課題申請(qǐng)書99mtc標(biāo)記促凋亡蛋白smac多肽進(jìn)行腫瘤顯像的基礎(chǔ)研究

1、摘要：腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所致,凋亡抑制蛋白（iap）是一類內(nèi)源性caspases家族抑制因子,其過(guò)度表達(dá)引起的凋亡不足與腫瘤發(fā)生,治療耐藥密切相關(guān)。線粒體促凋亡蛋白smac可通過(guò)其n端的4個(gè)氨基酸與多種iap特異性結(jié)合，解除iap的抑制作用。因此基于腫瘤高表達(dá)iap, smac多肽可特異性結(jié)合iap這一特性，借助nhs-mag3雙功能螯合劑，99mtc標(biāo)記融合細(xì)胞穿透序列的smac 6肽，進(jìn)行腫瘤顯像，量化iap表達(dá)，比較腫瘤治療前后腫瘤攝取顯像劑的差異，評(píng)估腫瘤治療療效。該方法的建立，不僅可豐富核醫(yī)學(xué)腫瘤顯像方法，還可將此多肽用治療性核素如188re標(biāo)記，以凋亡抑制蛋白為靶點(diǎn)

2、進(jìn)行腫瘤核素內(nèi)放射治療，具有極大的研究前景關(guān)鍵詞：凋亡抑制蛋白；促凋亡蛋白smac；多肽標(biāo)記；腫瘤核素顯像報(bào)告正文一 立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容立項(xiàng)依據(jù) 細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的細(xì)胞自主死亡的過(guò)程，是一系列凋亡相關(guān)分子及其正、負(fù)調(diào)節(jié)分子相互作用的結(jié)果，這一過(guò)程對(duì)消除機(jī)體內(nèi)老化細(xì)胞及具有潛在異常生長(zhǎng)的細(xì)胞,保持機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。凋亡中, caspases家族即半胱天冬酶家族具有重要地位。caspases按其在凋亡過(guò)程中的功能分為啟動(dòng)酶和效應(yīng)酶。啟動(dòng)酶包括caspase2,8,9,10；效應(yīng)酶包括caspase3, 6,7。效應(yīng)酶通過(guò)切斷細(xì)胞間的信號(hào)傳遞,重組細(xì)胞骨架,關(guān)閉dna 復(fù)制和修復(fù),破壞

3、dna和細(xì)胞核結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)凋亡小體形成來(lái)執(zhí)行凋亡功能1。 caspases家族以無(wú)活性的前體形式存在,該前體需經(jīng)級(jí)聯(lián)性的蛋白水解作用而被激活。而凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins, iaps)是caspases家族的內(nèi)源性抑制因子，其成員包括xiap,c-iap1,c-iap2,survivin,livin,naip,apollen/bruce,ilp2。該家族成員均含有13個(gè)桿狀病毒iap重復(fù)序列( baculoviral inhibitor of apoptosis repeats,bir)，利用此結(jié)構(gòu)區(qū)與caspase3,7, 9結(jié)合而發(fā)揮凋亡抑

4、制作用。比如xiap含有3個(gè)bir結(jié)構(gòu)區(qū)，其中bir1,2 連接區(qū)抑制caspase3,7，bir3特異性地抑制caspase9。livin含有一個(gè)bir區(qū)，可特異性抑制caspase9;survivin也通過(guò)其bir區(qū)直接抑制caspase3,72,3。同樣，iaps抗凋亡的能力也受到調(diào)節(jié)。線粒體促凋亡蛋白smac( second mitochondrial activator of caspase) /diablo(direct iap binding protein with low pi) 可與多種iaps包括xiap,c-iap1,c-iap2, survivin,livin的bir

5、區(qū)特異性結(jié)合，解除iap的抑制作用,釋放活化的caspases。smac，25kda大小，前體存在于正常細(xì)胞線粒體,在凋亡信號(hào)刺激下, 其n端55個(gè)氨基酸被剪切，形成成熟的smac釋放到細(xì)胞質(zhì)而發(fā)揮作用4。x線晶體衍射成像顯示成熟的smac通過(guò)n端前4個(gè)氨基酸：丙氨酸纈氨酸脯氨酸異亮氨酸（avpi）與iap家族的bir結(jié)構(gòu)域表面凹槽結(jié)合，從而解除對(duì)caspase的抑制，發(fā)揮促凋亡作用5。（圖1：caspases，iap和smac相互作用關(guān)系示意圖，圖2：smac解除iap抑制caspase作用示意圖）利用此特性， arnt等分別將成熟smac 氨基端的4個(gè)氨基酸（avpi）、6個(gè)氨基酸(avp

