免疫分析技術(shù)之ELISA王娟

1、 酶免疫測(cè)定類(lèi)型酶免疫測(cè)定類(lèi)型 這種固相酶免疫測(cè)定方法在這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸 附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱(chēng)附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA。 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) 酶免疫組化酶免疫組化 酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定 均相酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定 非均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定 固相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定 液相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定 1.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡， 其反應(yīng)式為：其反應(yīng)式為： Ag+AbAgAb

2、 抗體的親和力（抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K表示：表示： K=AgAbAgAb ，AgAb的解離程度與的解離程度與K值有關(guān)。高親值有關(guān)。高親 和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合 ，兩者結(jié)合牢固，不易解離。，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原解離后的抗原或抗體均能保持原 有的結(jié)構(gòu)和活性。有的結(jié)構(gòu)和活性。 1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之 間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)

3、系，具有高度的特異性。間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。 1.1.31.1.3敏感性敏感性 化學(xué)比色法的敏感度為化學(xué)比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平 酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml 免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/mlng/ml水平水平 例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達(dá)，其敏感度可達(dá)0

4、.1ng/ml0.1ng/ml。 1.21.2免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特 異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè) 標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。 2ELISA的類(lèi)型的類(lèi)型 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方 法中有三個(gè)必要的試劑：法中有三個(gè)必要的試劑： （1）固相的抗原或

5、抗體，即）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑免疫吸附劑（immunosorbent）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為結(jié)合物結(jié)合物（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。 2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原 A. 將抗體吸附于固相表面；將抗體吸附于固相表面； B. 加抗原，形成抗原加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物；抗體復(fù)合物； C. 加酶標(biāo)抗體；加酶標(biāo)抗體； D. 加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。 此法適用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢測(cè)各種

6、蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就 可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。 2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體雙抗原夾心法測(cè)抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本 不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法 。乙肝標(biāo)志物中抗。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于 酶標(biāo)抗原的制備

7、，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記 方法。方法。 2.3 間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗 抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。 A. 將抗原吸附于固相載體表面；將抗原吸附于固相載體表面； B. 加抗體加抗體, 形成抗原形成抗原-抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體；加酶標(biāo)抗體； D. 加底物。加底物。 測(cè)定底物的降解量抗體量測(cè)定底物的降解量抗體量 2.4 2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料

8、中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化 抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體?？乖瓡r(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。 2.5 2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn) ，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模 式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固 相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相

9、上的酶 標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等 ELISAELISA測(cè)定多用此法。測(cè)定多用此法。 2.6 2.6 捕獲包被法測(cè)抗體捕獲包被法測(cè)抗體 IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固抗體包被固 相，以捕獲血清標(biāo)本中的相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異（其中包括針對(duì)抗原的特異 性性IgM抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染）。此法常用于病毒性感染 的早期診斷。的早期診斷。 2.7 ABS-ELISA2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物；

10、：固相支持物； ：樣品；：樣品； ：特異性：特異性IgGIgG； ：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）； ：辣根過(guò)氧化物酶：辣根過(guò)氧化物酶HRP-HRP-酶標(biāo)鏈親和素（酶標(biāo)鏈親和素（AvidinAvidin）；）； ：DABDAB顯色液；顯色液； ：顯色；：顯色； 3. ELISA的試劑的試劑(A、B、C三部分三部分) ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物

11、）；）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； （3）酶的底物；）酶的底物； （4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液；）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液 ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備A 固相載體固相載體 聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原 吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。 聚氯乙烯，聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空聚氯乙烯，聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，

12、但空 白值也略高。白值也略高。 良好的良好的ELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高吸附性能好，空白值低，孔底透明度高 ，各板之間、同一板各孔之間性能相近。，各板之間、同一板各孔之間性能相近。 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定的過(guò)程稱(chēng)為包被將抗原或抗體固定的過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的 是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間 的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等的作

13、用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等 電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有 更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。 不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親 和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì) 較多的抗原也可采用捕獲包被法。較多的抗原也可采用捕獲包被法。 親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和

14、素先包被載體，加入生物素化的DNA， 這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量 測(cè)定。測(cè)定。 脂類(lèi)物質(zhì)脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇 ）中溶解后加入）中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干， 待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。 合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片合成

15、多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片 段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但 由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián) 物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。 3.1.3 3.1.3 包被用抗原包被用抗原 3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體 IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)段上，抗體結(jié) 合點(diǎn)暴露于外。合點(diǎn)暴露于外。 取材于抗血清或含單克

16、隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才 能用于能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。，以保證試驗(yàn)的特異性。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收 層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被 ，可取得更好的效果。，可取得更好的效果。 3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件 pH 9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液 pH 7-8的的Tris-HCL緩沖液緩沖液 加入包被液后，在加入

