠(yuǎn)不如類抗原分布，主要存在于樹突狀 細(xì)胞、單核細(xì)胞等具有吞噬功能的細(xì)胞、B細(xì)胞及活化的T細(xì)胞 等。 HLA命名在不斷修改： 1、原來命名的抗原特異性可被進(jìn)一步細(xì)分 寬特異性：某些特異性抗原可被分解后形成多種特異 性抗原，例如，HLA-A9 可分解為A23和A24，前者稱為寬 特異性， A23 和A24是A9的分裂抗原，稱為窄特異性或亞 型。 HLA-A23(9) , HLA-A24(9) HLA-B60(40),HLA-B61(40) 同理，抗-A9血清含有抗-A23和抗-A24特異性。 前者稱 為寬特異性體，后兩者稱為窄特異性抗體。 2、抗原特異性

7、不斷被合并 第三節(jié)第三節(jié)HLA遺傳遺傳 一、 HLA基因定位與基因結(jié)構(gòu) 1、人白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)定位于6p21.31 ，長3600Mb ，占整個基因組全部堿基序列的 0.12%，由一系列緊密 連鎖的基因座組成最具有多態(tài)性的復(fù)合遺傳系統(tǒng)。 HLA 結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜, 其多樣性由多基因性和多態(tài)性兩方 面構(gòu)成. 2、HLA系統(tǒng)共分I類、II類和III類三個基因區(qū)。 從著絲點(diǎn)一側(cè)起依次：為類基因、類基因和類基因區(qū)域 6號染色體 基因區(qū) 3、I類基因區(qū)： 主要由3個I類基因座，每個基因座編碼I類抗原的一條重鏈， 輕鏈(?鏈) 由?2微球蛋白基因編碼。 I類基因含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，多態(tài)性主要有外

8、顯子 2和外顯子3決定。 （）經(jīng)典基因：HLA-A 、B、C基因。均編碼抗原分子的 重鏈(?鏈)，抗原廣泛分布。 （）非經(jīng)典基因：HLA-E 、F、G 和H 基因。也編碼I類 蛋白，稱為HLA Ib基因。等位基因數(shù)目少，多態(tài)性程度低。 （3）存在假基因（圖中以紅色表示）。 B CXECL JAD HGEF 4、II類基因位于HLA-D 區(qū)： II 類基因主要有HLA-DR 、DQ 、 DP 三類，分別編碼相應(yīng)抗原 分子的?鏈和?鏈，形成HLA-DR 、DQ 、 DP 抗原分子。 （）DQ 區(qū)：DQA; DQB。DQA1 和DQB1 為功能基因；A2、 B2和B3為假基因。 （） DP 區(qū)：DP

9、A; DPB 。 DPA1 和DPB1 為功能基因；A2和 B2為假基因。 （） DR 區(qū)：DRA; DRB1-9 。一個DRA 和DRB1 、DRB3 、 DRB4 和DRB5 為功能基因，DRB1 的等位基因有271個，其他為 假基因。 DRB 會形成幾種不同的基因重排，基因數(shù)隨單倍型的不 同而變化，表達(dá)出的?鏈數(shù)目也不同 以上3個區(qū)為經(jīng)典HLA II類經(jīng)典基因，其余為非經(jīng)典基因。 HLA復(fù)合體類和類基因區(qū)內(nèi)的 基因名稱 I類基因區(qū)II類基因區(qū) HLA-AHLA-DRAHLA-DQA1 HLA-DRB HLA-BHLA-DRB1HLA-DQB1HLA-DRB HLA-CHLA-DRB2HL

10、A-DQA2HLA-DRB HLA-EHLA-DRB3HLA-DQB2HLA-DRB HLA-FHLA-DRB4HLA-DQB3HLA-DRB HLA-GHLA-DRB5 HLA-HHLA-DRB6HLA-DPA1TAP1 HLA-JHLA-DRB7HLA-DPB1TAP2 HLA-KHLA-DRB8HLA-DPA2LMP2 HLA-LHLA-DRB9HLA-DPB2LMP7 H LA 系統(tǒng)的基因座位(1997) HLA I類區(qū)域HLA類區(qū)域HLA類區(qū)域 HLA-A HLA-DRA C2 HLA-B HLA-DRB1 HLA-DRB9 Bf HLA-CHLA-DQA1HLA-DQA2 C4A