6、iaq)、8個(gè)氨基酸(avpiaqks)與果蠅觸角轉(zhuǎn)錄因子穿透序列（rqikiwfqnrrmkwkk）相連接，合成可穿透細(xì)胞的融合多肽，與一些上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞株mcf-7,t47d孵育，通過(guò)免疫共沉淀的方法證實(shí)各種融合多肽的確能穿透細(xì)胞膜，與內(nèi)源性的xiap,ciap1結(jié)合，并能提高化療藥物如依托泊苷、紫杉醇誘發(fā)的凋亡，其中smac 6肽能力最強(qiáng)6。vucic等也合成了含有果蠅觸角轉(zhuǎn)錄因子穿透序列smac 9肽（avpiaqkse），利用極化熒光分析技術(shù)證實(shí)smac9肽不僅可以和xiap的bir3區(qū)結(jié)合，同樣也可和livin的bir區(qū)結(jié)合7。sun等利用核磁共振分光法證實(shí)smac

7、多肽也可類似結(jié)合xiap與survivn結(jié)合 8。iap家族成員在多種人類惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高，以survivin, xiap，c-iap1,c-iap2,livin為著。如肺癌（85.5）、胰腺癌（88）、食道癌（70%）、結(jié)腸癌（53%）、乳腺癌（60）、結(jié)腸癌（53.2）、膀胱癌（58）和胃癌（68）表達(dá)survivin，且其表達(dá)與腫瘤的惡性程度和預(yù)后顯著相關(guān) 9-12 。在惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、絨毛膜癌中有l(wèi)ivin表達(dá)，尤其在惡性黑色素瘤組織中的陽(yáng)性率可達(dá)47.6%70.6%，明顯高于黑色素細(xì)胞痣（21.4 25.0%）13。xiap也在白血病、肝癌、肺癌、子宮頸癌等多

8、種惡性腫瘤中表達(dá)增高。本課題負(fù)責(zé)人所在之研究小組利用組織芯片及免疫組化技術(shù)對(duì)1100余例人類腫瘤中iap家族成員的表達(dá)情況進(jìn)行分析，也得到了相似結(jié)果。腫瘤治療過(guò)程中, 許多抗腫瘤藥物及放療均是通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制完成的, 而凋亡過(guò)程的抑制常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥14。iap在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)督的主要原因,iap基因表達(dá)增高,細(xì)胞凋亡受抑,導(dǎo)致腫瘤耐藥。如kato等的研究表明,食道癌survivin的高表達(dá)能夠?qū)箍拱┧幰鸬牡蛲?在化療效果好的患者的腫瘤組織中survivin表達(dá)水平明顯低于化療效果差的患者,提示survivin表達(dá)量能夠預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)12。li等檢測(cè)了卵

9、巢癌細(xì)胞中xiap的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株xiap的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于對(duì)化療藥物敏感細(xì)胞株,敏感細(xì)胞株經(jīng)順鉑處理后, xiap的表達(dá)下降,凋亡指數(shù)上升,而對(duì)耐藥細(xì)胞株, 順鉑未能影響xiap的水平及細(xì)胞凋亡15。因此，定量分析iap 表達(dá)對(duì)評(píng)估腫瘤的惡性程度、預(yù)后及治療反應(yīng)有極大的幫助。大多數(shù)腫瘤高表達(dá)iap，smac多肽可特異性結(jié)合iap。多肽具有組織滲透迅速、血液中清除快、免疫原性低和合成方便的特性。因此, 若用某些可被探測(cè)的物質(zhì)如放射性同位素標(biāo)記該多肽，注射入體內(nèi)，采用spect或pet則可進(jìn)行腫瘤顯像，同時(shí)還可以進(jìn)行定量分析，量化iap的表達(dá)，為臨床醫(yī)生評(píng)估腫瘤的惡性程度及預(yù)后，制定疾

10、病的治療方案提供重要的幫助，同時(shí)還可為治療藥物的篩選提供有力的幫助。99mtc是目前運(yùn)用廣泛的純核素，具有優(yōu)良的理化性質(zhì)，能標(biāo)記多種化合物，在核醫(yī)學(xué)臨床診斷和實(shí)驗(yàn)研究中得到了廣泛的運(yùn)用。巰基乙酰三甘氨酰-n-羥基丁二酰亞胺酯(nhs-mag3) 作為一種有效的雙功能螯合劑, 在90 年代中后期被用于人多克隆免疫球蛋白、抗體、小分子肽、dna 寡核苷酸及肽核酸等的99m tc 標(biāo)記16。通過(guò)nhs-mag3 得到的標(biāo)記產(chǎn)物, 血漿蛋白結(jié)合率低, 特別適合小分子物質(zhì)的標(biāo)記。因此本研究選擇nhs-mag3作為螯合劑，對(duì)融合了穿透序列的成熟smac氨基端的前6個(gè)氨基酸avpiaq-rqikiwfqnr

