目的基因的克隆

1、 基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組 中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后， 或確定其表達調(diào)控機制和生物學功能， 或建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞） 或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細胞內(nèi) 改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 5 目的基因的獲得目的基因的獲得 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類： 一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基 因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目 的基因的重組克隆； 另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學合成法體外直接合成目的基 因，然后將之克隆表達。 A

2、PCR法 PCR法定向擴增目的基因的基本原理 PCR克隆目的基因的基本程序 PCR盒式引物擴增法 使用PCR技術(shù)克隆目的基因的前提條件是： 已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列， 根據(jù)該序列化學合成聚合反應所需的雙引物 1. PCR法定向擴增目的基因的基本原理 5 5 目的基因 5 變性加熱 5 5 引物退火 5 5 底物聚合 5 5 5 5 加熱變性 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 退火 引物 底物聚合 加熱變性 引物退火 底物聚合 1 2 3 由Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會帶有 一個非模板依賴

3、型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為 Taq DNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存 在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也 可以使用專門的T載體克隆 2. PCR克隆目的基因的基本程序 5 5 A A T T5 5 PCR擴增產(chǎn)物 T 載體 T7lacZ MCSoriApr 3. PCR盒式引物擴增法 染色體DNA Sau3A部分酶切 加裝盒式接頭片段5 端不含磷酸基 團 變性 引物退火 擴增 B 基因文庫的構(gòu)建 基因文庫的基本概念 基因文庫的構(gòu)建程序 基因組文庫重組克隆的排序 基因文庫的基本概念 基因庫與基因文庫 基因庫（gene pool）

4、特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（gene library or gene bank） 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式 基因組文庫（含有全部基因） 存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為： cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） 基因文庫的基本概念 基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略 用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA 用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA 在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA 種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫 一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cD

5、NA 文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫 基因文庫的基本概念 基因文庫的完備性 基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概 率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段 的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要 45萬個克?。欢斖陚湫蕴岣叩?.9999時，基因文庫至少需要180 萬個克

6、隆 基因文庫的基本概念 基因文庫的質(zhì)量標準 除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應具備下列條件： 重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力 載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆 克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序 克隆片段易于從載體分子上完整卸下 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選 基因文庫的構(gòu)建程序 基因組DNA的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組 文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。制備的 DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段 的比率就越低，重組率和完備性也就越高 AA AA 用

7、常規(guī)方法制備的染色體 DNA的長度一般在100 kb左右 如果先將細胞固定在低融點凝 膠中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的DNA片段 基因文庫的構(gòu)建程序 基因組DNA的切割 用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和 限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證DNA片段大小均一 超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如： Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控 連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載

8、體的裝載量進行分級 分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！ 基因文庫的構(gòu)建程序 載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的 l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體 l-DNA 由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體 通常選質(zhì)粒 上述幾種載體的最大裝載量如下： 質(zhì)粒 考斯質(zhì)粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC300 kb YAC400 kb 用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌 基因文庫的構(gòu)建程序 從基因文庫中篩選目的基因 大型基因組文庫一般由數(shù)

9、十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除 了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白 編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、 酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪 操作步驟 基因文庫的構(gòu)建程序 從基因文庫中篩選目的基因 密集鋪板（1-10萬） 雜 交 挖 取 鋪 板 鋪 板 目的重組克隆 基因文庫的構(gòu)建程序 基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題 在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應引起重視的問題是： 嚴禁外源DNA片段之間的連接！ 為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離 用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷

10、酸基團 用TdT酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端 基因組文庫重組克隆的排序 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十 分困難，如果一個YAC基因文庫的插入片段總和為整個基因組的 十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。 然而基因文庫的克隆都是隨機序列，必須將所有的克隆排列成一 個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項工作的工作 量可能遠大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作 基因組文庫重組克隆的排序 將單一的YAC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻 地水解成若干片段，末端標記同位素 然后再用Sau3AI或MboI將末端標記的DNA片段降解成碎片