17、包被液后，在4-8冰箱中放置過(guò)夜，冰箱中放置過(guò)夜，37中保溫中保溫2 小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化 ，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一 般般蛋白質(zhì)的包被濃度為蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。 3.1.6 封閉封閉 封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包 被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙， 從而排斥從而排斥ELI

18、SA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%的的BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%明膠明膠 ；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。）。 所有的所有的ELISA固相均需封閉？固相均需封閉？ ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備B 3.2 3.2 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關(guān)鍵的試劑中關(guān)鍵的試劑 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2 抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原）

19、含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性 3.2.1 結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其 他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合 物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn) 結(jié)果本底淺淡。在結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要 求是抗原必須是高純度的。求是抗原必須是

20、高純度的。 3.2.2酶酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源 豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存， 價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。 在在ELISA中，中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 和脲酶等。和脲酶等。 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶HRP是一種糖蛋白，含糖量約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子，分

21、子 量為量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞 鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘 酸鹽氧化法。酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與 蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和）和 重復(fù)性好。重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗

22、交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗 體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 （2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP 分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形 成成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效. 3.2.3 3.2.3 結(jié)合物的制備結(jié)合物的制備 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISAELISA中最后的酶活性中最后的酶活性 測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相

23、抗原，測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原， 因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于 檢測(cè)，效果更好。檢測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一 濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度， 達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定 ，凍干后可在普通冰箱

24、中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入 等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如 慶大霉素）和防腐劑（慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可結(jié)合物可 加疊氮鈉）。加疊氮鈉）。 3.2.4 結(jié)合物的保存結(jié)合物的保存 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物 在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白， 0.05%0.05%吐溫吐溫20 20

25、。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液， 使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)谑褂脮r(shí)不需再行稀釋?zhuān)?-84-8保存期可達(dá)保存期可達(dá)6 6個(gè)月。個(gè)月。 3.2.5 結(jié)合物的稀釋結(jié)合物的稀釋 試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物酶的底物 3.3 3.3 酶的底物酶的底物 3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物 OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm492nm 處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)合物最常結(jié)合物最常 用的底物。用的底物。 DH2+ H2

26、O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。 DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。 TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成 溶液試劑，只需與溶液試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止 后，后，TMBTMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色

27、計(jì)中定量，最適吸產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸 收波長(zhǎng)為收波長(zhǎng)為450nm450nm。 ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試敏感，但空白值極低，也為一些試 劑盒所采用。劑盒所采用。 HRPHRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2H2O2、小分醇的過(guò)、小分醇的過(guò) 氧化物和尿素過(guò)氧化物氧化物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為 底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在底物。產(chǎn)物

28、為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm405nm波長(zhǎng)處有吸波長(zhǎng)處有吸 收峰。用收峰。用NaOHNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。APAP 也有發(fā)熒光底物（磷酸也有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮），可用于甲基傘酮），可用于ELISAELISA 作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 4 4 對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定 陽(yáng)性對(duì)照品陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)(positive control)和陰性對(duì)照品和陰性對(duì)照品(negative (negative control)control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制

29、品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的 對(duì)照。對(duì)照。 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含 蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)；加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物 質(zhì)的量。質(zhì)的量。 參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)

30、包括覆蓋可檢測(cè)范圍的準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃個(gè)濃 度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢測(cè)檢測(cè) 的陰性對(duì)照品中不可含的陰性對(duì)照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。 5 5 標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或 抗原成份。抗原成份。 以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖

31、維蛋白原和抗凝劑外，以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外， 其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。 血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物 酶活性的物質(zhì)，以酶活性的物質(zhì)，以HRPHRP為標(biāo)記的為標(biāo)記的ELISAELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非測(cè)定中，可能會(huì)增加非 特異性顯色。特異性顯色。 加樣加樣 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加 底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISAL

32、EISA板孔的底部，避免加在孔板孔的底部，避免加在孔 壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 基本操作注意事項(xiàng)基本操作注意事項(xiàng) 保溫保溫 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)(incubation)。 ELISAELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā) 生。為什么生。為什么ELISAELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？ 溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）等

33、（冰箱溫度）等 。3737是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合 的合適溫度。的合適溫度。 洗滌洗滌 洗滌在洗滌在ELISAELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn) 的成敗。的成敗。 ELSIAELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物 質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸

34、附是普遍性的，而在洗滌時(shí) 又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。 可以說(shuō)在可以說(shuō)在ELISAELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。 洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工 操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：操作有流水沖洗式和浸泡式兩種： （1 1）流水沖洗式）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌 液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快

35、速。 已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓 水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的 中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離 子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水 溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。 顯色顯色 顯色是酶催化無(wú)色的

36、底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的 溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可 保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高 溫度有助于加速顯色進(jìn)行。溫度有助于加速顯色進(jìn)行。 TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀 察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間 閱讀結(jié)果。閱讀結(jié)果。TMBTM

