地中海實蠅幼蟲分子鑒定

1、地中海實蠅幼蟲分子鑒定摘 要 通過對從秘魯進口的葡萄中截獲實蠅類幼蟲進 行its區(qū)和線粒體coi, ecu, can、ND5基因序列的擴增和測 序，并與GenBank中對應的序列進行比對，結(jié)果表明，截獲樣品 ITs 區(qū)序列和地小海實蠅 ceratitis captitata(Wiedemann) 同源 性為 95.16 %(其小 ITSl 為 99.52 %, ITS2 為 86.2 %)，線粒體 COI, ecu, con, ND5基因序列和地中海實蠅 C.capttata 同 源性為100%, 99.9 %, 99.5 %, 99.8 %;基于COI序列構(gòu)建的 系統(tǒng)發(fā)育樹中, 幼蟲樣品和地

2、中海實蠅最為接近。 根據(jù)序列分析 和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析的結(jié)果, 將截獲的實蠅類幼蟲鑒定為地中海 實蠅 C.capttata 。地中海實蠅 Ceratits capitata(Wiedemann) 屬雙翅目 Diptera 、實蠅科 Tcphdtidac 、蠟實蠅屬 Ceratits ,是一種對水 果和蔬菜極具破壞性的危險性有害生物, 它幾乎可危害所有對人 類有價值的水果作物, 其成蟲在寄主果實的表皮下產(chǎn)卵, 幼蟲孵 化后鉆蛀入寄主果實內(nèi)取食、生長,造成果實腐爛,使之不能食 用而失去經(jīng)濟價值。 該蟲對水果種植業(yè)具有毀滅性的損害, 曾經(jīng) 使地中海地區(qū)一些國家種植的核果受害率高達100%。其防治費用相

3、當可觀，19861991年，6年時間內(nèi)美國共進行了 10多次 大規(guī)模的根除行動,耗資達 1.5 億美元。因此,針對地中海實蠅 這一高度危險性有害生物,許多國家制訂了十分嚴格的檢疫法 規(guī)，由此給地中海實蠅分布國家的水果以及農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易設置 了很大的技術(shù)貿(mào)易障礙。 地中海實蠅不僅可以在經(jīng)濟上造成不可 估量的巨大經(jīng)濟損失，而且對出口貿(mào)易造成極其深遠的不良影 響。目前，實蠅類害蟲的種的鑒定主要依據(jù)成蟲的形態(tài)特征， 而 卵、幼蟲、蛹由于其特征差異小，且有些特征在其不同的發(fā)育時 期不夠穩(wěn)定，因此依據(jù)形態(tài)學鑒定方法很難保證鑒定的準確度。 即使地中海實蠅的幼蟲能依據(jù)形態(tài)學進行鑒定， 但很大程度上依 賴鑒定人

4、員豐富的鑒定經(jīng)驗， 這就制約了不同地區(qū)相關(guān)工作的進 一步開展。 在口岸檢疫工作中， 通常要將幼蟲培養(yǎng)到成蟲再進行 鑒定，整個檢疫鑒定過程時間長達數(shù)周， 無法適應實際工作需要。分子生物學技術(shù)在昆蟲領域的應用主要集中在系統(tǒng)演化及 分類鑒定兩方面。昆蟲系統(tǒng)進化的研究，探索了昆蟲屬、種間的 關(guān)系，從分子水平找出其種間特異性差異， 從而為昆蟲的分類鑒 定奠定基礎。 而通過昆蟲分類鑒定和系統(tǒng)進化的研究， 可以為昆 蟲發(fā)育早期蟲態(tài)的鑒定提供必要的研究方法。 Taylor 等利用 PCR-RFLP技術(shù)可以鑒定保存在酒精中的或針插的從卵到成蟲各 發(fā)育階段的嗜人錐蠅樣品，方法快速，在 24h 內(nèi)即可完成。吳佳 教

