免疫分析技術之ELISA王娟

1、 酶免疫測定類型酶免疫測定類型 這種固相酶免疫測定方法在這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸 附劑測定，簡稱附劑測定，簡稱ELISA。 酶免疫技術酶免疫技術 酶免疫組化酶免疫組化 酶免疫測定酶免疫測定 均相酶免疫測定均相酶免疫測定 非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定 固相酶免疫測定固相酶免疫測定 液相酶免疫測定液相酶免疫測定 1.11.1抗原抗體反應抗原抗體反應 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡， 其反應式為：其反應式為： Ag+AbAgAb

2、 抗體的親和力（抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K表示：表示： K=AgAbAgAb ，AgAb的解離程度與的解離程度與K值有關。高親值有關。高親 和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合 ，兩者結(jié)合牢固，不易解離。，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原解離后的抗原或抗體均能保持原 有的結(jié)構和活性。有的結(jié)構和活性。 1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之 間?；瘜W結(jié)構和空間構型互補關

3、系，具有高度的特異性。間?；瘜W結(jié)構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。 1.1.31.1.3敏感性敏感性 化學比色法的敏感度為化學比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平 酶反應測定法的敏感度約為酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml 免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿 標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/mlng/ml水平水平 例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達，其敏感度可達0

4、.1ng/ml0.1ng/ml。 1.21.2免疫測定在臨床檢驗中的應用免疫測定在臨床檢驗中的應用 由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特 異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測 標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。 2ELISA的類型的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方 法中有三個必要的試劑：法中有三個必要的試劑： （1）固相的抗原或

5、抗體，即）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑免疫吸附劑（immunosorbent）； （2）酶標記的抗原或抗體，稱為）酶標記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物結(jié)合物（conjugate）； （3）酶反應的底物。）酶反應的底物。 可設計出各種不同類型的檢測方法?？稍O計出各種不同類型的檢測方法。 2.1雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原 A. 將抗體吸附于固相表面；將抗體吸附于固相表面； B. 加抗原，形成抗原加抗原，形成抗原-抗體復合物；抗體復合物； C. 加酶標抗體；加酶標抗體； D. 加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。 此法適用于檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢測各種

6、蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就 可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法?？捎糜诎还滔噍d體和制備酶結(jié)合物而建立此法。 2.2 雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本 不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法 。乙肝標志物中抗。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵在于的檢測常采用本法。本法關鍵在于 酶標抗原的制備

7、，應根據(jù)抗原結(jié)構的不同，尋找合適的標記酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結(jié)構的不同，尋找合適的標記 方法。方法。 2.3 間接法測抗體間接法測抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗 抗體建立檢測相應抗體的方法抗體建立檢測相應抗體的方法。 A. 將抗原吸附于固相載體表面；將抗原吸附于固相載體表面； B. 加抗體加抗體, 形成抗原形成抗原-抗體復合物抗體復合物; C. 加酶標抗體；加酶標抗體； D. 加底物。加底物。 測定底物的降解量抗體量測定底物的降解量抗體量 2.4 2.4 競爭法測抗體競爭法測抗體 當抗原材料

8、中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化 抗原時，可用此法檢測特異性抗體?？乖瓡r，可用此法檢測特異性抗體。 2.5 2.5 競爭法測抗原競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點 ，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模 式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固 相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相

9、上的酶 標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等 ELISAELISA測定多用此法。測定多用此法。 2.6 2.6 捕獲包被法測抗體捕獲包被法測抗體 IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固抗體包被固 相，以捕獲血清標本中的相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異（其中包括針對抗原的特異 性性IgM抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染）。此法常用于病毒性感染 的早期診斷。的早期診斷。 2.7 ABS-ELISA2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物；

10、：固相支持物； ：樣品；：樣品； ：特異性：特異性IgGIgG； ：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）； ：辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶HRP-HRP-酶標鏈親和素（酶標鏈親和素（AvidinAvidin）；）； ：DABDAB顯色液；顯色液； ：顯色；：顯色； 3. ELISA的試劑的試劑(A、B、C三部分三部分) ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物

