構(gòu)建含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體

1、 .CRTER .org 中國組織工程研究第18卷第2期 2014 - 01 -08出版 Chin ese Journal of Tissue Engin eeri ng ResearchJan uary 8, 2014Vol.18, No.2 構(gòu)建含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體 621000) 張 海，蔣正方，劉 陽，張 波，吳貴強，曾令勇(綿陽市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川省綿陽市 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH265 文章亮點： 實驗創(chuàng)新性采用大腸桿菌同源重組法構(gòu)建出含有腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因的慢病毒載體，并對其

2、進行鑒定，發(fā)現(xiàn)該基因慢病毒載體的構(gòu)建是方便可行的，包裝體系也是成熟的，可為后續(xù)把腫瘤壞死因子相 關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體轉(zhuǎn)導(dǎo)進神經(jīng)干細胞進行基因治療奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞： 組織構(gòu)建；組織工程；腫瘤壞死因子；相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因；慢病毒載體；重組質(zhì)粒；PCR ； Western blot 主題詞： TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；基因；質(zhì)粒；聚合酶鏈反應(yīng)；印跡法，蛋白質(zhì) 張海，男，1977年生，四 川省南充市人，漢族，2012 年瀘州醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，碩士， 主治醫(yī)師，主要從事膠質(zhì) 瘤及功能神經(jīng)外科研究。 摘要 背景：腺病毒的表達時間有限，會限制目的基因的表達時間和表達量，不利于實驗的持續(xù)進行，故文章選擇 慢病毒作為載體

3、，與目的基因大鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因片段進行基因重組。 目的：探討構(gòu)建含有大鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體的方法。 方法：根據(jù)GenBank中大鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體序列(NM 145681.1)， 物Trail -Age I -F和Trail-Age I -R，用PCR法從大鼠cDNA文庫中擴增出目的基因， 隆入真核表達載體 GV218中，產(chǎn)生目的重組質(zhì)粒，用脂質(zhì)體Lipofeetamine 2000 設(shè)計出該基因的特異性引 Age I酶切將該基因克 包裹構(gòu)建的重組質(zhì)粒和輔 助包裝載體，3個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞，產(chǎn)生含有表達腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋

4、白的慢病毒顆粒， 收集病毒進行滴度鑒定，收集細胞提取蛋白進行基因表達情況的檢測。 結(jié)果與結(jié)論：篩選出的克隆陽性菌測序獲得腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，全長861 bp ,與GenBank 中發(fā)表的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體核苷酸序列完全一致。包裝后的病毒 LV-m Trail在轉(zhuǎn)染2 d后收集病 毒液，經(jīng)PCR和Western blot方法鑒定，從基因和蛋白的層面均證實攜帶有目的基因腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡 誘導(dǎo)配體基因?？紫♂尫皩崟r熒光定量PCR病毒滴度測定法測定結(jié)果為2X109 TU/mL。提示大腸桿菌同源 重組法能有效和方便地構(gòu)建出含有腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因的慢病毒載體。

5、通訊作者：蔣正方，碩士 生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，綿陽 市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外 科，四川省綿陽市 621000 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.02.017 htt p:/ 中圖分類號:R318 文獻標(biāo)識碼:B 文章編號:2095-4344 (2014)02-00265-06 稿件接受：2013-11-18 Zha ng Hai, Master, Atte nding p hysicia n, Dep artme nt of Neurosurgery, the Third Hosp ital of Mianyang, Mia nyang 6

6、21000, Sichua n P rovi nee, Chi na Corres ponding author: Jia ng Zheng-fang, Master s sup ervisor, Chief p hysicia n, Dep artme nt of Neurosurgery, the Third Hosp ital of Mianyang, Mia nyang 621000, Sichua n Provin ce, China Acce pted: 2013-11-18 張海，蔣正方，劉陽，張波，吳貴強，曾令勇.構(gòu)建含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體 J.中 國組織

7、工程研究，2014，18(2):265-270. Con structi on of a len tivirus vector for Trail gene in rats Zhang Hai, Jiang Zheng-fang, Liu Yang, Zhang Bo, Wu Gui-qiang, Zeng Ling-yong (De partment of Neurosurgery, the Third Hosp ital of Mianyang, Mianyang 621000, Sichuan Pr ovince, China) Abstract BACKGROUND: Adenovir

