基于母源抗體的青海湖鳥島斑頭雁H5N1禽流感病毒

1、分類號 密級 udc 編號 中國科學院研究生院 碩士學位論文 青海湖斑頭雁青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 朱 筱 佳 指導教師： 李 來 興 副研究員 中國科學院西北高原生物研究所 申請學位級別： 碩士 學科專業(yè)名稱： 動物學 論文提交日期： 2009 年 6 月 論文答辯日期： 2009 年 6 月 培養(yǎng)單位： 中國科學院西北高原生物研究所 學位授予單位： 中國科學院研究生院 答辯委員會主席： 張迎梅 thesis of master degree, graduate school of the chinese acade

2、my of sciences the detection of anti-h5n1-aiv maternal antibody and evaluation of immunocompetence of bar-headed geese of qinghai lake xiaojia zhu (zoology) directed by associate professor laixing li northwest institute of plateau biology, cas june, 2009, xining, qinghai, china 中文摘要 i 中文摘要 禽流感（avian

3、 influenza，ai）是由正粘病毒科a型流感病毒引起的一種禽類的 烈性傳染病。2005年，青海湖國家級自然保護區(qū)野生鳥類種群首次暴發(fā)h5n1型高 致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, hpai） ，死亡數(shù)量6000余只（12種） ，其中數(shù)量最多的是斑頭雁（anser indicus） 。自此，野生遷徙鳥類，尤其是鴨科鳥 類（anatidae）的禽流感病毒攜帶和感染情況在世界范圍內(nèi)引起了人們的廣泛關(guān)注。 由于野生遷徙鳥類禽流感的暴發(fā)，涉及遷徙鳥類在不同國家和地理區(qū)域之間活動， 容易引起病毒的傳播和再次流行。目前，對野生鳥類禽流感的監(jiān)測引起了各國

4、政府 和人民的高度重視。 本實驗通過母源抗體檢測對青海湖鳥島斑頭雁種群的禽流感病毒感染和免疫力 獲得狀況進行評估。實驗以孵化后期的卵黃母源抗體水平反映親鳥種群的禽流感病 毒感染狀況為理論基礎(chǔ)，設(shè)計了通過收集棄卵和巢卵進行人工孵化，取孵化后期的 卵黃檢測對 h5n1 亞型禽流感的母源抗體水平。研究發(fā)現(xiàn)，收集 85 個巢卵（棄卵 85 枚，巢卵 149 枚）進行卵黃母源抗體檢測，血凝抑制試驗表明，母體種群分別有 26.5%（棄卵）或 35.2%（巢卵）的繁殖對（breeding pairs）對 h5n1 亞型禽流感病 毒（avian influenza virus, aiv）的母源抗體呈現(xiàn)陽性；酶

5、聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果表明， 母體種群分別有 12.5%（棄卵）或 13.2%（巢卵）繁殖對的 h5n1 亞型禽流感病毒 的母源抗體呈現(xiàn)陽性。此外，以種群繁殖密度和巢卵抗體效價進行相關(guān)性分析，發(fā) 現(xiàn)青海湖鳥島斑頭雁種群局部高密度地區(qū)巢卵的母源抗體水平與繁殖密度正相關(guān)。 經(jīng)過對在青海湖自然保護區(qū)繁殖的斑頭雁種群的 h5n1 亞型高致病性禽流感母 源抗體檢測，表明繁殖群中有一定比例的斑頭雁在 2008 年遷徙到青海湖繁殖地之 前感染過 h5n1 亞型禽流感病毒且經(jīng)歷獲得性免疫，以母源抗體的形式傳遞給了尚 未具有自身免疫能力的幼鳥，使種群對 h5n1 亞型 hpai 病毒具有了一定的免疫能 力。因此，青

6、海湖鳥島斑頭雁種群再次被這一病原體感染的風險大大降低（除非病 原體出現(xiàn)變異） ，在一定程度上提高了繁殖率和子代的存活率。繁殖密度和巢卵效 價的正相關(guān)結(jié)果表明，繁殖密度高的區(qū)域，種群免疫力也相對較強。以巢密度為表 征的繁殖密度可能是集群水鳥種群病原體感染的一個影響因素。在自然保護區(qū)管理 中，可以考慮以改善集群水鳥的棲息地環(huán)境使其局域的繁殖密度降低，從而降低病 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 ii 原體入侵種群的風險。 關(guān)鍵詞：h5n1；禽流感；斑頭雁；人工孵化；母源抗體；血凝抑制；酶聯(lián)免疫吸 附 英文摘要 iii abstract avian influenza

