病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)--(以新城疫為例)

1、實(shí)踐二病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)-（以新城疫為例）實(shí)踐目的：1 掌握血凝（HA和血凝抑制（HI）試驗(yàn)的原理2 掌握雞新城疫病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)的操作方法實(shí)踐原理：某些病毒（如雞新城疫病毒，禽流感病毒等）能夠與人或動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集， 此即為 紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可于病毒懸液中加入特異性抗體 （免疫血清）所抑制, 即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。實(shí)踐內(nèi)容：1. 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA試驗(yàn)）主要是測(cè)定病毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)，以確定紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所用病毒稀釋倍數(shù)（抗原單位）。有試管法和微量法兩種，現(xiàn)以常用的微量法進(jìn)行說明。雞新城疫病毒的HA試驗(yàn)現(xiàn)采用微量法，在 V形微量反應(yīng)板上進(jìn)行。（1）首先用

2、微量移液器向每個(gè)孔加入稀釋液即滅菌生理鹽水一滴（25卩I）。（2）用微量移液器取病毒抗原液25卩1加入第1孔內(nèi)，吸頭浸于液體中緩慢吸吹幾次使病毒與稀釋液混合均勻，再吸取251液體小心地移至第 2孔，如此連續(xù)稀釋至第11孔，第11孔吸取25 1液體棄掉；病毒稀釋倍數(shù)依為1:21:2048，第12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。（3）再以微量移液器每孔加1.0 %紅細(xì)胞懸浮液1滴（25卩I）。（4）在振蕩器上振蕩混勻約 I2分鐘，再置37 C作用15分鐘后觀察結(jié)果。（5）每次測(cè)定樣品都應(yīng)同時(shí)做紅細(xì)胞對(duì)照。表1雞新城疫血凝效價(jià)（HA）的測(cè)定術(shù)式（微量法）孔號(hào)123456789101112病毒稀釋倍數(shù)1:21:41:

3、81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 對(duì)照生理鹽水病毒液2525卩125125卩25馬 25可2525 g!25125 ”125g1 225gl 4 25g1、25g1 Q525125 卩1棄去1%紅細(xì)胞懸液 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 感作置振蕩器上混勻12分鐘，放37 C靜置15分鐘結(jié)果例示#+-#表示100%完全凝集+表示50%凝集-表示不凝集結(jié)果判定：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于管底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者沉淀,表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝

4、集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說明紅細(xì)胞被病毒所凝集。能使100%紅細(xì)胞凝集的病毒液的最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒液的紅細(xì)胞凝集效價(jià)。如上例：病毒液的HA效價(jià)為1:128，HI試驗(yàn)時(shí)，病毒抗原液 25微升內(nèi)須含4個(gè)凝集單位，則應(yīng)將原病毒液作成128/4 = 32倍的稀釋液。2.紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HI試驗(yàn))有試管法和微量法兩種，現(xiàn)以常用的微量法進(jìn)行說明。(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀釋液(即25卩I)，從第1孔到第10孔。第1I孔加稀釋液2滴(50卩I)。(2)以微量移液器取被檢血清25卩I，放入第1孔，吸頭浸于液體中緩慢吸吹幾次使被檢血清與稀釋液混合均勻，再

5、吸取25卩1液體小心地移至第 2孔，如此連續(xù)稀釋至第 10孔,最后第十孔吸取25 1液體棄掉；被檢血清稀釋倍數(shù)依為1:21:1024，第11孔為紅細(xì)胞對(duì)照，第十二孔為抗原對(duì)照。(3) 每孔再加入含有四個(gè)單位的病毒液1滴(25卩I)至第10孔，第1I孔為紅細(xì)胞對(duì)照孔，不加病毒液；第十二孔為抗原對(duì)照，加病毒液。(4) 置振蕩器上振蕩I2分鐘后，放37 C靜置20分鐘。(5) 每孔再加入1.0 %紅細(xì)胞懸浮液1滴(25卩I)放振蕩器上振蕩I2分鐘混勻，置37C,15分鐘后判定結(jié)果。表2雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制(H1)試驗(yàn)(微量法)孔號(hào)123456789101112被檢血清稀1:21:41:81:161