8、us, expr essing within a limited p eriod, can limit the expr ession time and amount of target genes that is not conducive to ongoing exp eriments. Here, we select adenovirus as vectors for genetic recombination with tumor necrosis factor (TNF)-related apop tosis-inducing ligand (Trail) gene fragment

9、. OBJECTIVE: To explore the construction of recombinant lentiviral vector carrying Trail in rats METHODS: The Trail gene was obtained: according to GenBank in rat Trail gene sequence (NM_145681.1), we designed the gene specific primers of Trail-Age I-F and Trail-Agel-R, and used Age I as enzyme cutt

10、ing site. PCR was app lied to amp lify Trail gene from rat cDNA Library and construct recombinant pl asmids after cutting Trail gene to be cloned into expr ession vector GV218 by AgeI. Recombinant p lasmids were transfected into 293T cells by Lipo feetamine2000 enca psulated recombinant pl asmid and

11、 auxiliary p ackaging carrier. The Trail pr otein of lentiviral pl asmids was exp ressed. Following virus collection, we identified virus titer and extracted pr otein from cells to detect Trail expr ession by western blot assay. RESULTS AND CONCLUSION: Screened positive Escherichia coli DH5a com pet

12、ent cells were sequenced with 861 bp, which was consistent with Trail nucleotide sequence in GenBank. After transfection 2 days, virus liquid was collected and confirmed as recombinant pl asmid including Trail gene by PCR and Trail pr oteins exp ressed in 293T cells by western blot assay. Hole dilut

13、ion method and real-time fluorescent quantitative PCR determination showed that the virus titer was 2109 禾U/mL. In this study, recombinant lentiviral vector carrying Trail is successfully constructed by homologous recombination in Escherichia coli . Subject headings:TNF-related apop tosis-inducing l

14、igand; genes; p lasmids; po lymerase chain reaction; blotting, western 張海，等.構(gòu)建含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體 Zhang H, Jiang ZF, Liu Y, Zhang B, Wu GQ, Zeng LY. Construction of a lentivirus vector for Trail gene in rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2) :265-270. ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN:

15、 ZLKHAH273 來源 0 弓 I言In troduct ion 隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制的深入研究和生物科技的 飛速發(fā)展，生物治療逐漸引起人們的廣泛關(guān)注和積極探索， 近些年來，生物治療尤其是其中基因靶向治療在惡性腫瘤的 治療中發(fā)揮了重要的作用，尋找有效的的細胞毒性分子誘導(dǎo) 腫瘤細胞凋亡逐漸成為治療惡性腫瘤的研究熱點1鐵 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 仃RAIL）又稱凋亡素2 配體，屬于腫瘤壞死因子家族，在病理狀態(tài)下可特異性誘 導(dǎo)腫瘤細胞或病毒感染細胞凋亡，而對正常細胞無凋亡誘 導(dǎo)作用3。正因為腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抗腫瘤 的這一特性，成為目前腫瘤治療及基因治療的研究熱 點4-5。

16、自Pietersen等首次報道了攜帶了腫瘤壞死因子相 關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因的腺病毒載體可誘導(dǎo)細胞凋亡之后， 攜帶腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因的各種表達載體 （如腺病毒載體、慢病毒載體等）在體內(nèi)外的研究相繼岀現(xiàn)。 最近的研究顯示，攜帶腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基 因的各種表達載體可在體內(nèi)外誘導(dǎo)肺癌、肝癌、胃癌、子 宮頸癌、胰腺癌等腫瘤細胞凋亡716。但腺病毒的表達時間 有限，會限制目的基因的表達時間和表達量，不利于實驗 的持續(xù)進行，故本文選擇慢病毒作為載體，與目的基因大 鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因（mTrail）片段進行 基因重組。 文章旨在探討構(gòu)建大鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配 體

