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文檔簡(jiǎn)介

1、雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)畜牧與飼料科學(xué)animalhusbandryandfeedscience2009,30(1112):111113雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)劉峰(安徽省金寨縣南溪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,安徽金寨237361)摘要:雞新城疫是由新城疫病毒引起的雞的急性高度接觸性傳染病,強(qiáng)度感染常呈敗血癥經(jīng)過(guò),主要特征是呼吸困難,下痢,神經(jīng)紊亂,黏膜和漿膜出血.該病傳播迅速,死亡率很高,是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一,可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失.實(shí)驗(yàn)室檢查有助于對(duì)新城疫(nd)的確診.主要對(duì)病毒分離,病毒鑒定,致病指數(shù)測(cè)定和血清學(xué)診斷等雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行了闡述,以期為新城疫的盡早確診,提供參考依據(jù).

2、關(guān)鍵詞:雞新城疫;新城疫病毒;實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)中圖分類號(hào):$858.315.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:a雞新城疫又稱亞洲雞瘟,是由副黏病毒科腮腺炎病毒屬的新城疫病毒引起的,不同日齡的雞易感性有差異,幼雛和中雛易感性最高,2年以上的雞易感性較低.雞發(fā)病后的主要特征是呼吸困難,下痢,神經(jīng)紊亂,黏膜和漿膜出血.成雞產(chǎn)蛋下降,感染率和致死率高.該病在我國(guó)已流行多年,是危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的烈性傳染病之一.國(guó)際獸疫局(oie)將其列為a類傳染病.根據(jù)雞新城疫的流行病學(xué),臨診癥狀和病理變化進(jìn)行綜合分析,可對(duì)該病作出初步診斷.而實(shí)驗(yàn)室檢查則有助于新城疫的確診.病毒分離和鑒定是診斷新城疫的最可靠方法.但應(yīng)注意,從雞群分離到

3、的ndv不一定是強(qiáng)毒,還不能證明該雞群流行nd.因?yàn)橛械碾u群存在弱毒和中等強(qiáng)度的ndv,所以分離出ndv還得結(jié)合流行病學(xué),臨床癥狀進(jìn)行綜合分析,必須對(duì)分離的毒株做毒力測(cè)定后,才能作出確診.1樣品的采集和處理當(dāng)雞群疑似有新城疫發(fā)生時(shí),可采集樣品進(jìn)行病毒分離,自新死亡或?yàn)l死雞采集氣管,肝,腎,脾,肺,腦,腸(包括內(nèi)容物)和心等組織單獨(dú)或昆合作為病毒分離的樣品:活雞收稿日期:200911一ll作者簡(jiǎn)介:劉峰(1962一),男,畜牧師,主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作抗原制備法同樣處理,即為被檢抗原.4.2.3瓊脂平板制備:瓊脂粉1g,8%氯化鈉溶液100ml,加熱使其完全溶解后,再加入1%硫柳汞溶液1m

4、l,向平皿內(nèi)倒人20ml,冷卻后打孔備用.4.2.4試驗(yàn)方法4.2.4.1檢測(cè)抗體:用已知瓊擴(kuò)診斷抗原可以檢測(cè)主動(dòng)免疫鵝血清中的抗體,檢測(cè)病愈鵝血清中的抗體,檢測(cè)制備的小鵝瘟高免血清或進(jìn)行小鵝瘟的流行病學(xué)調(diào)查.在中央孔加抗原,周邊孔加備檢血清.該方法簡(jiǎn)單易行,可以檢測(cè)大批量的血清.4.2.4.2檢測(cè)抗原:取病死鵝的肝,脾,腦,胸腺或腸道病料,按前述方法制備待檢抗原,同已知的小鵝瘟陽(yáng)性血清進(jìn)行瓊擴(kuò)試驗(yàn).中央孔加陽(yáng)性血清,周邊孑l加待檢抗原.4.2.5結(jié)果判定:將加完抗原與血清的平肌放室溫(2025),2448h,觀察結(jié)果和判定,在抗原與血清孔之間出現(xiàn)沉淀線時(shí),即判定為陽(yáng)性反應(yīng).若要檢測(cè)血清中的抗