7、(ai) is a severe infectious disease of birds caused by influenza a virus, a member of the family orthomyxoviridae. in 2005, first h5n1 highly pathogenic avian influenza (hpai) in wild birds broke out in qinghai lake national natural reserve. the dead birds contained 12 species, totaled more than 600

8、0 individuals, the most dead is bar-headed goose (anser indicus). since then, increasing concern has developed over the situation of ai carried and infected in migratory birds, especially mallard duck (anatidae). as the outbreak of hpai in migratory birds involves their migration across various coun

9、tries and geographic areas, it is likely to cause spread and prevalence of aiv. so far, the monitoring of aiv (avian influenza virus) in wild birds aroused serious attentions of governments and people worldwide. the purpose of our research is to detect and evaluate the infection and immunocompetence

10、 of h5n1 aiv in bar-headed geese of island birds in lake qinghai on maternal antibody (mab) transmission. based on the theory that maternal antibody in yolk of late hatching period reflects the infection of particular pathogen in maternal populations, the collected 85 ejected eggs and 149 nest eggs

11、of the bar-headed geese were put into artificial hatching, then the yolk maternal antibodies to h5n1 aiv detected. the results of hi (hemagglutinin inhibition) indicated the positive antibody rates to h5n1 aiv of ejected eggs and nest eggs were 26.5% and 35.2% respectively. meanwhile, the results of

12、 celisa (competitive enzyme linked immunosorbent assay) indicated the positive rates of two groups were 12.5% and 13.2% respectively. in addition, with the correlation analysis of neighbored nests density and mab concentrations of nest eggs, we found in the bar-headed geese, yolk mab concentrations

13、are positively correlated with local breeding density. with the detection of anti-h5n1-aiv mab of bar-headed geese breeding in qinghai lake natural reserve, we found a certain proportions of bar-headed geese of the breeding colony had been infected h5n1 hpai virus before they migrated to island bird

14、, lake qinghai in 2008. and after specific acquired immune responses, they transmitted 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 iv antigen-specific mab to immunologically nave neonates to make them passively acquire maternal aiv antibodies and acquire certain immunocompetence to h5n1 hpai virus. furthermore,

15、 unless mutation of the aiv, it greatly reduced the risk of h5n1 aiv re- infection, and increased the reproductive success and survival probability of the bar- headed geese to a certain extent. the positive correlation of breeding density and mab concentrations indicated, the bar-headed geese at hig

16、h local density acquired relatively higher immunocompetence. the breeding density indicated by nest density may be an influencing factor on the pathogenic infection of colonial breeding waterbirds. in the management of natural reserve, it might be considered to improve habitat conditions of colonial

17、 breeding waterbirds to lower their local breeding density in order to reduce the risk of pathogen invasion accordingly. key words: h5n1; avian influenza; bar-headed goose; artificial hatching; maternal antibody; hemagglutinin inhibition; enzyme linked immunosorbent assay 目錄 i 目 錄 引引 言言.1 第一部分第一部分 文

18、獻綜述文獻綜述.4 第一章第一章 野生鳥類野生鳥類 h5n1 禽流感監(jiān)測的研究進展禽流感監(jiān)測的研究進展.4 1.1 高致病性禽流感在野生鳥類的暴發(fā)及影響.4 1.2 對野生鳥類種群攜帶禽流感等疫源性病原體的檢測技術(shù)進展.7 1.2.1 野生鳥類種群免疫力檢測技術(shù)進展.7 1.2.2 禽流感檢測技術(shù)進展.8 1.3 鳥類母源抗體及其應用.9 1.3.1 母源抗體.9 1.3.2 母源抗體傳遞過程及機理.10 1.3.3 鳥類母源抗體傳遞與疾病防御.12 1.3.4 母源抗體的研究意義和在生產(chǎn)實踐中的應用.13 1.4 野生鳥類禽流感監(jiān)測研究.14 1.4.1 監(jiān)測方法研究進展.14 1.4.2檢