11、rmkwkk 進(jìn)行99m tc 標(biāo)記, 探討用于腫瘤診斷，預(yù)后以及腫瘤耐藥評(píng)價(jià)的可行性。試圖通過(guò)基于凋亡抑制基因進(jìn)行的顯像，擴(kuò)展腫瘤核素顯像方法，為臨床評(píng)估腫瘤預(yù)后、治療療效提供有用信息。如該方法的確可行，還可對(duì)其進(jìn)行188re標(biāo)記，以凋亡抑制蛋白為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤核素內(nèi)放射治療，具有極大的研究前景。圖1 凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路示意圖（fuentes-prior p，2004）圖2 smac/diablo 解除iap蛋白抑制caspase作用示意圖（verhagen am ，2001）a caspase 9通過(guò)其p10 亞單位與xiap的bir3結(jié)構(gòu)域凹槽緊密結(jié)合b capase3的催化部位同bir2上

12、游的連接體區(qū)結(jié)合（capase7也類似）c smac/diablo n端氨基酸 與caspase9 類似，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合bir3凹槽，解除iap對(duì)caspase9的抑制d smac/diablo 可與bir2上游的連接體區(qū)結(jié)合，解除對(duì)caspase3，7抑制參考文獻(xiàn)1: jacobson md, weil m, raff mc, et al. programmed cell death in animal development. cell. 1997;88(3):347-54. .2: verhagen am, coulson ej, vaux dl. inhibitor of apoptos

13、is proteins and their relatives: iaps and other birps. genome biol. 2001;2(7):reviews3009. 3: shi y. mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. mol cell. 2002;9(3):459-70. 4: du c, fang m, li y, et al. smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase

14、activation by eliminating iap inhibition. cell. 2000;102(1):33-42. 5: wu g, chai j, suber tl, et al. structural basis of iap recognition by smac/diablo. nature. 2000;408(6815):1008-12. 6: arnt cr, chiorean mv, heldebrant mp, et al. synthetic smac/diablo peptides enhance the effects of chemotherapeut

15、ic agents by binding xiap and ciap1 in situ. j biol chem. 2002;277(46):44236-43. 7: vucic d, deshayes k, ackerly h, et al. smac negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis (ml-iap). j biol chem. 2002;277(14):12275-9. 8: sun c, nettesheim d, liu z, et al. solut

16、ion structure of human survivin and its binding interface with smac/diablo. biochemistry. 2005;44(1):11-7.9: kennedy sm, odriscoll l, purcell r, et al. prognostic importance of survivin in breast cancer. br j cancer. 2003;88(7):1077-83.10: sarela ai, verbeke cs, ramsdale j, et al. expression of surv

17、ivin, a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma. br j cancer. 2002;86(6):886-92.11: ku jh, kwak c, lee hs, et al. expression of survivin, a novel inhibitor of apoptosis, in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. j urol. 2004;171(2

18、 pt 1):631-5. 12: kato j, kuwabara y, mitani m, et al. expression of survivin in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy. int j cancer. 2001;95(2):92-5.13: gong j, chen n, zhou q, et al. melanoma inhibitor of apoptosis protein is expressed differentially in mel

19、anoma and melanocytic naevus, but similarly in primary and metastatic melanomas. j clin pathol. 2005;58(10):1081-5.14: johnstone rw, ruefli aa, lowe sw. et al. apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy. cell. 2002;108(2):153-64. 15: li j, feng q, kim jm, et al. human ovarian cancer

20、and cisplatin resistance: possible role of inhibitor of apoptosis proteins. endocrinology. 2001;142(1):370-80.16: winnard p jr, chang f, rusckowski m, et al. preparation and use of nhs-mag3 for technetium-99m labeling of dna. nucl med biol. 1997;24(5):425-32.項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)以及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題研究?jī)?nèi)容 99m tc標(biāo)記mag3-s