6、:321:641:121:251:511:10紅細(xì)包抗原釋倍數(shù)86224對(duì)照對(duì)照生理鹽水25卩125 g125 gl25 gl25gl25 g25gl25gl25gl25glL150 gl25 gl被檢血清25 glJgl卜85glS5gl、5gl05 g、5gl25gl25gl、glfglJ_JJ-JJJ棄掉4單位病毒液25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl振蕩器上振蕩12分鐘，放37 C作用20分鐘1%!細(xì)胞懸液25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 g

7、l25 gl振蕩器上振蕩12分鐘，放137 C作用15分鐘結(jié)果例示-+#-#注： -表示不凝集、+表示部分凝集、#表示完全凝集。結(jié)果判定：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于管底的細(xì)細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者為沉 淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾 斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說明紅細(xì)胞被病毒所凝集。能將4單位病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)，用被檢血清的稀釋倍數(shù)或以2為底的對(duì)數(shù)(10g2)表示。如上例，該血清 的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)為 1：128 或 HI 效價(jià)為 7（10g2） 。 結(jié)果分析：（1）一般認(rèn)為雞的

8、免疫臨界水平為 1:8（ 成年）或1:16（ 雛雞） ，隨地區(qū)不同而稍有差異。（2）雞血清 HI 抗體效價(jià)高于 1:16 時(shí)可適當(dāng)推遲新城疫免疫的時(shí)間， HI 抗體效價(jià)在 1:16 以下，須進(jìn)行新城疫疫苗接疫種， 在新城疫流行的地區(qū)或雞場(chǎng)， 雞的免疫臨界水平應(yīng)稍提高。（3）雞群的HI抗體水平是以抽檢樣品的 HI抗體效價(jià)（噸2）的平均值表示的。如果某雞群的10份樣品中，HI抗體效價(jià)（噸2）為8的有3份樣品，為7的有5份樣品, 為 6的有 2份樣品，它們的平均值為：8 X 3 + 7 X 5+ 6X 2/3 + 5+ 2= 7.1平均水平在4（10g2）以上，說明該雞群為免疫雞群。若在檢樣中 HI

9、 抗體效價(jià)的最高值與最低值相差太大時(shí)，則不能用上法計(jì)算平均水平，應(yīng)根 據(jù)臨界水平以下的樣品數(shù)在全部樣品中所占的百分比決定免疫與否。（4）大型養(yǎng)雞場(chǎng)， 每次進(jìn)行抽測(cè)時(shí)，抽樣率一般不低于 0.1 一 0.5 ，小型雞群，抽樣 率應(yīng)有所增加，一般認(rèn)為理想的抽樣率應(yīng)為 2.0 。（5）雞群接種新城疫疫苗后， 經(jīng)23周測(cè)血清中的HI抗體效價(jià)，若提高2個(gè)滴度以上， 表示雞的免疫應(yīng)答良好，疫苗接種成功；若 HI 抗體效價(jià)無明顯提高，表示免疫失敗。作業(yè)：1 每三位學(xué)生做一個(gè)血凝試驗(yàn)，測(cè)定出新城疫病毒的血凝效價(jià)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。2根據(jù)血凝價(jià)將新城疫病毒稀釋成 4 個(gè)單位病毒液， 每三位學(xué)生做一個(gè)血凝抑制試驗(yàn)， 檢

10、測(cè)待檢血清的血凝抑制效價(jià)，記錄試驗(yàn)結(jié)果3回答問題：（1）病毒的血凝和血凝抑制試驗(yàn)的原理是什么？（ 2）病毒血凝反應(yīng)是抗原抗體反應(yīng)嗎，為什么？（ 3）病毒血凝抑制反應(yīng)是抗原抗體反應(yīng)嗎，為什么？實(shí)踐三 病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn) - （以新城疫為例）（一）實(shí)踐目的：1、掌握血凝及血凝抑制試驗(yàn)的基本方法及原理2、掌握雞新城疫的試驗(yàn)室診斷技術(shù)。（二）實(shí)踐內(nèi)容與基本要求：實(shí)踐原理：某些病毒，如雞新城疫、禽減蛋綜合癥等，有能凝集動(dòng)物紅細(xì)胞的特性，此 即紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 這些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素， 能與動(dòng)物的紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體 結(jié)合， 發(fā)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 可以利用這一特性判斷被檢材料中有無病毒的存在，