17、基因過表達慢病毒載體的可行性，為后續(xù)把腫瘤壞死因 子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體轉(zhuǎn)導(dǎo)進神經(jīng)干細胞進行基因治療奠定 基礎(chǔ)。 1 材料和方法 Materials and methods 設(shè)計：觀察性實驗。 時間及地點：于2011年2月至2012年2月在瀘州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科完成。 材料： 構(gòu)建含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體實驗的主要試劑及儀器: 試劑及儀器 dsDNA Oligo、 慢病毒載體系統(tǒng) 上海吉凱基因技術(shù)有限公司 大腸桿菌菌株 DH5a，DMEM、胎牛血清、胰 Invitrogen 公司 蛋白酶、脂質(zhì)體 2000 Plasmid 抽提 Kit Promega 公司 限制性內(nèi)切酶、

18、 T4 DNA連接酶 New En gla nd Biolabs 公司 捷瑞生物 大鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因引物 （P rimer） 方法： 實驗步驟：引物設(shè)計合成。目的基因 PCR擴增、 酶切；表達載體酶切、純化。定向克隆連接、重組；感 受態(tài)細胞制備。轉(zhuǎn)化。 PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。陽性克隆 測序。病毒包裝輔助質(zhì)粒；高純度質(zhì)粒抽提。目的基 因過表達載體（病毒載體）。共轉(zhuǎn)染293T細胞；熒光顯微 鏡觀察；收集細胞提取蛋白。病毒顆粒的包裝、生產(chǎn)； Western-blot檢測目的基因表達情況。？病毒的收獲、濃 縮。？病毒滴度檢測。 獲取腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因：以吉凱公 司提供的大鼠

19、cDNA文庫為模板，PCR法擴增腫瘤壞死因 子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因序列。根據(jù) GenBank中大鼠腫瘤 壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因序列，設(shè)計基因的特異引 物，弓I入Age I酶切位點。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配 體上游引物：Trail-Age I -F : GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG GCT TCC ACC GGG AAC CT；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體下游引物：Trail-Age I -R : TCA CCA TGG TGG CGA CCG GGC TCA CAC TCA ACT GGG C ;含交換配對堿基、酶切位點（下劃線標(biāo) 記的

20、），表達增強序列（雙下劃線記的）以及目的基因5端部 分序列用于PCR釣取目的基因。PCR反應(yīng)條件：在94 C預(yù) 變性5 min ;然后進行30個循環(huán)的變性（30 s、94 C）、退火 又叫復(fù)性（30 s、55 C ）及延伸（2 min，72 C）如此反復(fù)循環(huán) 30次；最后72 C保溫10 min。將PCR產(chǎn)物在含EB的10 g/L 瓊脂糖凝膠中進行電泳，切下分子大小為 1 kb目的條帶并 回收，以備后用。 目的質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定:Age I酶切PCR回收產(chǎn)物 （腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因）和GV208載體，分 別回收后用T4 DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài) 細胞中進行克隆篩選，

21、使用Plasmid質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì) 粒，通過Age I酶切及測序鑒定（上海吉凱基因技術(shù)有限 公司）檢測連接產(chǎn)物的正確性。正確產(chǎn)物命名為LV-mTrail。 慢病毒的包裝：在轉(zhuǎn)染前1 d,調(diào)整293T細胞濃度為 0.6 TO9 L-1，在含10% DMEM的15 cm細胞培養(yǎng)皿中重新 接種，培養(yǎng)1 d。向滅菌離心管中加入所制備的各種DNA 溶液（Trail-LV載體 20 卩 g pHelper1.0 載體 15 卩 g pHelper 2.0載體10卩g）1.25 ml及相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻， 室溫下溫育5 min。取100卩L令柔搖勻的Lipofectamine 2000試

22、劑在另一管中不混合，室溫下溫育5 min。把稀釋 后的DNA和不稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，輕 輕地顛倒混勻5 min，混和均勻后，在室溫下溫育 20 min。 再把混合液移至293T細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。8 h后倒去培 養(yǎng)基，加入20 mL的PBS洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物后棄去 PBS，再加入含10%DMEM 25 mL，放置于37 C、體積分 數(shù)5%CO 2培養(yǎng)箱內(nèi)48 h，之后進行病毒的收獲及濃縮。 Western blot檢測：轉(zhuǎn)染2 d后，提取病毒感染后的 293T細胞蛋白。取蛋白樣品30卩采用Western blot，對目 的蛋白腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的表