11、HLA-E HLA-DQB1HLA-DQB3C4B HLA-F HLA-DPA1HLA-DPA2 TNF HLA-G HLA-DPB1HLA-DPB2LTA HLA-H HLA-TAP1HLA-TAP2 LTB HLA-J HLA-DMB HLA-LMP2 HSP HLA-K HLA-DMA HLA-LMP7 HLA-L HLA-DOBHLA-DOA HLA表型、基因型、單倍型之間的關(guān)系 A1 A2 Cw1 Cw2 B8 B8 DR3 DR3 基因型 A1,2; B8,8; Cw1,2; DR3,3 表現(xiàn)型 A1,2; B8,-; Cw1,2; DR3,- 單倍型 A1, B8, Cw1, D

12、R3 /A2, B8, Cw2, DR3 HLA的單倍型遺傳圖的單倍型遺傳圖 （重組） 母親 父親 子1子2子3子4 A BCD AA B B C C D D 三、HLA 群體分布 不同種族、不同民族、不同地區(qū)之間 HLA 抗原分布不盡相同。 （二）（二）HLA抗血清與交叉反應(yīng)抗血清與交叉反應(yīng) 1、HLA抗體生成途徑：同種免疫、異種免疫、單克隆抗體、天 然抗體 （1）通過妊娠、輸血、同種器官移植等免疫作用，產(chǎn)生同種 抗體； （2）用純化的HLA 抗原免疫動物，產(chǎn)生異種抗體； （3）用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體； （4）偶有“天然”HLA 抗體。 大多數(shù)為免疫抗體，屬IgG，少數(shù)為，少數(shù)為IgM

13、。 2、根據(jù)與抗原決定簇的反應(yīng)，將HLA抗體分為2組 （1 1）僅與一種）僅與一種HLAHLA 基因產(chǎn)物反應(yīng)的抗體，這些抗體只與獨(dú)有基因產(chǎn)物反應(yīng)的抗體，這些抗體只與獨(dú)有 的表位結(jié)合。的表位結(jié)合。 （2 2）能與兩種以上）能與兩種以上HLAHLA 基因產(chǎn)物反應(yīng)的抗體，這種抗體能與基因產(chǎn)物反應(yīng)的抗體，這種抗體能與 結(jié)構(gòu)類似的兩種以上表位或幾種結(jié)構(gòu)類似的兩種以上表位或幾種HLAHLA 基因產(chǎn)物的共有表位結(jié)基因產(chǎn)物的共有表位結(jié) 合，產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)。合，產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)。 二、細(xì)胞學(xué)分型二、細(xì)胞學(xué)分型 （淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)）（淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)） HLA-DP 抗原特異性可應(yīng)用純合子分型細(xì)胞 (hom

14、ozygous typing cell，HTC) 和預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試 驗(yàn)(primed lymphocyte test，PLT)檢測。 兩種方法的原理均是通過混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn) 判斷淋巴細(xì)胞在識別非己 HLA 抗原后發(fā)生的增殖反 應(yīng)。由于分型細(xì)胞來源困難以及實(shí)驗(yàn)方法繁瑣，細(xì) 三、三、DNA分型分型 (一)PCR-RFLP (二)PCR-SSO 1、斑點(diǎn)雜交（Dot-blot ）：將PCR 擴(kuò)增片段制成斑點(diǎn)， 用等位基因特異性寡核苷酸探針雜交，通過探針放射 自顯影結(jié)果進(jìn)行HLA 分型。 反向斑點(diǎn)雜交（RDB ）：將特異性探針預(yù)先固定在膜 上，標(biāo)記PCR 引物。 2、PCR-微量滴度板雜交法（ PCR-MPH） 尼龍膜 固定在膜上 的的PCR產(chǎn)物 標(biāo)記的標(biāo)記的 SSO探針 X線片線片 斑點(diǎn)雜交 反向印跡雜交反向印