19、測程序和監(jiān)測網(wǎng)絡的建立.15 第二部分第二部分 青海湖鳥島斑頭雁種群青海湖鳥島斑頭雁種群 h5n1 亞型禽流感母源抗體研究亞型禽流感母源抗體研究.16 第二章第二章 青海湖鳥島斑頭雁行為觀察與樣本采集青海湖鳥島斑頭雁行為觀察與樣本采集.16 2.1 斑頭雁棄卵行為觀察.16 2.2 斑頭雁卵的收集.17 2.3 討論.17 第三章第三章 青海湖鳥島斑頭雁的人工孵化青海湖鳥島斑頭雁的人工孵化.20 3.1 孵化前的準備.20 3.2 孵化設(shè)備.20 3.3 入孵及孵化過程監(jiān)控.20 3.4 孵化結(jié)果統(tǒng)計.25 3.5 討論.25 第四章第四章 青海湖鳥島斑頭雁母源抗體水平測試青海湖鳥島斑頭雁母源

20、抗體水平測試.28 4.1 卵黃母源抗體取樣.28 4.2 植物血凝素腫脹測試（pha-induced skin swelling）預試驗 .29 4.3 血凝抑制試驗（hi）檢測卵黃母源抗體.30 4.4 競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗（c-elisa）檢測卵黃母源抗體.33 4.5 檢測結(jié)果統(tǒng)計.36 4.5.1 棄卵和巢卵的mab陽性率比較.36 4.5.2 棄卵和巢卵的mab效價比較.37 4.5.3 母源抗體水平和繁殖密度.38 4.6 討論.39 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 ii 第五章第五章 青海湖斑頭雁禽流感監(jiān)測方案的初步建立青海湖斑頭雁禽流感監(jiān)測方

21、案的初步建立.42 5.1 基于母源抗體的野生鳥類禽流感監(jiān)測的理論意義.42 5.2 基于母源抗體的野生鳥類禽流感監(jiān)測的實踐意義.42 5.3 青海湖斑頭雁種群 h5n1 亞型 aiv 母源抗體檢測方法.43 5.4 青海湖斑頭雁禽流感監(jiān)測預案.44 5.4.1 監(jiān)測現(xiàn)狀及新方案.44 5.4.2 監(jiān)測預案步驟.44 5.5 討論.44 第六章第六章 結(jié)結(jié) 論論.47 參考文獻參考文獻.49 碩士期間發(fā)表論文、參與課題及獲獎情況碩士期間發(fā)表論文、參與課題及獲獎情況.56 致致 謝謝.57 獨獨 創(chuàng)創(chuàng) 性性 說說 明明.58 引言 1 引 言 青海湖，中國最大的內(nèi)陸咸水湖，是全球八條候鳥遷徙路徑

22、中“中亞-印度”路 線的重要組成部分。以青海湖為核心的青海湖國家級自然保護區(qū)，地處青藏高原東 北部，祁連山系南麓 (n36313715，e993410048，湖面 3193m a.s.l)，總 面積 4952km2（包括青海湖整個水域及鳥類棲息的島嶼和湖岸濕地） ，1992 年被列 入關(guān)于特別是作為水禽棲息地的國際重要濕地公約（拉姆薩公約） 國際重要濕 地名錄。青海湖自然保護區(qū)，屬于濕地生態(tài)系統(tǒng)和野生動物類型的自然保護區(qū)，生 物多樣性豐富，面臨著復雜的社會經(jīng)濟和生態(tài)問題1, 2。位于青海湖西端的鳥島： 又名海西皮或蛋島（n3658，e9952，3200m a.s.l.） ，面積 0.22km2

23、，位于布哈河 口以北 4km 處，鳥島在 1959 年初次報道時，四面環(huán)水，島的東南頭大，向西北突 然變狹窄延長，整個島嶼形似蝌蚪，全長 1500m，有普通鸕鶿（phalacrocorax carbo） 、斑頭雁（anser indicus） 、漁鷗（larus ichthyaetus）和棕頭鷗（larus brunnicephalus）4 種水鳥在此集群營巢繁殖3。1978 年以后，由于青海湖水位下降 和風沙堆積等，鳥島的東、北、西三面湖底外露與陸地連在一起，只有南邊瀕臨青 海湖水，鳥島成為湖岸的一個高臺。這一高臺的臨水南坡，坡度平緩，地表由沙土、 石礫覆蓋，與海水交界處是一片灘涂，其中有幾