21、mac及其性質(zhì)鑒定 人工合成融合了細(xì)胞穿透序列的smac 6肽avpiaq-rqikiwfqnrrmkwkk，對(duì)照肽為smac n端6肽反向排列qaipva- rqikiwfqnrrmkwkk；以及不含穿透序列的smac 6肽avpiaq 四步法合成nhs-mag3，偶聯(lián)合成肽，99mtc標(biāo)記； 標(biāo)記物純化、測(cè)定放化純以及檢測(cè)標(biāo)記物的穩(wěn)定性和血漿蛋白結(jié)合率。 99m tc-smac體外生物學(xué)性質(zhì)鑒定. 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞攝取99m tc-smac的能力； 利用大腸桿菌表達(dá)xiap、survivin、livin蛋白；表面等離子體共振技術(shù)測(cè)定標(biāo)記物與xiap、survivin、livin蛋白結(jié)合的kd值

22、。 動(dòng)物模型的建立與動(dòng)物體內(nèi)顯像的研究研究99m tc-smac 在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)分布、血液清除、體內(nèi)代謝；荷瘤裸鼠建立，將99m tc-smac注射入動(dòng)物模型后spect顯像，分析腫瘤細(xì)胞內(nèi)放射性強(qiáng)度；通過(guò)注射顯像劑后不同時(shí)間顯像結(jié)果分析，確定最佳顯像時(shí)間； 荷瘤裸鼠放療或化療后，比較腫瘤攝取顯像劑的差異；評(píng)價(jià)治療療效；腫瘤組織xiap、survivin、livin染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與腫瘤攝取顯像劑強(qiáng)度的相關(guān)性分析。研究目標(biāo) (1) 借助nhs-mag3雙功能螯合劑，使用99m tc標(biāo)記可和腫瘤高表達(dá)的凋亡抑制基因結(jié)合的smac多肽，實(shí)現(xiàn)腫瘤顯像的可能性，從而建立一種新型腫瘤顯像方法；(2)

23、該顯像方法除了可對(duì)腫瘤進(jìn)行多次顯像外，還能定量測(cè)定凋亡抑制基因的表達(dá)水平，對(duì)評(píng)估腫瘤預(yù)后、治療療效提供有用信息，充分體現(xiàn)分子核醫(yī)學(xué)與臨床應(yīng)用中的價(jià)值。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 99m tc標(biāo)記mag3-smac，要有優(yōu)良的標(biāo)記特性，保持與iap蛋白的結(jié)合力，確能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤顯像、評(píng)估腫瘤預(yù)后、治療療效的可能性。擬采取的研究方案及可行性分析研究方案合成99m tc-smac，經(jīng)純化、性質(zhì)鑒定后測(cè)定其與iap蛋白親和力、靶特異性、生物穩(wěn)定性。其在動(dòng)物體內(nèi)生物學(xué)分布、體內(nèi)代謝、血液清除速率等將通過(guò)荷瘤裸鼠加以研究。注射99m tc-smac后進(jìn)行spect顯像，定量分析放射性強(qiáng)度,并比較治療前后放

24、射性強(qiáng)度變化；顯像結(jié)果通過(guò)腫瘤組織免疫組化加以驗(yàn)證。99m tc-smac的合成以及性質(zhì)鑒定1合成smac多肽融合了細(xì)胞穿透序列的smac 6肽avpiaqrqikiwfqnrrmkwkk（smac a），對(duì)照肽為smac n端6肽反向排列qaipva- rqikiwfqnrrmkwkk（smac b）；以及不含穿透序列的smac6肽avpiaq（smac c），可交于公司合成。2合成nhs-mag3, 偶聯(lián)smac多肽 參照hnatowich 提供方法（nucl med biol. 1997）合成nhs-mag3, 溶于無(wú)水二甲基甲酰胺，將smac多肽分別溶于hepes緩沖液（ph8.0），

25、邊振蕩邊逐滴加入nhs-mag3溶液，使nhs-mag3和smac的摩爾比為10201，采用不同的連接時(shí)間進(jìn)行偶聯(lián)，用活化的sep-pak c18反相柱純化smac-mag3,甲醇或醋酸胺溶液洗脫，紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm的吸光度，合并峰管，即為目的標(biāo)記物，分裝、冷凍干燥，-20保存。 3 放射性標(biāo)記 將smac-mag3溶于醋酸胺溶液，用新鮮配制的0.5m酒石酸鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至7.6,使酒石酸鈉最終濃度為67g/l。依次加入99mtco4- 新鮮淋洗液74mbq和新鮮配制的1g/l氯化亞錫溶液，混勻后在室溫下反應(yīng)15min，依上述方法分離純化。通過(guò)hplc方法測(cè)定標(biāo)記率。紙層析測(cè)定放射化