11、）；）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）； （3）酶的底物；）酶的底物； （4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品； （5）結(jié)合物及標本的稀釋液；）結(jié)合物及標本的稀釋液； （6）洗滌液；）洗滌液； （7）酶反應終止液）酶反應終止液 ELISA的試劑準備的試劑準備A 固相載體固相載體 聚苯乙烯，具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原聚苯乙烯，具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原 吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。 聚氯乙烯，聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空聚氯乙烯，聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，

12、但空 白值也略高。白值也略高。 良好的良好的ELISA板應該是板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高吸附性能好，空白值低，孔底透明度高 ，各板之間、同一板各孔之間性能相近。，各板之間、同一板各孔之間性能相近。 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定的過程稱為包被將抗原或抗體固定的過程稱為包被(coating)。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的 是蛋白質(zhì)分子結(jié)構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間是蛋白質(zhì)分子結(jié)構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間 的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等的作

13、用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等 電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有 更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。 不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親 和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì) 較多的抗原也可采用捕獲包被法。較多的抗原也可采用捕獲包被法。 親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和

14、素先包被載體，加入生物素化的DNA， 這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量 測定。測定。 脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇 ）中溶解后加入）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干， 待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片合成

15、多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片 段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但 由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián) 物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。 3.1.3 3.1.3 包被用抗原包被用抗原 3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體 IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)段上，抗體結(jié) 合點暴露于外。合點暴露于外。 取材于抗血清或含單克

16、隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才 能用于能用于ELISA，以保證試驗的特異性。，以保證試驗的特異性。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收 層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被 ，可取得更好的效果。，可取得更好的效果。 3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件 pH 9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液 pH 7-8的的Tris-HCL緩沖液緩沖液 加入包被液后，在加入

17、包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，冰箱中放置過夜，37中保溫中保溫2 小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化 ，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一 般般蛋白質(zhì)的包被濃度為蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。 3.1.6 封閉封閉 封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包 被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙，被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙， 從而排斥從而排斥ELI

18、SA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%的的BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%明膠明膠 ；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%）。）。 所有的所有的ELISA固相均需封閉？固相均需封閉？ ELISA的試劑準備的試劑準備B 3.2 3.2 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標記的抗體（或抗原）是即酶標記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關鍵的試劑中關鍵的試劑 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2 抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原）

19、含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性 3.2.1 結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時所用純度較高的制備結(jié)合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其 他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合 物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗 結(jié)果本底淺淡。在結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要中用酶標抗原的模式不多，總的要 求是抗原必須是高純度的。求是抗原必須是

20、高純度的。 3.2.2酶酶 純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源 豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存， 價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。 在在ELISA中，中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 和脲酶等。和脲酶等。 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶HRP是一種糖蛋白，含糖量約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子，分

21、子 量為量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞 鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘 酸鹽氧化法。酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與 蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達60%-70%）和）和 重復性好。重復性好。 交聯(lián)反應是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗

22、交聯(lián)反應是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗 體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 （2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP 分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形 成成chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效氏堿而結(jié)合。簡便有效. 3.2.3 3.2.3 結(jié)合物的制備結(jié)合物的制備 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISAELISA中最后的酶活性中最后的酶活性 測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相

23、抗原，測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原， 因此制備的酶結(jié)合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于因此制備的酶結(jié)合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于 檢測，效果更好。檢測，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一 濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度， 達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定 ，凍干后可在普通冰箱

24、中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入 等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如 慶大霉素）和防腐劑（慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可結(jié)合物可 加疊氮鈉）。加疊氮鈉）。 3.2.4 結(jié)合物的保存結(jié)合物的保存 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物 在反應中直接吸附在固相載體上：在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白， 0.05%0.05%吐溫吐溫20 20

25、。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液， 使用時不需再行稀釋，在使用時不需再行稀釋，在4-84-8保存期可達保存期可達6 6個月。個月。 3.2.5 結(jié)合物的稀釋結(jié)合物的稀釋 試劑準備試劑準備 C 酶的底物酶的底物 3.3 3.3 酶的底物酶的底物 3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物 OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm492nm 處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)合物最常結(jié)合物最常 用的底物。用的底物。 DH2+ H2

