九原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

1、原生質(zhì)體的概念 指植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁以外的部分 第2頁(yè)/共38頁(yè)第1頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的用途 植物原生質(zhì)體是沒(méi)有細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，它在一些 研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 原生質(zhì)體是研究細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁的形成與功能、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、大分 子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程與機(jī)理等問(wèn)題的良好實(shí)驗(yàn)體系。 遺傳轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體與外源DNA共培養(yǎng)時(shí)，原生質(zhì)體可以直接吸收外源 DNA，并整合到染色體上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)植株再 生就可以得到轉(zhuǎn)基因植物。 第3頁(yè)/共38頁(yè)第2頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的用途 體細(xì)胞雜交 由于原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁，所以不同的原生質(zhì)體可以相互靠近，發(fā)生 融合，進(jìn)行細(xì)胞雜交。2個(gè)不同植物

2、體細(xì)胞發(fā)生融合、形成新細(xì)胞的 過(guò)程，稱為體細(xì)胞雜交。所得到的融合細(xì)胞為雜種細(xì)胞，再通過(guò)植株 再生就可能創(chuàng)造出新的植物個(gè)體。 第4頁(yè)/共38頁(yè)第3頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 機(jī)械法 高產(chǎn)量、高質(zhì)量的分離原生質(zhì)體是進(jìn)行原生 質(zhì)體培養(yǎng)和操作的前提。 方法：機(jī)械法、酶解法 機(jī)械法：通過(guò)對(duì)植物組織進(jìn)行切割、研磨等 方法破壞植物細(xì)胞壁，使原生質(zhì)體游離出來(lái) 的一種方法 缺點(diǎn): :效率極低、原生質(zhì)體破碎嚴(yán)重，完好的原 生質(zhì)體數(shù)量少 優(yōu)點(diǎn)：對(duì)原生質(zhì)體以后的負(fù)面影響小 第5頁(yè)/共38頁(yè)第4頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 機(jī)械法 具體方法：Klercker（1982），大植物細(xì)胞置 于高滲的蔗糖溶液中，使細(xì)胞質(zhì)壁發(fā)

3、生分離， 原生質(zhì)體收縮成球形，然后用利刃切割，在切 割的過(guò)程中，有些細(xì)胞只被切去了細(xì)胞壁，從 而釋放出完整的原生質(zhì)體. 適用范圍：某些植物的貯藏組織，如：胡蘿卜 的根、洋蔥的鱗片等細(xì)胞高度液泡化的組織. 第6頁(yè)/共38頁(yè)第5頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 酶解法 酶解法： 1960年由英國(guó)的Cooking發(fā)明，是 利用一些酶分解植物細(xì)胞壁而獲得原生質(zhì)體的 一種方法。 植物細(xì)胞壁組成：纖維素、半纖維素和果膠質(zhì) 優(yōu)點(diǎn)：分離原生質(zhì)體的效率很高，用少量的材料就 可以得到大量完整的原生質(zhì)體，已成為分離原生質(zhì) 體的最主要方法 酶制劑：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶（離析 酶）、崩潰酶（纖維素酶、半纖維素酶、果

4、膠酶） 第7頁(yè)/共38頁(yè)第6頁(yè)/共44頁(yè) 具體步驟： 第8頁(yè)/共38頁(yè)第7頁(yè)/共44頁(yè) 材料的選擇 材料來(lái)源：細(xì)胞分裂旺盛的外植體，如幼嫩小 苗的根、胚軸、子葉、幼葉等；處于快速生長(zhǎng) 期的愈傷組織或懸浮細(xì)胞. 對(duì)于容易培養(yǎng)、再生那里較強(qiáng)的雙子葉植物 （如煙草、菊花、胡蘿卜、矮牽牛等）也可用 完全展開(kāi)的葉片作材料. 用于分離原生質(zhì)體的植物材料要培養(yǎng)在最佳 的光溫條件下. 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 酶解法酶解法 第9頁(yè)/共38頁(yè)第8頁(yè)/共44頁(yè) 酶解處理 酶解處理對(duì)以后的原生質(zhì)體培養(yǎng)至關(guān)重要.原則： 利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時(shí)間來(lái)獲 得大量有活力的原生質(zhì)體. 酶解液的準(zhǔn)備：由于植物