26、學(xué)純度。4 99m tc-smac穩(wěn)定性檢測(cè)室溫下將99m tc-smac洗脫液分別放置1h，2h，4h, 紙層析測(cè)定其放化純; 將99m tc-smac加入2 倍體積新鮮人血清中, 37 分別孵育1h，2h，4h, 進(jìn)行紙層析, 測(cè)定其放化純。5 99m tc-smac 兔血漿蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)新鮮兔血漿中分別加入37 74 kbq 99m tc-smac a,b,c, 37 孵育1.5h,三氯醋酸沉淀法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率。 99m tc-smac體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1細(xì)胞攝取6 孔板接種肺癌a549細(xì)胞，前列腺癌lncap，pc-3，du145細(xì)胞，惡性黑色素瘤a375，a875，sk，m14細(xì)胞,子宮

27、頸癌hela細(xì)胞,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)huvec304細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24h 后吸棄培養(yǎng)基,每3 孔為1 組,分別加入含74 kbq 99m tc-smac a,b,c的無(wú)血清培養(yǎng)基2ml ,37 繼續(xù)孵育10,20,40,60 和120min，收集、清洗細(xì)胞,分別測(cè)定細(xì)胞及清洗液中的放射性,計(jì)算攝取率= 細(xì)胞中放射性計(jì)數(shù)/(細(xì)胞中放射性計(jì)數(shù)+ 清洗液中放射性計(jì)數(shù)) 100 %。2表面等離子體共振技術(shù)測(cè)定標(biāo)記物與iap蛋白結(jié)合的kd值利用rt-pcr法,從惡性黑色素腫瘤細(xì)胞a375，,擴(kuò)增xiap, survivin, livin cdna的編碼序列,克隆至pmd-t載體, dna序列測(cè)定后再克隆到原核

28、表達(dá)載體pgex-2t中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌bl21后經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體融合蛋白,并經(jīng)western印跡鑒定。通過(guò)超生霧化將80%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸-l-絲氨酸(dops),19%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸膽堿(dopc)制成單層小囊泡（suv）。suv的結(jié)合通過(guò)表面共振儀測(cè)定。將sa芯片安裝在儀器上，以5-l/分的流速將suv均勻鋪在sa上以形成磷脂膜模型。當(dāng)膜表面的共振單位達(dá)到2000以上并穩(wěn)定以后，磷脂膜模型即做好。將未標(biāo)記的mag3-smac a,b,c和99m tc標(biāo)記smac a,b,c的用hepes-p緩沖液（0.1m的hepes

29、,0.15mnacl,0.005%的p20）以及5mm的cacl2稀釋成不同的濃度，然后將50l的蛋白注射到膜表面（固定相），隨即用250l的緩沖液洗脫（解離相）。測(cè)量spr角的變化監(jiān)測(cè)蛋白與多肽分子間相互作用。由spr曲線可獲得哪些分子發(fā)生了相互作用,相互作用的強(qiáng)度,結(jié)合和解離的速度,樣品中分析物濃度,是否存在異構(gòu)效應(yīng),結(jié)合位點(diǎn)分析,復(fù)合物中不同成分對(duì)結(jié)合的影響等。 99m tc-smac動(dòng)物體內(nèi)顯像的研究1動(dòng)物模型的建立將1106 的人惡性黑色素細(xì)胞a375和前列腺癌du145細(xì)胞接種于裸鼠的雙側(cè)后腿皮下。腫瘤長(zhǎng)到直徑為5-7mm大小后進(jìn)行裸鼠體內(nèi)分布和顯像的研究。2動(dòng)物體內(nèi)生物學(xué)分布 尾

30、靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac后于不同時(shí)間將小鼠殺死，分別取出腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、肌肉、腫瘤組織、尿、大便等，分別稱重，記錄60s放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的放射性強(qiáng)度，得出各器官的時(shí)間放射性曲線。3血液半清除速率 尾靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac 后，分別于不同時(shí)間取血，經(jīng)稀釋后測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。畫出時(shí)間放射性曲線，計(jì)算半清除時(shí)間。4動(dòng)物體內(nèi)顯像 spect顯像 尾靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac，注射前（本底）及注射后0，0.3，1，2，4，6，12，24小時(shí),采集圖像，窗寬15%，能量140kev，采集像素為128128。通過(guò)注射顯像劑后