26、O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。 DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。 TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成 溶液試劑，只需與溶液試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應用液。酶反應終止溶液混和即成應用液。酶反應終止 后，后，TMBTMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色

27、計中定量，最適吸產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸 收波長為收波長為450nm450nm。 ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試敏感，但空白值極低，也為一些試 劑盒所采用。劑盒所采用。 HRPHRP對氫受體的專一性很高，僅作用于對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2H2O2、小分醇的過、小分醇的過 氧化物和尿素過氧化物氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為 底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在底物。產(chǎn)物

28、為黃色的對硝基酚，在405nm405nm波長處有吸波長處有吸 收峰。用收峰。用NaOHNaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。APAP 也有發(fā)熒光底物（磷酸也有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮），可用于甲基傘酮），可用于ELISAELISA 作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 4 4 對照設定對照設定 陽性對照品陽性對照品(positive control)(positive control)和陰性對照品和陰性對照品(negative (negative control)control)是檢驗試驗有效性的控制

29、品，同時也作為判斷結(jié)果的是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的 對照。對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含 蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應與試劑的敏感度相稱；加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物 質(zhì)的量。質(zhì)的量。 參考標準品參考標準品 定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含有制作標定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含有制作標 準曲線用的參考標準品，應

30、包括覆蓋可檢測范圍的準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃個濃 度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢測檢測 的陰性對照品中不可含的陰性對照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。 5 5 標本的采取和保存標本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或 抗原成份?？乖煞?。 以血清標本為例：血漿中除尚含有纖

31、維蛋白原和抗凝劑外，以血清標本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外， 其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。 血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物 酶活性的物質(zhì)，以酶活性的物質(zhì)，以HRPHRP為標記的為標記的ELISAELISA測定中，可能會增加非測定中，可能會增加非 特異性顯色。特異性顯色。 加樣加樣 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加 底物。加樣時應將所加物加在底物。加樣時應將所加物加在LEISAL

32、EISA板孔的底部，避免加在孔板孔的底部，避免加在孔 壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 基本操作注意事項基本操作注意事項 保溫保溫 抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)(incubation)。 ELISAELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā) 生。為什么生。為什么ELISAELISA反應總是需要一定時間的溫育？反應總是需要一定時間的溫育？ 溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）等

33、（冰箱溫度）等 。3737是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合 的合適溫度。的合適溫度。 洗滌洗滌 洗滌在洗滌在ELISAELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗 的成敗。的成敗。 ELSIAELSIA洗滌：達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。洗滌：達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物 質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸

34、附是普遍性的，而在洗滌時 又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。 可以說在可以說在ELISAELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。 洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工 操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：操作有流水沖洗式和浸泡式兩種： （1 1）流水沖洗式）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌 液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快

35、速。 已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓 水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的 中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離 子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質(zhì)回復到水子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質(zhì)回復到水 溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。 顯色顯色 顯色是酶催化無色的

36、底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的 溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可 保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高 溫度有助于加速顯色進行。溫度有助于加速顯色進行。 TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀 察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間 閱讀結(jié)果。閱讀結(jié)果。TMBTM

37、B經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達頂峰，隨即逐分鐘顯色達頂峰，隨即逐 漸減弱，至漸減弱，至2 2小時后即可完全消退至無色。小時后即可完全消退至無色。 比色比色 拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。 以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的 孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔 ），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水

38、 校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進 行計算。行計算。 結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光），現(xiàn)按規(guī)定用吸光 度（度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。通常的表示方法是），兩者含義相同。通常的表示方法是 ，將吸收波長寫于，將吸收波長寫于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波長為的吸收波長為 492nm492nm，表示方法為，表示方法為AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。

39、酶標比色儀酶標比色儀 酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISAELISA光度計。針對固相光度計。針對固相 載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計 。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重 復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù) 一般可精確到一般可精確到0.0010.001，準確性為，準確性為1%1%，重復性達，重復性達0.5%0.5%。 操作時室溫宜在操作時室溫宜在1