37、B經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐 漸減弱，至漸減弱，至2 2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。 比色比色 拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的 孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔 ），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水

38、 校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn) 行計(jì)算。行計(jì)算。 結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光），現(xiàn)按規(guī)定用吸光 度（度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。通常的表示方法是），兩者含義相同。通常的表示方法是 ，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波長(zhǎng)為的吸收波長(zhǎng)為 492nm492nm，表示方法為，表示方法為AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。

39、酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISAELISA光度計(jì)。針對(duì)固相光度計(jì)。針對(duì)固相 載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì) 。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重 復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù) 一般可精確到一般可精確到0.0010.001，準(zhǔn)確性為，準(zhǔn)確性為1%1%，重復(fù)性達(dá)，重復(fù)性達(dá)0.5%0.5%。 操作時(shí)室溫宜在操作時(shí)室溫宜在1

40、5-3015-30，使用前先預(yù)熱儀器，使用前先預(yù)熱儀器15-3015-30分鐘，測(cè)分鐘，測(cè) 讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如 OPDOPD用用492nm492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。 6 6 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 6.1 6.1 定性測(cè)定定性測(cè)定 定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有有”或或“無(wú)無(wú)”的回答，分別用的回答，分別用“ 陽(yáng)性陽(yáng)性”、“陰性陰性”表示。在這種半定

41、量測(cè)定中，將標(biāo)本作一表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一 系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。 根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不 稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。 在間接法和夾心法在間接法和夾心法ELSIAELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng) 法法ELISAELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)反應(yīng)的結(jié)果中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)

42、反應(yīng)的結(jié)果 判斷方法不同，分述于下。判斷方法不同，分述于下。 A.A.陽(yáng)性判定值：陽(yáng)性判定值： （cut-off valuecut-off value）一般為陰性對(duì)照一般為陰性對(duì)照A A值加上值加上 一個(gè)特定的常數(shù)一個(gè)特定的常數(shù)(0.05)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo) 準(zhǔn)。準(zhǔn)。 B.B.標(biāo)本標(biāo)本/ /陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒 定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S S）和陰性）和陰性 對(duì)照（對(duì)照（N N）的）的A A值后，計(jì)算值

43、后，計(jì)算S/NS/N值值 。 間接法和夾心法間接法和夾心法 （2 2）競(jìng)爭(zhēng)法）競(jìng)爭(zhēng)法 因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一 般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。 a. a. 陽(yáng)性判定值法陽(yáng)性判定值法 陰性判定值陰性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 陽(yáng)性陽(yáng)性 AA陽(yáng)性判定值陽(yáng)性判定值 陰性陰性 A A陽(yáng)性判定值陽(yáng)性判定值 b. b. 抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（% %）= = （陰性對(duì)照（陰性對(duì)照A A值值- -標(biāo)本標(biāo)本A A值）值）100%/100

44、%/陰性陰性 對(duì)照對(duì)照 陽(yáng)性陽(yáng)性 抑制率抑制率50%50%為為 陰性陰性 50%50% 4.7.2 4.7.2 定量測(cè)定定量測(cè)定 ELSIAELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體 的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批 測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制 作標(biāo)準(zhǔn)曲線。作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISAELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較 寬，

45、曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S S形，其頭、尾部形，其頭、尾部 曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。 4. ELISA4. ELISA的操作要點(diǎn)的操作要點(diǎn) 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保 證證ELISAELISA必要條件。必要條件。 嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。 免疫分析技術(shù)之免疫分析技術(shù)之 液相芯片技術(shù)及應(yīng)用液相芯片技術(shù)及應(yīng)用 liquichip 液相芯片系統(tǒng)_ 液相芯

46、片系統(tǒng)有機(jī)地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、 激光技術(shù)、流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了 Luminex 100無(wú)與倫比的檢測(cè)特異性和靈敏度。 Benefits Applications Future Technology Principle Most bioassays consist of two or more biomolecules interacting Principle Using LiquiChip-Technology these biological interactions take place

47、on small, microscopical beads these beads are fluorescent (red ) Principle Detection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagents Beads 球形基質(zhì)球形基質(zhì) Capture molecule 探針?lè)肿犹结樂(lè)肿?Analyte 待檢測(cè)物待檢測(cè)物 Reporter molecule 報(bào)告分子報(bào)告分子 Assays on Uniform Polystyrene(聚苯乙烯) Be

48、ads Diameter 5.6 m Two internal Dyes for Bead Classification Defined Mixture Dying in Shrinking in of both Dyes Organic Solvent Aqueous Solvent Two-Color Bead-Coding Based on xMAP technology By using 10 different levels of each of two fluorescent dyes, an array of 100 beads, each with a unique color

49、 signature, is created 為了便于探針?lè)肿拥墓潭?，在球形基質(zhì)的表面進(jìn)行了一系列 的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定 “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification

50、of multiple reactions in a single well “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well 反應(yīng)主要包括3個(gè)步驟 探針?lè)肿拥墓潭?將這種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與樣品反 應(yīng)。探針可以與相應(yīng)的目的分子特異性 的結(jié)合，帶有綠色報(bào)告熒光的報(bào)告分子 與目的分子特異性的結(jié)合，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行 定量 反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè) LiquiChip Workstation uFlow

51、 cytometer-based technology uMeasures fluorescence uComponents: lReader lMicroplate Handler lFluid Module Flow Cytometer based Analysis Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusing Two lasers are used for excitation of fluorescence Principle of Detection nThe red laser is used

52、to identify the bead code nThe green laser is used to identify the reporter signal 利用這100種球形基質(zhì)，可以標(biāo)記上100種不同 的探針?lè)肿?，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的 目的分子進(jìn)行檢測(cè)。 AFHEBGCD Benefits 系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受 實(shí)驗(yàn)室已有的實(shí)驗(yàn)方案，使用者可以自行設(shè)計(jì)分 析方案，也可使用成套試劑盒 通量大，可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同 時(shí)進(jìn)行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同樣本 進(jìn)行檢測(cè) 液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更 有利于探

53、針和被檢測(cè)物的反應(yīng) 靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進(jìn) 行檢測(cè) 操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低 0 200 400 600 800 1000 1,11,22,12,23,13,2 0 200 400 600 800 1000 1,11,22,12,23,13,2 4% CV Liquichip和和ELISA靈敏度的比較靈敏度的比較 分別用ELISA和liquichip 對(duì)硫氧還蛋白進(jìn)行定量測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線 I：使用liquichip測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線 II、III：使用ELISA測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Compared to ELISA: 樣本需求量小樣本需求量小: EL ISA 每次實(shí)驗(yàn)均至

54、少需要每次實(shí)驗(yàn)均至少需要100200l 外周血，而外周血，而 采用液相芯片只需采用液相芯片只需50l 血液即可在一支試管中完成所有檢測(cè)項(xiàng)目血液即可在一支試管中完成所有檢測(cè)項(xiàng)目,總總 體可節(jié)約體可節(jié)約80 %以上的樣本，這對(duì)外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有以上的樣本，這對(duì)外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有 意義意義; 操作流程簡(jiǎn)化操作流程簡(jiǎn)化:由于由于EL ISA 工作曲線的置信區(qū)間僅工作曲線的置信區(qū)間僅23 對(duì)數(shù)級(jí)，因?qū)?shù)級(jí)，因 而對(duì)于較高濃度的細(xì)胞因子的檢測(cè)而對(duì)于較高濃度的細(xì)胞因子的檢測(cè),其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以 滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可

55、達(dá)滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達(dá)45 對(duì)數(shù)級(jí)，活性范圍可對(duì)數(shù)級(jí)，活性范圍可10 倍于倍于EL ISA ,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌 步驟步驟; 高效性高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率 大大高于大大高于EL ISA 固相沉底。固相沉底。 Measuring the level of many human or mouse cytokines in a single sample Ready-to-use Broad-Range Kinase kits for meas

56、uring kinase activity Ser/Thr Kinase, Tyr Kinase Kit Kinase/Phosphorylated Protein u no washing steps u faster u higher throughput u quantitative assay results u no hazardous gels / radioactivity u Sensitivity: higher than ECL/colorimetric assays, comparable to or better than radioactive assays Adva

57、ntages compared to Western blot procedures Applications When to use the LiquiChip System? The LiquiChip System is used for a large variety of protein assays: Immunoassays Enzyme Assays Protein-protein interaction Assays Receptor ligand Assays Protein nucleic acid assays Assay Types Immunoassays Enzy

58、me assays (kinase, protease) DNA-hybridization assays Interaction assays Realize the Power of Suspension Arrays Assay system that offers: multiplexing of assays up to a factor of 100 a mix-and-measure procedures (no washing) suspension enzyme assays (kinase, phosphatase and protease assays) A utoimm

59、une ASCA Human beta-2 Microglobulin Human Mouse Centromere B Human Chromatin Human ENA Profile 4 (SSA, SSB, Sm, RNP) Human ENA Profile 5 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70) Human ENA Profile 6 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1) Human Histone Human Histone H1 Human Histone H2A Human Histone H2B Human Histone

60、H3 Human Histone H4 Human HSP-27 pS82 General HSP-27 Total General HSP-32 Human HSP-65 Human HSP-71 Human HSP-90 a Human HSP-90 b Human Jo-1 Human PCNA Human Mouse PR3 Human PR3 (cANCA) Mouse Ribosomal P Human Mouse RNP Human Mouse RNP-A Human RNP-C Human SCF Human Mouse Scl-70 Human Mouse Serum Amy