5、體效價(jià)時(shí),可在中央孔加抗原.周文章順序編號(hào):16725190(2009)11一ol11-03則用氣管拭子和泄殖腔拭子采集樣品,泄殖腔拭子需有可見(jiàn)的糞便:雛雞則因用拭子采集樣品時(shí),可能對(duì)其造成傷害,可收集新鮮糞便為樣品.拭子應(yīng)浸沒(méi)于抗生素溶液中,糞便和組織樣品可用抗生素溶液制成10%20%懸液.抗生素溶液是以緩沖鹽水配制,ph值7.07.4(加入抗生素后測(cè)定).抗生素品種和濃度可視具體情況而定.可選用的抗生素品種和濃度為:青霉素2000iu/ml,鏈霉素2000g/ml,慶大霉素50g/ml,卡那霉素50g/ml,制霉菌素1000g/ml.如果處理的樣品為糞便和泄殖腔拭子時(shí),則其濃度應(yīng)提高5倍.

6、樣品應(yīng)盡快處理,首先在室溫下靜置12h,若沒(méi)有條件時(shí),可暫放4冰箱內(nèi)保存,保存期不得超過(guò)4d,若要保存更長(zhǎng)的時(shí)間,則樣品需置于一20以下的冰凍條件下,多數(shù)新城疫病毒經(jīng)一次凍融之后仍可存活.但在感染性方面有輕微損失.2病毒分離糞便或組織懸液在室溫靜置12h后,經(jīng)1000r離心10min.取0.1ml上清液接種于5個(gè)911日齡的spf雞胚(或種母雞未經(jīng)新城疫免疫的雞胚)尿囊腔,37qc孵育47d,收集死亡和瀕死雞胚的尿囊液.孵育結(jié)束時(shí)將存活的雞胚置于4冰箱內(nèi)冷卻,隨后收集其尿囊液,檢查每一胚尿囊液的ha活性,陰性者再用雞胚傳代一次.邊孑l加倍比稀釋的血清(1:2,1:4,l:8),能同抗原出現(xiàn)沉淀

7、線的最高稀釋倍數(shù)的血清即為該血清的效價(jià).檢測(cè)病死鵝體內(nèi)的抗原時(shí),用單一臟器的檢出率不能達(dá)到100%,如果對(duì)同一只鵝的多個(gè)臟器做檢測(cè),有一個(gè)臟器出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)即判為陽(yáng)性.則對(duì)小鵝瘟的檢出率可達(dá)100%.參考文獻(xiàn):1周碧君,鄭大恒,溫貴蘭,等.小鵝瘟病原學(xué)與檢測(cè)方法的研究j.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī),2005,27(4):290294.2楊曉杰,冷雪,于希貴,等.,j,鵝瘟血清學(xué)診斷方法研究進(jìn)展j.經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,2004,8(1):5053.3余祖華,丁軻,程相朝,等.鵝細(xì)小病毒蛋白研究進(jìn)展j.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(18):46024603,4641.4郭興福-,j,鵝瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)j.畜牧獸醫(yī)科技信息

8、,2005(8):69.5趙麗榮,張桂紅,廖明.鵝細(xì)小病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷j.畜牧獸醫(yī)科技信息,2008(8):3536.6李忠國(guó).,j,鵝瘟的實(shí)驗(yàn)室鑒定與診斷j.養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn),2008(3):69.口112畜牧與飼料科學(xué)第30卷3病毒鑒定無(wú)菌收集的尿囊液做血凝(ha)試驗(yàn),若檢出ha活性時(shí).尚不能確定為新城疫病毒,因禽流感或含有細(xì)菌性ha存在時(shí)也可產(chǎn)生ha活性,此時(shí)需用新城疫陽(yáng)性血清做hi試驗(yàn).若尿囊液的ha活性被抑制,則可確定分離出的病毒為新城疫病毒.4致病指數(shù)測(cè)定不同新城疫病毒分離株的毒力差別很大,而且因新城疫活苗的廣泛應(yīng)用,僅憑借對(duì)有臨床癥狀或病禽分離物的鑒定,還不能對(duì)新城疫作出診斷,尚