24、處泉水涌流，現(xiàn)在是斑頭雁和棕頭 鷗的集群營巢繁殖地。 斑頭雁（anser indicus） ，早成鳥，于亞洲南部低地越冬，喜馬拉雅北部高地湖 泊和河流繁殖，集群營巢于小型島嶼，相鄰巢間的距離不超過 1m，有野外研究觀 察到斑頭雁種群在高密度繁殖區(qū)域的分散于巢間的卵4。中國動物志記載5，斑頭 雁，青海湖夏候鳥，單配制，集群繁殖，最早 3 月 20 日遷來繁殖；營巢最早開始 于 4 月上旬，一般在 4 月中旬左右；營巢后 10-12 天開始產(chǎn)卵，窩卵數(shù) 2-8 枚，少 數(shù) 10 枚以上，通常以 4-6 枚為最多；產(chǎn)卵期中，雌雁每隔一天產(chǎn)卵一枚，整窩卵全 部產(chǎn)出需時 4-16 天；孵卵 29 天出雛

25、。 集群繁殖種群有利于群體中個體提高捕食效率和抵御被捕食的風險，而繁殖季 節(jié)大量的個體聚集同樣增加了病原體感染的風險，包括病原微生物入侵的機會6。 在這種生存壓力下，親鳥通過母源抗體傳遞將其病原體特異性的獲得性免疫能力傳 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 2 遞給子代，從而保證子代的存活7。母源抗體的傳遞歷程表明，雛鳥出殼前 5-6 天 的卵黃母源抗體或出殼后 5 天內(nèi)雛鳥的母源抗體水平代表了母體的獲得性免疫抗體 水平，子代的母源抗體水平可以在一定程度上反應親鳥的特異性病原體感染及在其 繁殖環(huán)境中的病原體狀況8。母源抗體傳遞可以作為一種重塑幼鳥表型以適應當?shù)?病原

26、體環(huán)境的特殊途徑，而種群繁殖密度的變化會使母源抗體傳遞隨繁殖群內(nèi)巢位 的不同而發(fā)生改變5。親鳥的這種傳遞能力是提高子代存活率，進而提高種群繁殖 率的一個重要途徑，具有重要的進化意義，同時由于母源抗體是母體種群對其繁殖 環(huán)境中最具威脅的病原體做出的直接反映，因而具有重要的病原體環(huán)境指示意義。 野生鳥類是低致病性禽流感病毒(lowly pathogenic avian influenza, lpai)的自然 宿主，其中雁形目（anseriformes）和鸻行目（charadriiformes）是攜帶病毒最多的 鳥類9。2005 年，h5n1 亞型高致病性禽流感(highly pathogenic

27、avian influenza, hpai)首次暴發(fā)于青海湖國家級自然保護區(qū)的野生遷徙水鳥，其中死亡數(shù)量最多的 是斑頭雁種群10。為了評估這次重大 h5n1 亞型禽流感暴發(fā)事件對棲息在青海湖鳥 島斑頭雁種群的沖擊和此后斑頭雁種群對 h5n1 亞型禽流感病毒（aiv）的免疫力 獲得情況，國內(nèi)外科學家在青海湖地區(qū)進行了大量的研究調(diào)查，使青海湖鳥島成為 野生鳥類禽流感研究的熱點地區(qū)之一。然而，由于對野生水鳥的捕捉相對困難，同 時作為研究對象的各水鳥繁殖群均處在國際重要濕地和國家級自然保護區(qū)的核心區(qū) 內(nèi)，樣品的采集和檢測試驗設(shè)計成為研究的最大瓶頸。 目前, 在青海湖進行的禽流感疫情監(jiān)測研究主要包括兩個

28、途徑，第一，直接捕 捉活體，分別通過棉拭子在喉頭和泄殖腔取樣進行病毒分離檢測和血清取樣進行抗 體水平檢測10, 11；第二，間接撿取鳥類糞便，或提取環(huán)境中的污物和水體等，進行 病毒分離檢測12-14。由于活體捕捉個體數(shù)量有限，并且量較少，沒有一定的代表意 義；如果大量捕捉，又必然嚴重影響到鳥類的繁殖，甚至會導致其放棄繁殖地。活 體捕捉同時也與相關(guān)的制度和法律條例等相抵觸，甚至還會引起國際動物保護組織 的非議15, 16。以美國為代表的取血清并環(huán)志的監(jiān)測方法，導致鳥群可能因此發(fā)生應 激反應，從而偏離正常的遷徙路線17-19。從目前的監(jiān)測研究現(xiàn)狀來看，對青海湖鳥 島斑頭雁種群攜帶病毒現(xiàn)狀或種群抗體