31、不同時(shí)間顯像結(jié)果分析，確定最佳顯像時(shí)間?？虍媟oi，分別計(jì)算每個(gè)roi的放射性計(jì)數(shù)。 評(píng)價(jià)腫瘤放化療的療效將荷惡性黑色素瘤的裸鼠用2gy/次，共7次，3周后顯像，分別比較放射治療的腫瘤與未放射治療腫瘤內(nèi)放射性強(qiáng)度的差異。將荷前列腺癌lncap、du145的裸鼠用康士得（非甾體類的雄激素受體拮抗劑，其中l(wèi)ncap為激素治療敏感性，而du145為激素非依賴）1mg/kg/d,治療46周后顯像，比較激素治療前后放射性強(qiáng)度的差異，評(píng)價(jià)腫瘤治療的療效。 組織學(xué)染色顯像后，將每只小鼠的腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、肌肉、腫瘤組織取出，固定，石蠟包埋，做成組織芯片，xiap，survivin，livin

32、免疫組化染色。對(duì)各組織染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與體內(nèi)相應(yīng)組織攝取顯像劑強(qiáng)度的相關(guān)性分析。 數(shù)據(jù)分析 采用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)。兩組均數(shù)的比較用t 檢驗(yàn)，多組間的比較用方差分析, 兩兩比較用lsd 法，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)與回歸法；p0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 可行性分析1 課題思路是申請(qǐng)者對(duì)凋亡及其凋亡相關(guān)家族進(jìn)行細(xì)致深入學(xué)習(xí)和研究，參閱了大量文獻(xiàn)，并結(jié)合自己核醫(yī)學(xué)專業(yè)優(yōu)勢(shì)提出的。smac49肽均被證實(shí)可以和凋亡抑制蛋白中的xiap，survivin，livin結(jié)合，而這些凋亡抑制蛋白又在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，因此利用smac多肽作為標(biāo)記對(duì)象對(duì)腫瘤進(jìn)行顯像，具有很好的立論基礎(chǔ)。加之多肽具有組織滲透迅速

33、、血液中清除快、免疫原性低、合成方便以及核素標(biāo)記方法成熟的特性，技術(shù)上具有較高的可行性。 課題組成員均是具有豐富研究經(jīng)驗(yàn)的研究者，課題組所在研究機(jī)構(gòu)具有較好的研究條件與完善的研究設(shè)備，為研究工作提供了堅(jiān)實(shí)的硬件基礎(chǔ)。特色與創(chuàng)新 基于smac多肽能與腫瘤中高表達(dá)的凋亡抑制蛋白結(jié)合的特性，首次提出對(duì)smac多肽標(biāo)記，針對(duì)凋亡相關(guān)家族進(jìn)行腫瘤顯像。不僅可以反復(fù)多次顯像，還可量化凋亡抑制蛋白表達(dá)水平，評(píng)估療效，提示預(yù)后。該方法的建立可擴(kuò)展腫瘤核素顯像方法，并可繼續(xù)深入研究，進(jìn)行腫瘤靶向治療，因此有很好的研究前景。年度研究計(jì)劃2007.1-2007.6 合成99m tc-smac a，b，c及其標(biāo)記物放

34、化性質(zhì)測(cè)定2007.6-2007.12 大腸桿菌克隆xiap，survivin，livin，表面等離子體共振技術(shù)測(cè)定標(biāo)記物與iap蛋白結(jié)合的kd值2008.1-2008.3 蛋白99m tc-smac a，b，c腫瘤細(xì)胞攝取2008.4-2008.12 測(cè)定99m tc-smac a，b，c在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)分布、血液清除、體內(nèi)代謝。動(dòng)物體內(nèi)顯像，研究腫瘤的最佳顯像時(shí)間2009.1-2009.5 評(píng)價(jià)腫瘤治療后的療效2009.6-2009.12 數(shù)據(jù)處理及論文撰寫與發(fā)表預(yù)期研究結(jié)果利用99m tc標(biāo)記smac穿透肽，實(shí)現(xiàn)腫瘤顯像，量化凋亡抑制蛋白表達(dá)水平，評(píng)估療效，提示預(yù)后。通過(guò)理論探索和技術(shù)