9、需要對(duì)分離株進(jìn)行毒力測(cè)定,根據(jù)毒力測(cè)定結(jié)果,對(duì)分離株的致病性進(jìn)行評(píng)估,毒力測(cè)定項(xiàng)目如下:4.1雞胚平均死亡時(shí)間(mdt)用生理鹽水將新收集的尿囊液連續(xù)做10倍稀釋至10l0.每一稀釋度接種5個(gè)910日齡的spf雞胚,尿囊腔接種0.1ml,置于37孵育.余下的病毒稀釋液保存于4,8h后每個(gè)稀釋度再另外接種5個(gè)雞胚,置于37cc孵育.每日照蛋2次,記錄每個(gè)雞胚的死亡時(shí)間(h).最小致死量是指能引起所有雞胚死亡的最大稀釋度.mdt是指最小致死量引起雞胚死亡的平均時(shí)間(h).利用mdt可將新城疫病毒株分為3個(gè)型.強(qiáng)毒力型:死亡時(shí)間低于或等于60h;中等毒力型:死亡時(shí)間在6190h之間;溫和型:死亡時(shí)間

10、大于90h.4.2腦內(nèi)致病指數(shù)(icpi)用不含抗生素的生理鹽水對(duì)新收集的尿囊液做1:10稀釋.腦內(nèi)接種出殼2440h之間的spf雛雞10只,每只接種量為0.05ml.每24h觀察1次,共觀察8d.每天的觀察都給雞記分:雞正常記0分,雞發(fā)病記1分,雞死亡記2分,每只死雞在其死亡后的每日觀察中仍記2分.icpi是每只雞8d內(nèi)所有觀察數(shù)值的平均數(shù).最強(qiáng)毒力病毒的icpi接近最犬值2.0,溫和型毒株的icpi值接近于0.4.3靜脈致病指數(shù)(ivpi)用生理鹽水對(duì)新收集的尿囊液做1:10稀釋.靜脈接種6周齡的spf小雞10只,每只雞接種0.1ml.每天觀察1次,共10d,每次觀察要記分.雞正常記0分,

11、雞發(fā)病記1分,雞癱瘓或出現(xiàn)其他神經(jīng)癥狀記2分.雞死亡記3分.每只死雞在其死亡后的每日觀察中仍記3分.ivei是指10d內(nèi)每次觀察時(shí)每只雞的記錄平均值.強(qiáng)毒力毒株的ivpi值可達(dá)3.0,中等毒力和溫和型毒株ivpi值為0.4.4雞泄殖腔內(nèi)接種的致病性試驗(yàn)該試驗(yàn)用于鑒別嗜內(nèi)臟強(qiáng)毒力型新城疫病毒,確定其毒力和對(duì)器官的嗜好.用生理鹽水對(duì)新收集的尿囊液做1o倍稀釋.用棉拭子蘸取稀釋液,拭抹于68周齡的spf雞的泄殖腔內(nèi),共接種4只雞.每只雞要單獨(dú)分籠隔離飼養(yǎng).每日進(jìn)行觀察,共10d.結(jié)果判定:如果雞出現(xiàn)臨床癥狀和死亡時(shí),則該病毒屬于強(qiáng)毒力型毒株.對(duì)器官的嗜性則是根據(jù)臨床癥狀和死后剖檢病灶而確定.判定標(biāo)準(zhǔn)