23、達水平進行檢測，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。經(jīng)脫脂牛奶 封閉，加兔源抗鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抗體 （- 抗）及羊抗兔lgG（二抗）后暗室操作曝光底片。 加入不同病毒量的細 cDNA，之后做PCR Ct值差值來測量病 病毒滴度的孔稀釋法測定：將病毒原液倍比稀釋制備 病毒濃度梯度感染293T細胞，測定病毒原液滴度； Real-time定量 PCR法測定病毒滴度， 胞樣品，通過提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為 定量檢測，通過比較試驗組及對照組的 毒滴度的值。一般Ct差值在2以上則認為存在明顯差異，在 反轉(zhuǎn)錄后得到的20卩L cDNA中只用了 1卩來檢測滴度， 所以在計算滴度時就應(yīng)該乘以2

24、0。 主要觀察指標(biāo)：陽性克隆DNA測序結(jié)果，Western Blot 結(jié)果，目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞熒光觀察及病毒滴度的檢測結(jié) 果，Real-time PCR曲線圖檢測不同濃度病毒感染 293T細 胞后樣品組的Ct值及表達量。 2 結(jié)果 Results 2.1 PCR鑒定重組克隆陽性轉(zhuǎn)化子大小為1 068 bp ;陰 性轉(zhuǎn)化子大小為198 bp（圖1）。 2.2 陽性克隆DNA測序結(jié)果DNA測序鑒定的結(jié)果與實 驗要求的DNA序列基本一致（圖2）。 2.3 Western Blot結(jié)果 觀察到Mr 58 000附近處有特征 條帶，其大小和目的基因融合蛋白相吻合（圖3）。 2.4 目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞熒光

25、觀察及病毒滴度的檢測 293T細胞感染病毒液72 h后在熒光顯微鏡下觀察各組細 胞，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞均成功表達綠色熒光蛋白（圖4）。根據(jù) 圖4中綠色熒光蛋白的表達情況，在加入1X10-6卩病毒原 液的孔中觀察到存在2個帶有熒光的細胞，說明該孔中至少 有2個病毒感染了細胞，則該病毒的滴度就應(yīng)該等于帶有熒 光的細胞數(shù)除以病毒原液量，就是2/（1 X0-6）=2 X06,單位 為TU/L也就等于2X10 TU/mL（圖5）。 2.5 Real-time PCR曲線圖檢測不同濃度病毒感染293T 細胞后樣品組的Ct值及表達量分析在這次qPCR滴度檢 0 o 10 11 12 圖1 PCR法擴增腫瘤壞死因

26、子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因序列鑒定電 泳圖 Figure 1PCR electr op horetogram of sequencing identification of TNF-related apop tosis-inducing ligand gene 圖注：圖中1為陰性對照（ddHzO）; 2為陰性對照；3為陽性對照 （GAPDH）； 4: Marker 自上而下依次為 5 kb,3 kb,2 kb，1.5 kb，1 kb， 750 bp，500 bp , 250 bp，100 bp ; 5-12 為 1-8號轉(zhuǎn)化子。1-8 號轉(zhuǎn) 化子電泳圖譜均出現(xiàn)明亮的陽性條帶（1 068 bp）,說

27、明克隆成功。 Figure 3 Detecting TNF-related apop tosis-inducing ligand pr otein after infecting 293T cells by virus 圖注：圖中Marker :條帶大??；陽性：WB標(biāo)準組-SURVIVIN- 3FLAG-GFP （分子大小：Mr 48 000）。 Con : 293T 細胞；0E :目 的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T后樣品（陽性轉(zhuǎn)化子大?。? 068 bp+ SURVIVIN-3FLAG-GF P）。 圖4目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞72 h觀察結(jié)果（200） Figure 4 Observing 293