5、細(xì)胞壁的主要成分是纖維 素、半纖維素和果膠質(zhì)組成的，所以，酶解液中一 般含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，濃度為 0.5-2.0% 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 酶解法酶解法 第10頁(yè)/共38頁(yè)第9頁(yè)/共44頁(yè) 滲透壓的調(diào)節(jié) 必要性：為了保持釋放出來(lái)的原生質(zhì)體的活 力和膜穩(wěn)定性，必須使原生質(zhì)體處于一個(gè)等 滲環(huán)境中。因此，酶解液中必須加入滲透壓 調(diào)節(jié)劑。 常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有：葡萄糖、甘露醇和 山梨醇等，濃度一般為0.35-0.8mol/L。具體 用什么濃度，要根據(jù)材料的水勢(shì)來(lái)確定。 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 酶解法酶解法 第11頁(yè)/共38頁(yè)第10頁(yè)/共44頁(yè) 加入其它物質(zhì) 酶解液中加入較高

6、濃度的Ca2+可以提高膜的穩(wěn)定 性； 加入葡聚糖硫酸鉀、KH2PO4也可以提高原生質(zhì)體 的穩(wěn)定性和活力； 加入牛血清蛋白可防止酶解過(guò)程對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞 器的破壞； 在酶解液中加入pH緩沖劑有利于保持酶解液的酸 堿環(huán)境的穩(wěn)定，增加原生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì) 體的穩(wěn)定性。 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 酶解法酶解法 第12頁(yè)/共38頁(yè)第11頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 酶解法 注意事項(xiàng) 酶解液配制好后，要用過(guò)濾滅菌的 方法進(jìn)行滅菌，并且隨配隨用. 第13頁(yè)/共38頁(yè)第12頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 酶解法 酶解就是將無(wú)菌材料放入酶解液中、釋放出原生質(zhì)體的過(guò)程。 有菌材料，則必須進(jìn)行表面消毒處理。葉片

7、、幼莖和根等材料要切 成小片，葉片最好撕去下表皮。 懸浮細(xì)胞則要離心后再酶解。 第14頁(yè)/共38頁(yè)第13頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 酶解法 用量：材料與酶解液的比率為2-10g/100ml酶解液。 溫度和光照：一般在252、黑暗中酶解，期間輕輕搖動(dòng)幾次，或放在 50rpm的搖床上。 時(shí)間：酶解時(shí)間因材料而異，2小時(shí)-10幾小時(shí)。 第15頁(yè)/共38頁(yè)第14頁(yè)/共44頁(yè) 葉片 的酶 解法 分離 原生 質(zhì)體 第16頁(yè)/共38頁(yè)第15頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的收集與純化 過(guò)濾：酶解結(jié)束后，要及時(shí)的將酶解物通過(guò)孔徑為20- 80m的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，除去未被酶解的組織塊和細(xì) 胞團(tuán)。 離心：濾液轉(zhuǎn)到離心管中

8、在50g下離心5min。 反復(fù)洗滌：離心結(jié)束后，棄去上清液，用培養(yǎng)基和原生 質(zhì)體洗液重新懸浮沉淀的原生質(zhì)體，再離心。如此反復(fù) 2-4次，就可以將殘留的酶液去掉。 純化：如原生質(zhì)體不純（如含有較多的細(xì)胞碎片），可 用含高濃度（21%）蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行離心、純化，完 整的原生質(zhì)體漂浮在上清液的上部。 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 酶解法酶解法 第17頁(yè)/共38頁(yè)第16頁(yè)/共44頁(yè) 完整的原生質(zhì)體 第18頁(yè)/共38頁(yè)第17頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 酶解法 原生質(zhì)體活力的測(cè)定 原生質(zhì)體活力的高低對(duì)后來(lái)的原生質(zhì)體培養(yǎng) 和融合影響極大。測(cè)定原生質(zhì)體活力的方法 常用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法。 原生

9、質(zhì)體活力（%）=發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)/ 原生質(zhì)體總數(shù)100 第19頁(yè)/共38頁(yè)第18頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的分離 酶解法 FDAFDA 熒光素 熒光素 完整、有活力 的原生質(zhì)體 FDAFDA 紫外光酶水解 細(xì)胞核 FDAFDA 熒光素 熒光素 完整、有活力 的原生質(zhì)體 FDAFDA 紫外光酶水解 細(xì)胞核 FDAFDA 熒光素 熒光素 完整、有活力 的原生質(zhì)體 FDAFDA 紫外光酶水解 細(xì)胞核 FDAFDA 熒光素 熒光素 完整、有活力 的原生質(zhì)體 FDAFDA 紫外光酶水解 細(xì)胞核 第20頁(yè)/共38頁(yè)第19頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體培養(yǎng) 發(fā)育過(guò)程：原生質(zhì)體在培養(yǎng)過(guò)程中，首先形成細(xì)胞壁（原生質(zhì)體由圓