12、分為+.+:頭部和頸部水腫,氣管出血,胃腸道普遍出血和壞死或潰瘍;+:呼吸道和腸道有上述病變;+:泄殖腔有特征性病變,呼吸道和腸道的嚴(yán)重病變較少:+:呼吸道和腸道有可看清的輕微病變.如果有1只雞出現(xiàn)+的病變或至少有2只雞出現(xiàn)+病變,即可確認(rèn)該病毒為嗜內(nèi)臟強(qiáng)毒力型毒株.不同毒力型新城疫病毒的致病指數(shù)見(jiàn)表1.表1新城疫病毒的致病指數(shù)5血清學(xué)診斷新城疫的血清學(xué)診斷方法有很多種,如中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn).目前較多使用的是血凝抑制(hi)試驗(yàn),用于檢查雞血清中的新城疫抗體,雞血清在該試驗(yàn)中沒(méi)有非特異性反應(yīng),血清不要做預(yù)處理.除雞以外,其他禽種的血清有時(shí)對(duì)雞的紅細(xì)胞也有凝集作用,試驗(yàn)前需先測(cè)定血清有無(wú)

13、此凝集特性,如果有凝集特性則需用雞紅細(xì)胞對(duì)血清進(jìn)行吸附,以去掉此種非特異性凝集,然后才能用做試驗(yàn).做hi試驗(yàn)之前,需先進(jìn)行ha試驗(yàn).以確定在hi試驗(yàn)中所需要的抗原量.不同國(guó)家和實(shí)驗(yàn)室在ha和hi試驗(yàn)中所采用的程序不同.國(guó)際獸醫(yī)局所推薦的程序如下:試驗(yàn)所用的是v型底孔微量反應(yīng)板.兩種反應(yīng)的總體積都是0.075ml.試驗(yàn)需用等滲的pbs(0.1/10i/l,ph值7.07.2),紅細(xì)胞至少應(yīng)采自3只spf雞(也可用未經(jīng)新城疫病毒免疫的新城疫抗體陰性雞),紅細(xì)胞應(yīng)用pbs洗滌3次,然后配成1%懸液備用(壓積紅細(xì)胞,v/v),每次試驗(yàn)都必須適當(dāng)選用陽(yáng)性和陰性對(duì)照抗原和血清.5.1血凝和血凝抑制試驗(yàn)5.

14、1.1血凝試驗(yàn)(ha):在v型微量反應(yīng)板中每孔加0.025mlpbs.第1孔中加入0.025ml病毒懸液(如尿囊液).將病毒懸液在反應(yīng)板上做0.025ml的系列成倍稀釋.每孔再加0.025mlpbs.每孑l加入1%(v/v)雞紅細(xì)胞0.025ml.輕叩反應(yīng)板混合物,室溫靜置(約20)40min,若室溫過(guò)高則置于4qc冰箱60min,在對(duì)照孔的紅細(xì)胞顯著呈紐扣狀時(shí)判定結(jié)果.ha判定時(shí),應(yīng)將反應(yīng)板傾斜,觀察紅細(xì)胞有無(wú)呈淚珠樣流淌,完全ha(無(wú)淚珠樣流淌)的最高稀釋倍數(shù)為血凝效價(jià),表示1個(gè)ha單位,再根據(jù)開(kāi)始的稀釋倍數(shù)計(jì)算血凝效價(jià).5.1.2血凝抑制試驗(yàn)(hi):反應(yīng)板中每孔加入0.025mlpbs

15、.第1孑l中加0.025ml血清.在反應(yīng)板上將血清做0.025ml的倍比稀釋.每個(gè)反應(yīng)孔中加人0.025ml含4個(gè)血凝單位抗原,室溫下(20)不少于20min,4qc不少于60rain.每孔加人1%(v,v)雞紅細(xì)胞0.025ml,輕輕混勻后,室溫靜置(約20)40min.若室溫過(guò)高,則置于4冰箱60rain,以對(duì)照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果.完全抑制4個(gè)血凝單位抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為hi效價(jià).確定血凝時(shí)需傾斜反應(yīng)板,只有與對(duì)照孔(僅含0.025ml紅細(xì)胞和0.05mlpbs)紅細(xì)胞流淌相當(dāng)?shù)目撞趴膳卸橐种?結(jié)果的正確性應(yīng)視對(duì)照血清而論,陰性對(duì)照血清為陰性.陽(yáng)性對(duì)照血清的效價(jià)應(yīng)符合其