29、水平狀況進行監(jiān)測研究還需要建立更科學合 理的研究方法和思路。 引言 3 本研究基于子代特異性的母源抗體可以反映母體種群的病原體感染及免疫力獲 得情況的基本原理，針對在青海湖鳥島繁殖的斑頭雁種群，設(shè)計了從其棄卵和巢卵 中提取母源抗體（maternal antibody, mab）進而對母體種群進行推測的實驗方案， 以評估該種群對 h5n1 亞型 aiv 的免疫力等狀況。由于在雛鳥出殼前一周的卵黃 mab 和出殼后一周內(nèi)的雛鳥血清 mab 與親鳥的母源抗體水平相似，本實驗在人工 孵化后期進行卵黃取樣的時間滿足雛鳥出殼前一周內(nèi)的要求。對卵黃母源抗體的檢 測，采用定量血凝抑制試驗，并以定性競爭性酶聯(lián)免

30、疫吸附試驗作校正。結(jié)果表明， 青海湖鳥島斑頭雁種群有一定比例（26.5%35.2%）的繁殖對具有對 h5n1 亞型 aiv 的免疫力?；谀冈纯贵w的野生水鳥 h5n1 亞型 aiv 抗體檢測方法可以用在野 生鳥類的禽流感監(jiān)測和疾病防控中。 在青海湖鳥島繁殖的斑頭雁種群，在經(jīng)歷了 h5n1 亞型高致病性禽流感沖擊之 后，存活下來的個體中有獲得和未獲得 h5n1 亞型 aiv 抗體兩種情況。獲得抗體的 個體可能攜帶或不攜帶病毒；而沒有抗體的個體只有一種可能，即還沒有接觸到該 病毒，也就沒有被感染。如果能夠檢測出青海湖鳥島斑頭雁種群子代的母源抗體水 平，而其又能夠反映親代是否傳遞 h5n1 亞型 a

31、iv 的抗體給雛鳥，由此可以得知該 種群是否具有 h5n1 亞型 aiv 抗體。因此本實驗以檢測子代對 h5n1 亞型 aiv 的 母源抗體評估青海湖鳥島斑頭雁種群對 h5n1 亞型 aiv 的感染及免疫力獲得情況， 理論上具有一定的可行性，同時也是方法上的嘗試。 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 4 第一部分 文獻綜述 第一章 野生鳥類 h5n1 禽流感監(jiān)測的研究進展 1.1 高致病性禽流感在野生鳥類的暴發(fā)及影響 高致病性禽流感(hpai)在野生鳥類的暴發(fā)，促使野生鳥類在禽流感病毒傳播中 出現(xiàn)了兩個角色：由于遷徙鳥類引起的禽流感傳播和野生鳥類貿(mào)易途徑的禽流感傳

32、播。在2005年發(fā)生的三個主要的hpai事件之后，野生鳥類被懷疑為在遷徙途中長距 離傳播h5n1亞型高致病性禽流感的對象20, 21：首先，一個重要事件是2005年5月青 海湖h5n1亞型hpai的暴發(fā)。此事件中，整個青海湖保護區(qū)死亡鳥類總數(shù)達6253只 （12種），其中斑頭雁（anser indicus）種群的死亡數(shù)量占死亡鳥類總數(shù)的一半以 上（3272只）22；緊接著青海湖事件之后，沿著中亞遷徙路線（圖1-1綠色部分）， 2005年8月，在青海湖北部的蒙古共和國一個未發(fā)現(xiàn)家禽的地區(qū)（圖1-1黃色星標的 大致位置），檢測出斑頭雁（anser indicus）和疣鼻天鵝（cygnus olor

33、）的h5n1亞 型aiv23；其次，在2005年10月，h5n1亞型高致病性禽流感病毒向西擴散至歐亞， 記錄的有土耳其、羅馬尼亞和烏克蘭的暴發(fā)，通常在或接近遷徙鳥的越冬地，這一 長距離擴散途中沒有任何病毒出現(xiàn)的記錄；第三，2006年春季，h5n1亞型高致病 性禽流感病毒擴散至西歐，引發(fā)大量疣鼻天鵝（cygnus olor）和其他野生鳥類的感 染，盡管在這些區(qū)域有持續(xù)并加強的檢疫，仍然沒有在暴發(fā)之前檢測到家禽的感染。 然而，2005年夏季h5n1亞型hpai在俄國和哈薩克斯坦的暴發(fā)是沿著連接中國西部 至俄國重要的貿(mào)易途徑分布的，而不是沿著任何直接的遷徙路線7。 第一章 野生鳥類 h5n1 禽流感