28、T cells transferred by p lasmid after 72 hours （ 200） 圖注：圖中A, B分別表示明視野和熒光視野。293T細胞感染病毒 液72 h后在熒光顯微鏡下觀察各組細胞，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞均成功表 達綠色熒光蛋白。 測中，104卩I組和對照組樣品的Ct值相差5,且104 和10-5卩組樣品間Ct值差異不大，故可以認為在10-4 樣品中存在病毒顆粒。在反轉(zhuǎn)錄后得到的 20 卩組 卩組 卩LcDNA中 只用了 1卩I檢測滴度，所以在計算滴度時就應(yīng)該乘以20。 假定該組樣品含有至少1個病毒顆粒，則病毒的滴度為： 69 X0=2 X10 TU/ 卩 L =2 X

29、 10rU/mL（圖6）。 -5 1/（1 沫0 ） Discussi on 3討論 隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究和生物科技的飛 速發(fā)展，生物治療逐漸引起人們的廣泛關(guān)注和積極探索17。 近些年來，生物治療尤其是其中基因靶向治療在惡性腫瘤的 治療中發(fā)揮了重要的作用。尋找有效的的細胞毒性分子誘導(dǎo) 腫瘤細胞凋亡逐漸成為治療惡性腫瘤的研究熱點1819。 目前有許多研究證實腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 可調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的一系列疾病。Prinz-Hodad等20研究發(fā)現(xiàn) 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體可改善神經(jīng)變性的進程。 Chiu等21在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過誘導(dǎo)rAAV2調(diào)控的白細 胞介素12，從而激

30、活小神經(jīng)膠質(zhì)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡 誘導(dǎo)配體，可以有效治療多形性成膠質(zhì)細胞瘤。Irina等22 利用基因工程的手段，通過慢病毒載體使神經(jīng)干細胞表達 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，在小鼠模型中研究 其治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的療效。 a* 十0 弓 fry3 己50 2畔斗 Vddv弓辛 vgaT-aovz乂-d 心ttuf UW-rtrtrtJM JI-TimJLI-m- Il I LtmiJUM.m-l-UJ LMJI- UmWftM IJI-JUI Ihub LLLJI_WJLLHJWI I = mEMMU l l HIL I L BJI T HO-LiriJ. U U Ul lAU UR-B-

31、 LLHJMJ. I ! li Ll-BCl- WUJBJ 55 Query 1 ATGGCTTCCACCGGGAACCTGAAGGGCCCCAGCTTCAGTCAGCACTTCACGATGACGGTG 60 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 1 ATGGCTTCCACCGGGAACCTGAAGGGCCCCAGCTTCAGTCAGCACTTCACGATGACGGTG 60 Query 61 ATCTGCATAGTGCTCCTGCAGGTGCTCCTGCAGGCCTTGACTGTGGCTGTGACTTACATG 120 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 6

32、1 ATCTGCATAGTGCTCCTGCAGGTGCTCCTGCAGGCCTTGACTGTGGCTGTGACTTACATG 120 Query 121 TACTTCAACAACGAGGTGAAACAGCTACAGGACAATTACTCCAAAATCGGACTAGCTTGC 180 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 121 TACTTCAACAACGAGGTGAAACAGCTACAGGACAATTACTCCAAAATCGGACTAGCTTGC 180 Query 181 TTCTCAAAAGAAGATGGGGATTTTTGGGACTCCACTGACGAGGGGATTTTGA

33、ACAGACCT 240 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 181 TTCTCAAAAGAAGATGGGGATTTTTGGGACTCCACTGACGAGGGGATTTTGAACAGACCT 240 Query 241 TGCTTGCAGGTCAAGAGGCAACTGTATCAGCTCATTGAAGAGGTGACTTTGAGAACCTTT 300 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 241 TGCTTGCAGGTCAAGAGGCAACTGTATCAGCTCATTGAAGAGGTGACTTTGAGAACCTTT 300 Query 301 GAGAAAACCA

34、TCTCTACAGTTCCAGAAAAGCAGCTAAGCACTCCTCCCTTGCCCAGAGGT 360 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 301 GAGAAAACCATCTCTACAGTTCCAGAAAAGCAGCTAAGCACTCCTCCCTTGCCCAGAGGT 360 Query 361 AGAAGACCCCAGAGAGTGGCAGCTCACATTACCGGGATCACTCGGAGAAGCAACTTAGCC 420 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 361 AGAAGACCCCAGAGAGTGGCAGCTCACATTACCGGGATCACTC