16、已知效價(jià).hi效價(jià)在1:16(2)或以上時(shí)為陽(yáng)性,1:8(2)時(shí)為疑似,1:4或以下時(shí)為陰性國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室的操作與此略有不同,各種液體用量第11-12期劉峰:雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)113都是o.05ml,雞紅細(xì)胞含量為0.5%.hi試驗(yàn)在免疫中的應(yīng)用,雞群免疫后,用hi試驗(yàn)可監(jiān)測(cè)雞的免疫狀態(tài),雞免疫3周后,采血測(cè)定hl效價(jià).hi越高免疫效果越好,免疫最低的hj效價(jià)要求為1:16(2).雞的hi效價(jià)低于1:16(2)時(shí)被認(rèn)為免疫失敗,需要重新進(jìn)行免疫.雞的用途不同,對(duì)hi效價(jià)的要求也不同,幼雞與后備雞要求在1:16(2)以上,蛋雞要求在1:32(2)以上,種雞要求在1:64(20)以上.5.1

17、-3hi試驗(yàn)不僅可用于活雞的抗體檢測(cè),也可用于死雞的抗原檢測(cè):取死雞的肺或盲腸扁桃體組織,用含0.01%硫柳汞的生理鹽水做1:1乳劑,將離心后的上清液視作抗原,做ha試驗(yàn),如果ha試驗(yàn)陽(yáng)性時(shí),取4單位抗原與已知的新城疫陽(yáng)性血清做hi試驗(yàn),若抗原的ha活性被抑制時(shí),則可診斷為新城疫.如果ha試驗(yàn)為陰性,則不能排除新城疫,因組織中的新城疫病毒含量不夠時(shí),則不能發(fā)生ha.5.2瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(agp)agp試驗(yàn)用于檢查死雞體內(nèi)的新城疫病毒,雞死于新城疫時(shí),臟器中需有大量病毒才能將其致死,將臟器中的病毒視作抗原,同已知的新城疫陽(yáng)性血清做agp試驗(yàn),如果出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)即可做出診斷.試驗(yàn)方法如下:5.2.1平板

18、制備:聚乙二醇2g(可不加,檢出率略低一些),瓊脂粉lg,氯化鈉8g,蒸餾水100ml.加人250ml三角瓶?jī)?nèi),加熱融化后,倒人平皿內(nèi)20ml,冷卻后打孔,孔底在酒精燈上微加熱后封底,置于4冰箱保存?zhèn)溆?5.2.2病料采集和處理:采取死雞的氣管黏液,脾,肝,肺,腦,盲腸扁桃體和出血腫大的淋巴結(jié),幼雞尚可采取胸腺和法氏囊,在乳缽內(nèi)做成1:1乳劑,或?qū)⒔M織塊放人小塑料管內(nèi),加少量鹽水,用眼科剪刀剪碎至呈糊狀.5.2.3試驗(yàn):每一組孑l的中央;flail入新城疫陽(yáng)性血清.周邊:flu人待檢臟器乳劑和陽(yáng)性抗原對(duì)照.將平皿置于底層鋪有濕紗布的盒內(nèi),加蓋后置室溫或37溫箱內(nèi),24h后開(kāi)始觀察結(jié)果,觀察至7