40、5-3015-30，使用前先預熱儀器，使用前先預熱儀器15-3015-30分鐘，測分鐘，測 讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如 OPDOPD用用492nm492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。 各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。 6 6 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 6.1 6.1 定性測定定性測定 定性測定的結(jié)果判斷作出定性測定的結(jié)果判斷作出“有有”或或“無無”的回答，分別用的回答，分別用“ 陽性陽性”、“陰性陰性”表示。在這種半定

41、量測定中，將標本作一表示。在這種半定量測定中，將標本作一 系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。 根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不 稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法在間接法和夾心法ELSIAELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭 法法ELISAELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結(jié)果中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類

42、反應的結(jié)果 判斷方法不同，分述于下。判斷方法不同，分述于下。 A.A.陽性判定值：陽性判定值： （cut-off valuecut-off value）一般為陰性對照一般為陰性對照A A值加上值加上 一個特定的常數(shù)一個特定的常數(shù)(0.05)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標 準。準。 B.B.標本標本/ /陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒 定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S S）和陰性）和陰性 對照（對照（N N）的）的A A值后，計算值

43、后，計算S/NS/N值值 。 間接法和夾心法間接法和夾心法 （2 2）競爭法）競爭法 因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一 般均用比色計測定，讀出般均用比色計測定，讀出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。 a. a. 陽性判定值法陽性判定值法 陰性判定值陰性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 陽性陽性 AA陽性判定值陽性判定值 陰性陰性 A A陽性判定值陽性判定值 b. b. 抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（% %）= = （陰性對照（陰性對照A A值值- -標本標本A A值）值）100%/100

44、%/陰性陰性 對照對照 陽性陽性 抑制率抑制率50%50%為為 陰性陰性 50%50% 4.7.2 4.7.2 定量測定定量測定 ELSIAELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體 的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批 測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制 作標準曲線。作標準曲線。 測定大分子量物質(zhì)的夾心法測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISAELISA，標準曲線的范圍一般較，標準曲線的范圍一般較 寬，

45、曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈寬，曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈S S形，其頭、尾部形，其頭、尾部 曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。 4. ELISA4. ELISA的操作要點的操作要點 嚴謹?shù)脑O計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保嚴謹?shù)脑O計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保 證證ELISAELISA必要條件。必要條件。 嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結(jié)果。嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結(jié)果。 免疫分析技術之免疫分析技術之 液相芯片技術及應用液相芯片技術及應用 liquichip 液相芯片系統(tǒng)_ 液相芯

46、片系統(tǒng)有機地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、 激光技術、流體學、最新的高速數(shù)字信號處理器和計算機運算法則，造就了 Luminex 100無與倫比的檢測特異性和靈敏度。 Benefits Applications Future Technology Principle Most bioassays consist of two or more biomolecules interacting Principle Using LiquiChip-Technology these biological interactions take place

47、on small, microscopical beads these beads are fluorescent (red ) Principle Detection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagents Beads 球形基質(zhì)球形基質(zhì) Capture molecule 探針分子探針分子 Analyte 待檢測物待檢測物 Reporter molecule 報告分子報告分子 Assays on Uniform Polystyrene(聚苯乙烯) Be

48、ads Diameter 5.6 m Two internal Dyes for Bead Classification Defined Mixture Dying in Shrinking in of both Dyes Organic Solvent Aqueous Solvent Two-Color Bead-Coding Based on xMAP technology By using 10 different levels of each of two fluorescent dyes, an array of 100 beads, each with a unique color

49、 signature, is created 為了便于探針分子的固定，在球形基質(zhì)的表面進行了一系列 的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定 “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification

50、of multiple reactions in a single well “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well 反應主要包括3個步驟 探針分子的固定 將這種標記好探針的球形基質(zhì)與樣品反 應。探針可以與相應的目的分子特異性 的結(jié)合，帶有綠色報告熒光的報告分子 與目的分子特異性的結(jié)合，對反應進行 定量 反應結(jié)果的檢測 LiquiChip Workstation uFlow