11、 并可以測(cè) 定病毒的效價(jià)。1、 血凝試驗(yàn)： 常多用感染雞胚液進(jìn)行， 凝集價(jià)可達(dá) 1:160-1:640 也可采用急性病例的組但凝集性能不夠穩(wěn)定，故通常 取血后加抗凝劑或脫纖維， 置于 1%生理鹽水懸液， 即可應(yīng)用。 操織浸出液， 但凝集價(jià)較低。本病毒可凝集許多動(dòng)物的紅細(xì)胞， 作血凝試驗(yàn)時(shí)都采用雞的紅細(xì)胞采血部位為心臟或翅靜脈， 離心機(jī)中搖轉(zhuǎn)加生理鹽水洗滌三次后， 將濃縮的紅細(xì)胞配成 作方法見實(shí)習(xí)指導(dǎo)。凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒的血凝滴度。2、 血凝抑制試驗(yàn)： 單純地使用血凝試驗(yàn)還不能作出明確的診斷， 因?yàn)檫€有其它病原也能引 起紅細(xì)胞凝集， 如引起慢性呼吸道病的禽敗血支

12、原體。 所以需用已知的抗血清作血凝抑制試 驗(yàn)，以鑒別病毒。也可用已知病毒來測(cè)定病雞血清中的抗體， 而得明確的診斷。但不適于急 性病例，通常要在感染后的 5-10 天，或出現(xiàn)呼吸癥狀后的 2 天，血清中的抗體到一定水 平，就可用試管法。（三）主要器材與藥品器材：離心機(jī)、試管架、試管、注射器、針頭 5-5.5號(hào)、感染雞胚，微量移液器 1套，V型、96 孔板，滴頭，微量振蕩器，塑料采血管，藥品： 病毒：雞新城疫弱毒疫苗； 0.85%生理鹽水、 1%紅細(xì)胞渾懸液、血清、 4單位病毒。 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；濃縮抗原； 0.5%紅細(xì)胞渾懸液；被檢血清； pH7.0 7.2 磷酸緩沖鹽稀釋 液；pH7.0 7.2

13、磷酸緩沖鹽稀釋液： 氯化鈉（GB1266-77） 170g ;磷酸二氫鉀（GB1274-77）13.6g ;氫氧化鈉（GB629-77）3.0g ;蒸餾水1000ml;高壓滅菌，4保存，使用是作 20倍 稀釋。雞 1%紅細(xì)胞懸浮液：由健康來航公雞羽根靜脈采血迅速置于裝有抗凝血?jiǎng)?%檸檬酸鈉溶液）的離心管中，用生理鹽水洗滌 3次，每次以 3000r/min 離心 10分鐘，將血漿、白細(xì)胞 等充分洗去，根據(jù)沉淀的紅細(xì)胞壓積，用PH=7的生理鹽水稀釋成1%懸浮液。被檢血清： 每群雞隨機(jī)采 20 30 份血樣，分離血清。采血法：先用三棱針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至68cm長(zhǎng)。將管一端燒融封

14、口， 待凝固析出血清后以 1000r/min 離心 5 分鐘， 剪斷塑料管， 將血清倒入一塊塑料板小 孔中，若需較長(zhǎng)時(shí)間保存，可在離心后將凝血塊一端剪去，滴融化石蠟封口，于0 C 保存。（四）實(shí)踐方法操作方法4.1 微量血凝試驗(yàn)4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加 磷酸緩沖鹽 稀釋液 50ul ，共滴四排。4.1.2 吸取 1:5 稀釋抗原 滴加于第一列孔，每孔 50ul ，然后由左至右順序倍比稀釋至第 11 列孔，再從第 11 孔各吸取 50ul 棄之。最后一列不加抗原作對(duì)照。4.1.3 于每孔加入 0.5%紅細(xì)胞懸液 50ul。4.1.4 置微型振蕩器上振蕩 1 分鐘，或手持血凝板繞圓圈混