10、 形變?yōu)橐欢ㄐ螤睿?，后?lái)進(jìn)行分裂、形成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、完整植 株。 第21頁(yè)/共38頁(yè)第20頁(yè)/共44頁(yè) 苜 蓿 第22頁(yè)/共38頁(yè)第21頁(yè)/共44頁(yè) 第23頁(yè)/共38頁(yè)第22頁(yè)/共44頁(yè) 第24頁(yè)/共38頁(yè)第23頁(yè)/共44頁(yè) 夜來(lái)香 1天 5天 7天10天 第25頁(yè)/共38頁(yè)第24頁(yè)/共44頁(yè) 4周 5周 7周 第26頁(yè)/共38頁(yè)第25頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 液體淺層培養(yǎng) 將含原生質(zhì)體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其 成一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。此種方法操作簡(jiǎn) 單，對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，而且容易以后添加 新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。但原生質(zhì)體分布不 均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連，從而影響

11、其進(jìn)一步的生長(zhǎng)、分裂；同時(shí)，原生質(zhì)體的位 置不能固定，所以不能跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體 的生長(zhǎng)過(guò)程。 第27頁(yè)/共38頁(yè)第26頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng) （平板培養(yǎng)） 30-35的瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基與原生質(zhì)體溶 液混合，搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，瓊脂或瓊脂糖 凝固后，就成一薄層。 平板培養(yǎng)時(shí)原生質(zhì)體都被固定，容易觀察、統(tǒng) 計(jì)原生質(zhì)體的分裂情況，但操作比較復(fù)雜。進(jìn) 行平板培養(yǎng)時(shí)，要注意混合時(shí)培養(yǎng)基的溫度。 溫度高對(duì)原生質(zhì)體的傷害大；溫度低，培養(yǎng)基 凝固，原生質(zhì)體與培養(yǎng)基不能混勻。平板培養(yǎng) 在以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物方面也要 復(fù)雜些。 第28頁(yè)/共38頁(yè)第27頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的培

12、養(yǎng)方法 液體固體結(jié)合培養(yǎng) 液體淺層固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖 培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點(diǎn)是固體 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)可以緩慢釋放倒液體培養(yǎng)基中。如果在固體培養(yǎng)基中加 入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)物分泌的有毒物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)和 分裂。 第29頁(yè)/共38頁(yè)第28頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 瓊脂糖珠培養(yǎng) 用移液管吸取含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基，滴在培養(yǎng)皿或三角瓶中，待 其凝固后，再加入適量的液體培養(yǎng)基，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。也可以等含原生 質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基凝固后，用刀將其切成小塊，再放入液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。 這種方法改進(jìn)了培養(yǎng)物的通氣和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，從

13、而促進(jìn)可以促進(jìn)原生質(zhì)體 的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成。 第30頁(yè)/共38頁(yè)第29頁(yè)/共44頁(yè) 第31頁(yè)/共38頁(yè)第30頁(yè)/共44頁(yè) 看護(hù)培養(yǎng) 第32頁(yè)/共38頁(yè)第31頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的生長(zhǎng)、分裂 在適宜的培養(yǎng)條件下，原生質(zhì)體數(shù)小時(shí)后開(kāi)始形成新的細(xì)胞壁。這時(shí)，在顯微鏡下 可見(jiàn)原生質(zhì)體由圓球形逐漸變?yōu)榉叫?、多邊形等。約24-36h后，原生質(zhì)體開(kāi)始發(fā) 生第一次分裂；以后隨著細(xì)胞分裂，原生質(zhì)體就形成細(xì)胞團(tuán)。 但是，在細(xì)胞分裂開(kāi)始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸降低，否則 會(huì)影響細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)、分裂。待原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）達(dá)到1mm 時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。所形成

14、的愈傷組織就可以按照普 通的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)和植株再生。 第33頁(yè)/共38頁(yè)第32頁(yè)/共44頁(yè) 影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素 原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的好壞，也可以用植板率來(lái)衡 量。 植物材料：用于分離原生質(zhì)體的植物材料對(duì)原生 質(zhì)體后來(lái)培養(yǎng)的效果影響極大。不同的植物、同 一植物不同的品種，其遺傳組成存在差異，原生 質(zhì)體的培養(yǎng)效果也就必然有差異。如Yamada曾 用26個(gè)水稻品種的種子誘導(dǎo)出愈傷組織，再建立 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，以懸浮細(xì)胞分離原生質(zhì)體，結(jié)果 只有1個(gè)品種的原生質(zhì)體再生了植株。一般來(lái)說(shuō)， 容易培養(yǎng)的植物、外植體，其原生質(zhì)體也容易培 養(yǎng)，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料 比成熟的材料容易。 第