5、等也利用PCR-RFLP技術(shù)快速鑒定我國南方常見的 6種寡毛實 蠅 Bactrocera 。李正西和沈佐銳利用 rDNA-ITS2 序列探討了赤 眼蜂屬 Trichogramma 不同種分子鑒定的可行性。為了能夠準確及時對截獲的實蠅幼蟲進行鑒定， 我們嘗試了應用分子生物學方法對秘魯進口葡萄中截獲的實蠅幼蟲進行鑒 定和初步研究。試驗中擴增了幼蟲樣品mtDNA部分基因序列和ITS區(qū)序，將樣品序列與Gen Ba nk中相近物種序列進行同源性比 對，通過序列分析的方法對截獲的實蠅幼蟲進行鑒定。 以期開拓 快速準確的地中海實蠅幼蟲鑒定方法， 同時也可為探索截獲地中 海實蠅的來源地提供遺傳學證據(jù)。1 材料

6、和方法1 1 供試實蠅材料 供試實蠅幼蟲樣品來源于上海出入境檢驗檢疫局 2006年 3 月在秘魯進口葡萄中截獲的蟲樣， 樣品浸泡于無水乙醇并置于 20C冰箱中儲存，編號為 PU-。1. 2 DNA提取取截獲的實蠅幼蟲 1 條放人研缽，加入液氮，磨成粉末狀，用 DNeasyRTissue Kit(Qiagen 公司) 提取樣品 DNA。1 . 3 引物設計根據(jù) Gen Ba nk 中地中海實蠅 C.capitataAFI89691 ,AJ242872 和油橄欖實蠅 Bactroceraoleae AY210702, AY210703等實蠅的ITS 和 mtDNA序列，分別設計了擴增 ITS 區(qū)(

7、CFl/CRl , CF6/CR5)、 COI (FC02/RC04)、CCE (F1/F4)、CCE (F32/F35)和 ND5(F13/R12) 的引物，引物由上海生工合成 (表 1)。1. 4 PCR擴增PCF反應體系總體積為 30卩L,包含：10mmoI/L Tris-HCI :50 mmol/L KCl ；2.5 mmol/LMgCl2 ； dATP，dGTP，dCTP，dTTP 濃度各為250卩mol/L ;引物濃度各為100nmol/L ; 1卩L模板DNA 1UTaq DNA聚合酶(上海生工)。PCF反應循環(huán)參數(shù)：94C 3min ; 94C 30s，55C 30s , 72

8、C 2min 30s ,40 個循環(huán)；72C 10min。1 5 擴增產(chǎn)物分析取10卩L PCR產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠1X TAE緩沖液中電 泳，EB染色，用凝膠分析成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)觀察并記錄 PCR產(chǎn)物電泳條帶。1 6 序列測定和分析PCR產(chǎn)物用 DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa公司)純化，純化產(chǎn)物由上海生工公司雙向測序。 測序結(jié)果進行剪接核 實后登錄GenBank測序獲得的序列用軟件 DNAStar與GenBank 中相關(guān)種類實蠅序列進行同源性分析， 并構(gòu)建相關(guān)種類的系統(tǒng)發(fā) 育樹。2 結(jié)果與分析PCFT增產(chǎn)物測序后獲得實蠅幼蟲COI

9、, CCE, COD, ND5和 ITS 序列，GenBank登錄號分別為：DQ456861 DQ456862 DQ456863 DQ456864和 DO490237,每段序列分別在 GenBank中 BLAST分析，線粒體基因 COI , Cd, COD和ND5序列都和地中 海實蠅 C.capitata CCA242872 的相應的線粒體基因序列最為接 近；COI, Cd, COD和ND5序列和相應基因序列的同源性分別 是 100%(1475/1475) ，99.9%(686/687) ，99.5%(785/789) ， 99.8(563/564)。ITS 序列也和地中海實蠅 C.capit

10、ata AFI89691 序列最為接近，同源性為95.16 % (1633/1716)，其中ITS1和ITS2 的同源性分別為 99.52(827/831) 和 86.2 (431 /500) 。GenBank中已登錄的實蠅類線粒體序列中以COI序列居多，以CCE序列為分析區(qū)域，利用DNAstar中MegAlign軟件，采用Clustal V方法構(gòu)建地中海實蠅及其近似種實蠅的系統(tǒng)進化 發(fā)育樹 ( 圖 1) 。從圖中可見截獲幼蟲樣品和地中海實蠅C.capitata 以及 C.caeteate 同屬一個類群組中， 與 C.capitata 更為接近。實蠅幼蟲樣品 COI序列PU-I DQ45686