35、研究，使之可達(dá)到下一步開展臨床應(yīng)用研究的目的。顯像方法可申請(qǐng)技術(shù)發(fā)明專利，被開發(fā)為臨床應(yīng)用產(chǎn)品。通過(guò)省部級(jí)鑒定，申請(qǐng)科技成果獎(jiǎng)。在sci收錄雜志發(fā)表論文23篇，研究結(jié)果在國(guó)際、國(guó)內(nèi)會(huì)議上交流。二研究基礎(chǔ)與工作條件工作基礎(chǔ) 本課題申請(qǐng)者在博士期間承擔(dān)國(guó)家自然基金課題nis和tpo基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)131i靶向治療的研究工作，具有扎實(shí)的核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并熟練掌握分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，發(fā)表相關(guān)論文3篇 ，并參加了第八屆亞太核醫(yī)學(xué)和生物學(xué)大會(huì)，口頭交流該課題研究結(jié)果。在前期的工作中，參加了實(shí)驗(yàn)室對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和惡性黑色素腫瘤中caspase和iap家族等凋亡調(diào)控蛋白的表達(dá)模式和水平及生物學(xué)意義研

36、究的工作，并獨(dú)立承擔(dān)構(gòu)建重組人smac基因的腺病毒載體，在惡性黑色素瘤、前列腺癌細(xì)胞株中進(jìn)行生物學(xué)行為的研究，因此對(duì)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與腫瘤發(fā)生有較深入的理解和研究。本課題申請(qǐng)人和研究小組成員熟悉課題相關(guān)的學(xué)術(shù)前沿和動(dòng)態(tài)，具有豐富的研究工作經(jīng)驗(yàn)和研究技術(shù)。工作條件已具備的實(shí)驗(yàn)條件spect 2臺(tái)beckman hplc 1臺(tái)超速低溫離心機(jī) 1臺(tái)icon核醫(yī)學(xué)專業(yè)計(jì)算機(jī) 2臺(tái)超凈工作臺(tái) 1臺(tái)質(zhì)譜儀 1臺(tái)表面共振儀 1臺(tái)超低溫冰箱 1臺(tái)生物搖床 1臺(tái)co2 孵箱 1臺(tái)lkb-自動(dòng)層析分離儀 1臺(tái)beckman 純水儀 1臺(tái)pcr儀 1臺(tái)-80超低溫冰箱 1臺(tái)紫外分光光度儀 1臺(tái)、自動(dòng)色層掃描儀 1臺(tái)

37、紫外可見自動(dòng)掃描分光光度計(jì) 1臺(tái)登記序號(hào)： 項(xiàng)目編號(hào)：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目課題設(shè)計(jì)書課題名稱：痛痹顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)理研究申報(bào)單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 朱萱萱計(jì)劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報(bào)日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項(xiàng)依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)；選題的理論和實(shí)踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說(shuō)或技術(shù)構(gòu)思，主要研究?jī)?nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說(shuō)明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗(yàn)方法及

38、技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項(xiàng)研究的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗(yàn)情況。五、計(jì)劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計(jì)劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費(fèi)概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計(jì)劃。填寫說(shuō)明一、內(nèi)容填寫自備附頁(yè)，用紙大小和封頁(yè)一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報(bào)要求上報(bào)。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實(shí)填寫。三、封面上“登記序號(hào)”“項(xiàng)目編號(hào)”請(qǐng)勿填寫。1、 立項(xiàng)依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoa

39、rthritis，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高，據(jù)調(diào)查，在美國(guó)目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬(wàn)，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國(guó)，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計(jì)劃生育政策的長(zhǎng)久實(shí)施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，oa的發(fā)病率還將越來(lái)越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對(duì)社會(huì)也將造成很大負(fù)擔(dān)。

40、同時(shí)世界其他國(guó)家也面臨著同樣的問(wèn)題，因而oa引起了國(guó)際、國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來(lái)對(duì)oa的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測(cè)手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來(lái)說(shuō)還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。西藥治療o(wú)a的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點(diǎn)。雖然中藥治療o(wú)a也取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療o(wú)a的療效在國(guó)際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢(shì)近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)oa進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.

41、1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)，患病率也有增高的趨勢(shì)。felson等報(bào)道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報(bào)道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國(guó)內(nèi)陳順樂等隊(duì)13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀

42、性oa患病率2.2%；無(wú)癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國(guó)在衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國(guó)內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)減少50%

43、。 saase等調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國(guó)雖未作全國(guó)大范圍的普查，但隨著老齡化社會(huì)進(jìn)程的不斷加快，oa的發(fā)病率會(huì)越來(lái)越高，這必將給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)眾多學(xué)者對(duì)oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說(shuō)，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說(shuō)：由于骨血液動(dòng)力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提

44、下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說(shuō)：認(rèn)為自由基對(duì)軟骨細(xì)胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤(rùn)，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作