35、GGAGAAGCAACTTAGCC 420 Query 421 TTAATTCCAATCTCCAAGGATGGAAAGACCTTGGGCCAGAAGATAGAAACCTGGGAGTCC 480 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 421 TTAATTCCAATCTCCAAGGATGGAAAGACCTTGGGCCAGAAGATAGAAACCTGGGAGTCC 480 Query 481 TCTCGGAGAGGGCATTCATTTCTCAACCATGTGCACTTGAGAAACGGAGAGCTGGTGATC 540 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 481 T

36、CTCGGAGAGGGCATTCATTTCTCAACCATGTGCACTTGAGAAACGGAGAGCTGGTGATC 540 Query 541 CAGGAGGAGGGCCTGTATTACATCTACTCCCAAACGTACTACCGGTTCAAGGAGGCTAAA 600 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 541 CAGGAGGAGGGCCTGTATTACATCTACTCCCAAACGTACTACCGGTTCAAGGAGGCTAAA 600 Query 601 GAAGCTTCCAAGACAGTCTCGAAGGACGGAGGGAGGATCAAACAGATGGTGCAGT

37、ACATC 660 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 601 GAAGCTTCCAAGACAGTCTCGAAGGACGGAGGGAGGATCAAACAGATGGTGCAGTACATC 660 Query 661 TACAAATACACCAGCTACCCCGATCCCATACTGCTGATGAAGAGTGCCAGAAATAGCTGC 720 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 661 TACAAATACACCAGCTACCCCGATCCCATACTGCTGATGAAGAGTGCCAGAAATAGCTGC 720 Query 721 TGGTCCAGAGAAG

38、CTGAGTACGGACTGTACTCCATCTATCCTGTTCGAGCTC 780 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 721 TGGTCCAGAGAAGCTGAGTACGGACTGTACTCCATCTATCAGGGGGGGCTGTTCGAGCTC 780 Query 781 AAAGAAAATGACAGGATTTTTGTTTCCGTGACGAATGAGCATTTGATGGACCTGGATCAA 840 川川川川川川川川川川川川川川川川川川川川 Sbjct 781 AAAGAAAATGACAGGATTTTTGTTTCCGTGACGAATGAGCATTTGATGGACCTG

39、GATCAA 840 Query 841 GAAGCCAGCTTCTTTGGAGCC 861 川川川川川川川 Sbjct 841 GAAGCCAGCTTCTTTGGAGCC 861 DNA測序鑒定的結(jié)果與實驗要求的 DNA序列基本一致。 圖2陽性克隆DNA測序結(jié)果圖 Figure 2 DNA sequencing map about p ositive clone A1 B1 A2 A3 B3 2 A4 B4 2 A5 B5 2 A6 A7 B6 2 B7 2 樣品 Actin Ct 值 綠色熒光蛋白 Ct值 綠色熒光蛋白Ct均值 CON 14,39 36,53 36,04 36.285 1山

40、 14,05 19.23 1921 10-1 此 1423 24.12 2i2i 24,13 10-2 此 14,33 27,23 27.33 27,33 10-3 此 14.65 29.09 29.31 23.2 10-4 此 14.39 31.22 30.93 31.075 10-5 此 1425 30 J 4 30.69 30415 圖6不同濃度病毒感染293T細胞后樣品組的Ct值 Figure 6 Ct value of 293T cells transfected by various concentration virus 圖注：圖中Con為對照組。通過比較實驗組及對照組的 Ct值

41、差值來 測量病毒滴度的值，一般 Ct值差值在2以上則認為存在明顯差異。 圖5目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞72 h熒光滴度照片 Figure 5 Fluorescence titer p hotogra ph of 293T cells transferred by p lasmid after 72 hours 圖注：圖中1-7代表所加病毒原液的量，分別為1, 1X10-1, 1X10-2, 1X10-3, 1X10-4, 1X10-5, 1X10-6 （iLo A1-7 為明視野（X00）, B1-7 為熒光視野（X00）,明視野和熒光視野中觀察到的細胞病毒滴度呈相 關(guān)性。 基因治療載體主要包括