15、勻。4.1.5 放室溫下（ 1820oC） 3040 分鐘，根據(jù)血凝圖象判定結(jié)果。以出現(xiàn)完全凝集的抗原 最大稀釋度為該 抗原的血凝滴度 。每次四排重復(fù)，以幾何平均值表示結(jié)果。4.1.6計(jì)算出含4個(gè)血凝單位的抗原濃度，按式（B1）進(jìn)行計(jì)算。抗原應(yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4 .（B1）材料123h910L12生理益 水2 b齒0500 SO J:51% 虹細(xì)胞：505W5050505050稀釋 倍數(shù)121161/32丄皿1 1281/2561/5121 10241 2048詰果凝礙礙不不不車凝上述材料全部按順序加完后，振蕩96孔板，使紅細(xì)胞與病毒充分接觸，然后置于20-22 C室溫中靜置，自第15分鐘

16、開始觀察結(jié)果，每5分鐘檢查一次，至60分鐘結(jié)束，觀察結(jié)果時(shí)注意不要搖震96孔板。如果被檢材料中有病毒的存在，就會(huì)出現(xiàn)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集反應(yīng)者,凝集成片或碎片，呈傘狀鋪于管底，不凝集的紅細(xì)胞沉積于管底，呈一小圓點(diǎn)，將板傾斜，可以看 到沉積于底板上的紅細(xì)胞沿傾斜面呈線狀流動(dòng)（五）結(jié)果觀察：1 首先觀察對(duì)照孔，紅細(xì)胞應(yīng)無凝集。2 觀察實(shí)驗(yàn)孔+全部紅細(xì)胞凝集，凝集的紅細(xì)胞鋪滿管底，邊緣不整齊，無紅細(xì)胞沉積。+大部分紅細(xì)胞凝集，在管底鋪成薄膜狀，但尚有少數(shù)紅細(xì)胞不凝，在管底中心形成小 紅點(diǎn)。+約有半數(shù)紅細(xì)胞凝集，在管底鋪成薄膜，面積較小，不凝集的紅細(xì)胞在管底中心聚成小 圓點(diǎn)。+只有少數(shù)紅細(xì)

17、胞凝集，不凝集的紅細(xì)胞在管底中心聚成小圓盤狀，凝集的紅細(xì)胞在此小圓 盤周圍。-不凝集，紅細(xì)胞沉于管底，成一致密圓盤，邊緣整齊。病毒血凝呈現(xiàn)的不同程度凝集強(qiáng)度凝集效價(jià)：能使紅細(xì)胞呈 +凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價(jià)，表示含有一個(gè)單位血凝抗原。如上述第7孔為+，則該病毒懸液效價(jià)為 1: 128,即病毒稀釋到1: 128時(shí)，每50卩I 中含一個(gè)血凝單位的病毒。凝集孔數(shù)越高，病毒凝集效價(jià)越高4單位病毒：血凝試驗(yàn)（HA ）測(cè)出病毒的 HA價(jià)，配制成4單位病毒，裝于疫苗瓶中冷凍 備用。病毒的血凝實(shí)驗(yàn)（HA ）結(jié)果分析病毒的血凝實(shí)驗(yàn)（HA）結(jié)果分析（五）雞新城疫微量血凝抑制試驗(yàn)5.2.1先取稀釋液50ul，

18、加入微量血凝板的第一孔，再取濃度為4個(gè)血凝單位的抗原依次加入312孔，每孔50ul，第二孔加濃度為 8個(gè)血凝單位的抗原 50ul。5.2.2吸被檢血清50ul于第1孔（血清對(duì)照）中，擠壓混勻后吸50ul于第2孔，依次倍比稀 釋至12孔，最后棄去50 ul.5.2.3置室溫（18 20C ）下作用20分鐘.5.2.4滴加50ul 0.5%紅細(xì)胞懸液于各孔中，振蕩混合后，室溫下靜置30 40分鐘，判定結(jié)果 5.2.5每次測(cè)定應(yīng)設(shè)已知滴度的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對(duì)照.結(jié)果判定1在對(duì)照出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制 滴度.2若有10%上的雞出現(xiàn)11（log 2）以上的高血凝抑制滴度，說明雞群已受新城疫強(qiáng)毒感染.3若監(jiān)測(cè)雞群的免疫水平，則血凝抑制滴度在 4（log 2 ）的雞群保護(hù)率為 50%右；在4（log 2） 以下的保護(hù)率達(dá) 90%-100%;在4（log 2）以下的 非免疫雞群保護(hù)率約為9