51、 cytometer-based technology uMeasures fluorescence uComponents: lReader lMicroplate Handler lFluid Module Flow Cytometer based Analysis Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusing Two lasers are used for excitation of fluorescence Principle of Detection nThe red laser is used

52、to identify the bead code nThe green laser is used to identify the reporter signal 利用這100種球形基質(zhì)，可以標記上100種不同 的探針分子，同時對一個樣本中的100種不同的 目的分子進行檢測。 AFHEBGCD Benefits 系統(tǒng)的優(yōu)點 靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受 實驗室已有的實驗方案，使用者可以自行設計分 析方案，也可使用成套試劑盒 通量大，可對同一樣本中的多種不同目的分子同 時進行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對96個不同樣本 進行檢測 液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構象，也更 有利于探

53、針和被檢測物的反應 靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進 行檢測 操作簡便，耗時短，成本低 0 200 400 600 800 1000 1,11,22,12,23,13,2 0 200 400 600 800 1000 1,11,22,12,23,13,2 4% CV Liquichip和和ELISA靈敏度的比較靈敏度的比較 分別用ELISA和liquichip 對硫氧還蛋白進行定量測定得到的標準曲線 I：使用liquichip測定得到的標準曲線 II、III：使用ELISA測定得到的標準曲線 Compared to ELISA: 樣本需求量小樣本需求量小: EL ISA 每次實驗均至

54、少需要每次實驗均至少需要100200l 外周血，而外周血，而 采用液相芯片只需采用液相芯片只需50l 血液即可在一支試管中完成所有檢測項目血液即可在一支試管中完成所有檢測項目,總總 體可節(jié)約體可節(jié)約80 %以上的樣本，這對外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有以上的樣本，這對外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有 意義意義; 操作流程簡化操作流程簡化:由于由于EL ISA 工作曲線的置信區(qū)間僅工作曲線的置信區(qū)間僅23 對數(shù)級，因?qū)?shù)級，因 而對于較高濃度的細胞因子的檢測而對于較高濃度的細胞因子的檢測,其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以 滿足實驗精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可

55、達滿足實驗精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達45 對數(shù)級，活性范圍可對數(shù)級，活性范圍可10 倍于倍于EL ISA ,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌 步驟步驟; 高效性高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率 大大高于大大高于EL ISA 固相沉底。固相沉底。 Measuring the level of many human or mouse cytokines in a single sample Ready-to-use Broad-Range Kinase kits for meas

56、uring kinase activity Ser/Thr Kinase, Tyr Kinase Kit Kinase/Phosphorylated Protein u no washing steps u faster u higher throughput u quantitative assay results u no hazardous gels / radioactivity u Sensitivity: higher than ECL/colorimetric assays, comparable to or better than radioactive assays Adva

57、ntages compared to Western blot procedures Applications When to use the LiquiChip System? The LiquiChip System is used for a large variety of protein assays: Immunoassays Enzyme Assays Protein-protein interaction Assays Receptor ligand Assays Protein nucleic acid assays Assay Types Immunoassays Enzy

58、me assays (kinase, protease) DNA-hybridization assays Interaction assays Realize the Power of Suspension Arrays Assay system that offers: multiplexing of assays up to a factor of 100 a mix-and-measure procedures (no washing) suspension enzyme assays (kinase, phosphatase and protease assays) A utoimm

59、une ASCA Human beta-2 Microglobulin Human Mouse Centromere B Human Chromatin Human ENA Profile 4 (SSA, SSB, Sm, RNP) Human ENA Profile 5 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70) Human ENA Profile 6 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1) Human Histone Human Histone H1 Human Histone H2A Human Histone H2B Human Histone

60、H3 Human Histone H4 Human HSP-27 pS82 General HSP-27 Total General HSP-32 Human HSP-65 Human HSP-71 Human HSP-90 a Human HSP-90 b Human Jo-1 Human PCNA Human Mouse PR3 Human PR3 (cANCA) Mouse Ribosomal P Human Mouse RNP Human Mouse RNP-A Human RNP-C Human SCF Human Mouse Scl-70 Human Mouse Serum Amy