45、用能釋放大量o2-和h2o2；細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)：細(xì)胞因子對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（il-1）、白細(xì)胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時(shí)il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動(dòng)因子；軟骨酶降解學(xué)說(shuō)：oa軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過(guò)程，這些酶類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所

46、有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對(duì)金屬蛋白酶組織抑制劑無(wú)影響，使二者失衡從而增加對(duì)軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說(shuō)：no是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時(shí)使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖

47、酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會(huì)引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過(guò)程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩種相互獨(dú)立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無(wú)關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介導(dǎo)。典型

48、的oa不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡以no途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí),則通過(guò)as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過(guò)兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理?xiàng)l件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除no途徑和f

49、as途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療o(wú)a的藥物較多，西藥治療o(wú)a主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點(diǎn)是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對(duì)胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長(zhǎng)期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價(jià)格不菲，而且由于過(guò)分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過(guò)分運(yùn)動(dòng)，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長(zhǎng)期療效來(lái)看反而不佳，最新觀點(diǎn)認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療o(wú)a的首選藥，但尚有一定爭(zhēng)議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價(jià)格昂貴

50、，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問(wèn)世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費(fèi)用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療o(wú)a的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問(wèn)題：多屬臨床經(jīng)驗(yàn)，無(wú)對(duì)照組，特別是西藥對(duì)照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國(guó)際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來(lái)尋找治療o(wú)a的中藥。未針對(duì)oa發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動(dòng)物試驗(yàn)從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來(lái)探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長(zhǎng)期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa

51、的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運(yùn)用活血化淤藥治療o(wú)a提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對(duì)其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨(dú)活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療o(wú)a，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報(bào)道用本方加減治療104例，總有效率91.

52、3%。1.2.4 實(shí)驗(yàn)研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對(duì)oa發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識(shí)，對(duì)oa的實(shí)驗(yàn)研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)，現(xiàn)已使用針對(duì)oa的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容主要有以下幾個(gè)方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗(yàn)一般均可通過(guò)建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來(lái)完成，也可通過(guò)使用其它相似的模型檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來(lái)檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動(dòng)物通過(guò)檢測(cè)體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對(duì)oa影響的實(shí)驗(yàn)中，一般采用硝酸還原酶法來(lái)測(cè)定no含量，運(yùn)用p

53、t-pcr技術(shù)測(cè)定nos基因表達(dá)。il-1、il-6、tnf等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來(lái)越多地被作為檢測(cè)指標(biāo)使用到實(shí)驗(yàn)研究中來(lái)。1.3 選題的理論和實(shí)踐依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無(wú)骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來(lái)看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動(dòng)受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)oa發(fā)病機(jī)理的深入研

54、究，我們?cè)谘a(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對(duì)緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對(duì)備急千金要方中的獨(dú)活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨(dú)活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達(dá)四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時(shí)防諸藥辛燥太過(guò)。諸藥合用共起補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護(hù)軟骨。通過(guò)36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表

55、明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對(duì)痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尤其是該方對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與增殖機(jī)理做進(jìn)一步的研究，冀能證實(shí)痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機(jī)制，并初步探討本病發(fā)病的可能機(jī)理，為新藥問(wèn)世提供客觀的依據(jù)，所以進(jìn)行設(shè)計(jì)并立題。1.4本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚(yáng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝oa模型，從發(fā)病機(jī)理探討本藥的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用可靠地國(guó)際公認(rèn)的方法復(fù)制動(dòng)物模型，并采用最新的檢測(cè)指標(biāo)il-1、tnf、sod、mda、no等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)oa發(fā)病機(jī)制的最新研究成果，

56、從生化、免疫等多個(gè)角度多個(gè)層次，系統(tǒng)觀察并進(jìn)行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進(jìn)，冀能填補(bǔ)省內(nèi)外運(yùn)用中藥治療o(wú)a的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步從細(xì)胞水平（包括本藥對(duì)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對(duì)oa的長(zhǎng)久作用及影響，從而達(dá)到擠身國(guó)際先進(jìn)水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療o(wú)a的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機(jī)理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問(wèn)世，具有公認(rèn)療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評(píng)價(jià)體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療o(wú)a的療效機(jī)理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨(dú)活寄生湯進(jìn)行加減所得，并采用可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图白钚碌膰?guó)際公認(rèn)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)oa的確切療效及作用機(jī)理，這必將對(duì)oa的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時(shí)對(duì)臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。隨著改革開放的形勢(shì)發(fā)展，以及中國(guó)加入wto與國(guó)際接軌的進(jìn)程的不斷完善，祖國(guó)醫(yī)學(xué)國(guó)際地位不斷的提高，我