11、1與地中海實 蠅 CCA242872， DQ01 1888， DQ006887， AY788415， C.caeteate AY788414的 COI 序列同源性分別是：100%, 95.4 %, 100%, 99.7 %和 99.1 %，實蠅幼蟲樣品COI序列DQ45686I和CCH序列DQ456862分 別與 Ge nBank 中南美按實蠅 An astrepha fraterculus(COI:DQ116203 CCE: DQll6549)的序列比對并進行 Sequenee distance 分析，發(fā)現(xiàn) PU-1 與按實蠅的相似性僅為 83%和 84%。根據(jù)上述的序列分析結(jié)果，將截獲的實

12、蠅幼蟲 PU-l 鑒定為 地中海實蠅 C.capitata 。3 討論20世紀80年代PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展加速了分子生物技術(shù) 在生物學等研究領域的廣泛應用。 用分子生物技術(shù)研究昆蟲遺傳 進化和系統(tǒng)發(fā)育開始于 20世紀80年代末，此后得到了迅猛發(fā)展。其中研究焦點之一是： 通過對昆蟲遺傳物質(zhì)的研究， 探討不同分 類階元上的昆蟲類群之間的系統(tǒng)發(fā)育、 進化機制和種群遺傳變異 及分化等。mtDNA序列是目前應用最為廣泛的遺傳物質(zhì)之一， mtDNA是一個封閉的環(huán)狀雙鏈，大小為15.416.3kb ,其變異速率高于保守的核基因。昆蟲mtDNA勺各個基因已被廣泛用于昆蟲 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析、種群進化、種群遺傳

13、變異和分化、近緣種鑒 別和種下分類單元鑒定等方面，除了 mtDNA以外，昆蟲系統(tǒng)學研究中還涉及編碼核核糖體 RNA基因rDNA中的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (intemal transcribedspacer ， ITS) 基因。由于實蠅類昆蟲種類繁多， 比如， 亞太地區(qū)的離腹寡毛實蠅 屬 Bactrocera 就有 32 個亞屬， 500 種之多，部分種之間的形態(tài) 特征十分相近， 難以區(qū)分， 甚至有些種類如橘小實蠅 Bactrocera dorsal 被認為是由 52 個姐妹種組成的復合種； 另一方面， 我們 在對橘小實蠅COI序列的研究中發(fā)現(xiàn)，同一種類不同地理來源 的種群之間存在的序列差異不亞于相近種之

14、間的差異 (未發(fā)表 )。 這些都給分子生物學方法鑒定種類帶來了不小的難度。 為了確保 鑒定的準確性，試驗中分析了coi, ecu, can, ND5和 its等多段序列和地中海實蠅相應序列之間的差異， 分析結(jié)果均表明截 獲的幼蟲與地中海實蠅最為接近。在分析coi序列的過程中，我們注意到幼蟲樣品的 can序 列和一個地中海實蠅 DQ011888的相似性只有 95.4 %(726/761), 而和 c.caeteate AY788414 的同源性達 99.1 (754/761)( 由于我們沒有該物種的標本及詳細的參考資料，有待今后進一步研 究。但幼蟲樣品PU-1和另外一個地中海實蠅 DQ01188

15、8的同源性 達到 100。此外其它線粒體基因序列和ITS 序列的同源性分離結(jié)果都表明幼蟲樣品和地中海實蠅的更為接近。在測序得到的17S區(qū)的序列中，ITSI與C.capitata AFI89691 的同源性為 99.52 % (827/ 831)，與 Gen Ba nk 中其它 C.capitata 的 ITSI 的同源性也在 99.5 左右，但是， ITS2 與 C.capitata AFI89691 的同源性僅為 86.2 %(431/ 500) ，由于 GenBank上發(fā)布的C.capitata ITS2序列很少，不能進一步了解這種差異是否是地中海實蠅來源地不同而產(chǎn)生的。不同線粒體基因序列之間，can的變異速度比其它選用的基 因要快。通過PU-IDQ45686I與地中海實蠅CCA242872 CO序列 的比對，在 4 個堿基差異中， 2 個是第三堿基變化，沒有影響氨 基酸的組成， 而另外 2 個則是第一堿基差異， 所編碼的氨基酸發(fā) 生變化， 都是甘氨酸 (GIy) 變異成精氨酸 (A