19、2h終止.5.2.4結(jié)果判定:被檢器官與陽(yáng)性血清之間出現(xiàn)沉淀線時(shí)可判為陽(yáng)性,即被檢器官中含有新城疫抗原,則表明雞死于新城疫.由于新城疫毒株的嗜臟器性不同,各臟器中的含毒量存在著或多或少的差異.不同毒株在某一臟器中也存在著或多或少的差異,所以對(duì)結(jié)果的判定,不能以某一臟器的結(jié)果作為判定的依據(jù),若以某一臟器的結(jié)果作為判定依據(jù),則新城疫有發(fā)生漏檢的可能,若以多臟器的結(jié)果來(lái)判定時(shí),則agp對(duì)新城疫死雞的檢出率為100%.agp對(duì)新城疫死雞的陽(yáng)性檢出率以盲腸扁桃體和淋巴結(jié)高一些(90%以上),其他臟器的檢出率要低一些(5o%以上).?5.2.5agp試驗(yàn)在診斷中的應(yīng)用:近年來(lái).由于免疫失誤而出現(xiàn)了許多非典

20、型新城疫病例,給診斷工作造成了很大的困難.利用agp試驗(yàn),檢查死雞臟器內(nèi)的新城疫抗原(病毒),可以及時(shí)確診,解決了非典型新城疫診斷困難這一問(wèn)題,方法簡(jiǎn)單易行,快速,有很大的臨床診斷價(jià)值.當(dāng)雞感染了較弱的新城疫病毒時(shí),一般情況下是非致命的,若發(fā)生繼發(fā)感染時(shí)則往往是致命的,臨床上會(huì)表現(xiàn)出繼發(fā)病的癥狀與病變.根據(jù)臨床表現(xiàn)而采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施.結(jié)果是無(wú)效的或效果不滿意,這是因?yàn)橛性l(fā)病新城疫的存在.首先必須解決原發(fā)病,然后對(duì)繼發(fā)病采取措施才能有滿意的效果.人們?cè)趀t常工作中較少考慮原發(fā)病與繼發(fā)病的關(guān)系問(wèn)題,僅根據(jù)繼發(fā)病的臨床表現(xiàn)而作出診斷.對(duì)是否由原發(fā)病或因有原發(fā)病而導(dǎo)致繼發(fā)病的發(fā)生.則不加以深

21、思或檢查,這就是許多疫病發(fā)生誤診或治療無(wú)效的原因,agp試驗(yàn)可以迅速確診出原發(fā)病的存在,解決了這一難題.很多繼發(fā)病主要發(fā)生在雛雞和幼雛,有病毒性的(如傳染性法氏囊炎),也有細(xì)菌性的(如沙門氏菌和大腸桿菌病等).在這一年齡段的雞往往需要用一次以上的新城疫活苗進(jìn)行免疫接種.雞在用過(guò)大劑量系或i系活苗后26d宰殺,檢查各臟器是否含有抗原(病毒),試驗(yàn)結(jié)果為注射活苗雞只有肝組織agp試驗(yàn)為陽(yáng)性.其他組織皆為agp試驗(yàn)陰性,強(qiáng)毒感染時(shí)則很多組織都可出現(xiàn)陽(yáng)性,只要多檢查一些臟器組織,很容易區(qū)別出陽(yáng)性是由活苗或強(qiáng)毒所引起的.5.2.6agp試驗(yàn)在免疫中的應(yīng)用:新城疫抗原也可用于檢查免疫雞體內(nèi)的agp抗體,但其敏感性較低,hi抗體效價(jià)為1:16(2)時(shí)才有部分血清在agp試驗(yàn)中為陽(yáng)性,hi抗體效價(jià)為1:32(2)時(shí)agp試驗(yàn)才能全部為陽(yáng)性,hi抗體效價(jià)為1:8(2)時(shí)則為陰性.因agp試驗(yàn)的敏感性低于hi試驗(yàn),故在日常的抗體檢查中只用hi試驗(yàn),在抗原的檢查中則用agp試驗(yàn)參考文獻(xiàn):1劉振湘.七彩山雞新城疫病毒的分離鑒定與免疫保護(hù)試驗(yàn)j

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