15、34頁(yè)/共38頁(yè)第33頁(yè)/共44頁(yè) 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 不同植物原生質(zhì)體要求有不同的基本培養(yǎng)基。使用什么基本培養(yǎng)基，可以參照相應(yīng)培養(yǎng)愈傷組織或細(xì)胞的 培養(yǎng)基。一般認(rèn)為，原生質(zhì)體培養(yǎng)基種的大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的大量元素濃度低。由于Ca2+影 響到膜的穩(wěn)定性，因此較高Ca2+濃度的對(duì)原生質(zhì)體分裂有利。 第35頁(yè)/共38頁(yè)第34頁(yè)/共44頁(yè) 培養(yǎng)基 有機(jī)成分：同培養(yǎng)細(xì)胞、愈傷組織相比，培養(yǎng) 原生質(zhì)體時(shí)要求培養(yǎng)基有更豐富的有機(jī)成分， 如氨基酸、維生素、CW，YE，LH，CH、小 牛血清等。大量的結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加谷 氨酰胺有利于原生質(zhì)體的分裂。 激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細(xì)胞分裂素 和

16、生長(zhǎng)素。由于2,4-D 促進(jìn)細(xì)胞分裂能力很強(qiáng)， 所以培養(yǎng)基中大都要加2,4-D。 條件化培養(yǎng)基：使用條件化培養(yǎng)基可以大大促 進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 第36頁(yè)/共38頁(yè)第35頁(yè)/共44頁(yè) 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中的滲透壓：原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁，所以培養(yǎng)基中必須使用滲透壓 調(diào)節(jié)劑（甘露醇、山梨醇等），以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。但滲透壓調(diào)節(jié) 劑濃度較高往往會(huì)抑制細(xì)胞分裂和后來(lái)的細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，培養(yǎng)基中滲 透壓調(diào)節(jié)劑的濃度不能太高，并且在后來(lái)的培養(yǎng)過(guò)程中要逐漸降低甘露 醇或山梨醇的濃度，以利于細(xì)胞的持續(xù)分裂和生長(zhǎng)。 第37頁(yè)/共38頁(yè)第36頁(yè)/共44頁(yè) 體細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體由于沒(méi)有細(xì)胞壁的限制，所以2個(gè)原生

17、質(zhì)體可以彼此靠近，通 過(guò)膜的融合而融為一體。如果2個(gè)相同的原生質(zhì)體發(fā)生融合，則可以實(shí) 現(xiàn)染色體加倍；如果2個(gè)原生質(zhì)體不同，則就可以實(shí)現(xiàn)將2種不同植物 的遺傳物質(zhì)組合在一起，形成一個(gè)新的雜種細(xì)胞，此雜種細(xì)胞通過(guò)植株 再生，則可以得到雜種植株。2個(gè)不同體細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程，稱為體 細(xì)胞雜交。所得到的融合細(xì)胞為雜種細(xì)胞，再通過(guò)植株再生就可以創(chuàng)造 出新的植物個(gè)體。 第38頁(yè)/共38頁(yè)第37頁(yè)/共44頁(yè) 材料的選擇 材料來(lái)源：細(xì)胞分裂旺盛的外植體，如幼嫩小 苗的根、胚軸、子葉、幼葉等；處于快速生長(zhǎng) 期的愈傷組織或懸浮細(xì)胞. 對(duì)于容易培養(yǎng)、再生那里較強(qiáng)的雙子葉植物 （如煙草、菊花、胡蘿卜、矮牽牛等）也可用 完全展開(kāi)的葉片作材料. 用于分離原生質(zhì)體的植物材料要培養(yǎng)在最佳 的光溫條件下. 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 酶解法酶解法 第9頁(yè)/共38頁(yè)第38頁(yè)/共44頁(yè) 第24頁(yè)/共38頁(yè)第39頁(yè)/共44頁(yè) 夜來(lái)香 1天 5天 7天10天 第25頁(yè)/共38頁(yè)第40頁(yè)/共44頁(yè) 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 液體固體結(jié)合培養(yǎng) 液體淺層固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖 培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點(diǎn)是固體 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)可以緩慢釋