11、 ，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個YAC克隆走在同一塊板上，形 成10個克隆的特征性DNA指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋圖譜 有部分相同的，則其兩個YAC片段就有互相重疊的可能性，于 是這兩個YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 酶切片段末端標記法 酶切片段末端標記法 HHHH S S SS SSSSS SSSSS S S SSS 單一克隆指紋圖譜 十克隆指紋圖譜 載體DNA克隆DNA 基因組文庫重組克隆的排序 將若干YAC克隆固定在薄膜上，并復制二十份薄膜；合成20 種不同序列的短探針，其序列是隨機的 用20種探針隨機定位雜交（一對一）20份YAC克隆薄

12、膜 如果某兩個克隆同時對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應，則這 兩個克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“1”， 而陰性結(jié)果記為“0”，可清晰地列成一張表，最終排出上述 YAC克隆的排列順序 隨機探針聯(lián)合雜交法 C cDNA法 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 cDNA法分離目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 mRNA cDNA第一鏈的合成 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAO

13、H 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 cDNA第一鏈 引物退火 逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs cDNA第二鏈的合成 煮沸NaOH 自身引導法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 TTTTTTTTTTTTTTp 5 TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTT OH 3 KlenowdNTPs S1 cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPsRNaesH 置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺 失

14、 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAp 5 5 S1 AAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 5TTTTTTTTTTTTTTOH 3 AAAAAAAAAAAAAA 5 5TTTTTTTTTTTTTT 3 3 T4-DNA ligase cDNA第二鏈的合成 dCTPTdT 引導合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列 5ppp5 G G AAAAAOH 3 TTTTTp 53 HO 5ppp5 G G AAAAACCCCCCCOH 3 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 3

15、HOCCCCCCCTTTTTp 5 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 5 pGGGGGGG 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 5 pGGGGGGGAAAAAOH 3 NaOH 退火 KlenowdNTPs Terminal deoxynucleotidyl transferaser cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 雙鏈cDNA的克隆 雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組 分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

16、 cDNA法分離目的基因的基本程序 完備分離程序 提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借 助于合適的篩選手段找到目的重組子 篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法 篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆， 如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序 特異分離程序 提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標 mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆 特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如 血紅蛋白基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序

17、 差異分離程序 利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應 的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能 自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務是要分離克隆 這些新基因，進而研究其生物學功能 cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu) 細菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感， 分離純化困難 僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 D 化學合成法 化學合成法的基本戰(zhàn)略 化學合成的單元操作 DNA化學合成的用途 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 化學合成目的基

18、因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略： 小片段粘接法： 混合退火 根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段 T4-DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 補釘延長法： 混合退火 根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈 DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段 T4-DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段 T4-DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合

19、 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就 愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合 成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片 段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95% 則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7% 化學合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其 編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到 的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子 由于

20、大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設計時 必須考慮下列問題： 生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針 探針應具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間 探針內(nèi)部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域 化學合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 某段連續(xù)的氨基酸序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 設計的簡并探針序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA

21、TGCATGGATGAIATGA A G 此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計 expressed sequence tag 化學合成的單元操作 化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個 個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：基團保護、 分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。 從反應機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯 法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩 種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離 程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設計的 DNA化學合成的用途 合成天然基因 修飾改造

22、基因 設計新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素 如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 基因等 E 鳥槍法 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 鳥槍法操作的改進 鳥槍法克隆目的基因的局限性 ”鳥槍法(Shotgun)”. 序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找 彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序 列延伸. 優(yōu)點:不需預先了解任何基因組的情況. ABC ABC ABC ABC 小片段測序小片段測序 計算機拼裝計算機拼裝 DNA的鳥槍法測序的主要步驟 第一，建立高度隨機、插入片段大小為2kb左 右的基因組文庫。 第二，高效、大規(guī)模的末端測序。 第三，序列集合。 第四，填補缺口。 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片 段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多 克隆中分離出含有目的基因的目的重組子 ，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核 細菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 染色體DNA的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度