42、非病毒載體和病毒載體兩大系 統(tǒng)，由于導(dǎo)入效率的問題，前者在基因治療中的使用率不 到20% ,病毒載體在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛23-25 病毒載體包括各種反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢 病毒等。反轉(zhuǎn)錄病毒是第一個利用病毒進行基因轉(zhuǎn)移的工 具，但其感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下，且外源基因隨機插入，可 能導(dǎo)致突變。腺病毒載體雖然是病毒載體中最常使用的載 體，但由于外源基因表達時間短，免疫原性較強等缺點， 研究者們一直致力于改造腺病毒和研發(fā)更為有效的病毒載 體。而腺相關(guān)病毒受到越來越多的關(guān)注，但其應(yīng)用還處于 探索階段。近年來，新建立的慢病毒載體（Lentiviral vector） 不僅能整合到分裂和

43、非分裂細胞的 DNA中，還對淋巴細胞、 干細胞和多種腫瘤細胞具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，其表達時間 長，具有十分優(yōu)越的應(yīng)用前景26-27。 本實驗采用慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了大鼠腫瘤壞死因子 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體，并對其進行鑒定。發(fā) 現(xiàn)該基因的慢病毒載體的構(gòu)建是方便可行的，該包裝體系 也是成熟的，基本過程和結(jié)果的要點如下：首先設(shè)計岀該 基因的特異性引物，用PCR法從大鼠cDNA文庫中擴增岀 目的基因。然后采用In-Fusion技術(shù)，線性交換連接酶切目 的基因和真核表達載，產(chǎn)生目的重組質(zhì)粒。再將連接產(chǎn)物 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，擴增目的重組質(zhì)粒。 用脂質(zhì)體Lip ofeetami ne

44、 2000包裹構(gòu)建的重組質(zhì)粒和輔 助包裝載體，三質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞，產(chǎn)生含有表達腫 瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白的 Lentivirus病毒顆粒。 此時進行病毒的檢測：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞，熒光顯 微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，進行Western blot鑒定 及使用Real-time定量PCR法檢測病毒滴度。經(jīng)上述多種 手段檢測證實本實驗成功地構(gòu)建了大鼠腫瘤壞死因子相關(guān) 凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體。該載體的構(gòu)建方便易行， 可重復(fù)性強，與之前相關(guān)的研究有一致性和延續(xù)性。Fu 等28成功構(gòu)建了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因的慢 病毒載體，于體外研究了其對淋巴瘤細胞的感染效率，結(jié)

45、果發(fā)現(xiàn)該載體可以感染一系列的淋巴瘤細胞株，均表達了 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，說明不但慢病毒載 體的構(gòu)建是成功的，其表達也是順利的，這就為后續(xù)試驗 打下堅實的基礎(chǔ)。 本實驗成功地構(gòu)建了 LV-mTrai l慢病毒重組載體，為后 續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，也進一步拓寬了慢病毒在基因治療中 的作用。 作者貢獻：各位作者參與課題的設(shè)計、實施及評估。 張海，等.構(gòu)建含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因慢病毒載體 WWW. CRTER .org 利益沖突：文章及內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。 13 倫理要求：無涉及倫理沖突的內(nèi)容。 學(xué)術(shù)術(shù)語:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體-又稱凋亡素 配體，屬于腫瘤壞死因子家族，

46、在病理狀態(tài)下可特異性誘導(dǎo)腫瘤 細胞或病毒感染細胞凋亡，而對正常細胞無凋亡誘導(dǎo)作用。 14 作者聲明：文章為原創(chuàng)作品，無抄襲剽竊，無泄密及署名和 專利爭議，內(nèi)容及數(shù)據(jù)真實，文責(zé)自負。 15 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 參考文獻Referen ces Wirth T, Parker N, Yl? -Herttuala S. History of gene therapy. Gene. 2013; 525(2):162-169. Boye SE, Boye SL, Lewin AS, et al. A com pr ehensive review of retinal

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