34、監(jiān)測的研究進展 5 圖1-1 鳥類的亞洲遷徙路線 fig.1-1. asian migratory birds flyways23 從鳥類的遷徙習性研究來看，遷徙鳥類存在著傳播禽流感病毒和引起禽流感流 行的地理差異的潛在可能性。大多數(shù)水鳥為了搜尋春夏季之間短暫的食物資源和躲 避嚴酷的氣候條件，具有季節(jié)性遷徙習慣：它們春季遷徙到繁殖所需食物豐富的高 海拔北極區(qū)繁殖，繁殖后進行短暫的停留，立即帶領(lǐng)幼鳥南遷以遠離仲夏之后的霜 凍等寒冷天氣。這樣的遷徙習慣，導致了多種水鳥遷徙之前在繁殖地南部的集群24- 26。在秋季大部分鳥類南遷之前的繁殖地集群伴隨著幼鳥成熟和成鳥換羽過程，這 種季節(jié)性的聚集中包括跟

35、隨著成鳥并高密度聚集而免疫無能的幼鳥，直到生長一個 月并換羽之后才能飛翔，這種情形正促成了禽流感病毒的傳播和重新分布20。禽流 感的病毒生態(tài)學研究表明，遷徙前水鳥的集群和高密度的免疫無能幼鳥，是引起禽 流感病毒流行的季節(jié)和地理上的差異，并導致在秋季遷徙之前不同種群繁殖聚集地 的流行高峰的兩個因素20, 27-29。 近年來對h5n1禽流感的流行病學研究表明，鳥類在繁殖地和越冬地之間遷徙， 同時經(jīng)過途中停歇地，遷徙過程中鳥類在三個地點都有攜帶禽流感病毒的可能。通 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 6 過對2006年分離出青海湖斑頭雁的h5n1亞型aiv的病毒系譜分析

36、，得出06年的病毒 在系譜上和05年接近，且和斑頭雁的遷徙路線上其他種類鳥的病毒核型相似。說明 2005年爆發(fā)的h5n1禽流感病毒一年后在青海湖的再次出現(xiàn)，此毒株更可能來源于 遷徙路線，而不是05年的毒株，即遷徙鳥將05年毒株的變種攜帶到青海湖；另一種 可能，是05年的病毒留在當?shù)夭l(fā)生突變。從2005年到2006年間歐洲和非洲h5n1 禽流感的暴發(fā)也是鳥類遷徙傳播的結(jié)果（圖1-2）。目前，高致病性的流感病毒已經(jīng) 越過歐亞遷徙路線擴散，可能散播到其他遷徙路線11。而在秋季遷徙中，鴨科鳥類 a型禽流感病毒的流行率在繁殖地（北部）是在越冬地（南部）的三倍。在秋季遷 徙早期的高病毒流行率沿著遷徙路線

37、（南遷）而遞減，因而a型禽流感病毒的流行 力有自北向南遞減的趨勢30, 31。 圖1-2 20052006年野生鳥類攜帶病毒的潛在遷徙路線 fig.1-2. the potential routes of migratory birds from 2005 to 200611 第一章 野生鳥類 h5n1 禽流感監(jiān)測的研究進展 7 實際上，野生鳥類與禽流感病毒之間是一種協(xié)同進化的關(guān)系，可以從攜帶禽流 感病毒而不發(fā)生感染的野生鳥類獲得證據(jù)。野生水禽和涉禽是低致病性禽流感 (lpai)病毒天然的儲存庫，其中一些野生鳥類，如野鴨類(mallard ducks)和涉禽， 可以長距離攜帶和散播hpai（如

38、h5n1亞型）病毒，并不表現(xiàn)出任何臨床癥狀，然 而另一些遷徙鳥類，如雁類(geese)、天鵝類(swans)和鷺類(herons)，通常會在感 染hpai病毒后死亡32-36。雖然高致病性禽流感病毒在野生鳥類種群感染并引起高比 例的死亡并不常見20, 27, 32，但是禽流感病毒在鳥類12個目（88種）中分離出來，報 道分離出最多，也是野生鳥類中攜帶禽流感病毒最多的是雁形目鴨科(anatidae, anseriformes)，如野鴨類、天鵝和雁類，鸻行目(charadriiformes)及鸛形目鷗科 （laridae, ciconiformes）鳥類28, 35。 1.2 對野生鳥類種群攜帶禽

39、流感等疫源性病原體的檢測技術(shù)進展 對野生鳥類的禽流感病毒攜帶情況的評估，在整體免疫力評估的基礎(chǔ)上進行抗 原和抗體的檢測。野生鳥類種群免疫力檢測技術(shù)可以通過一種免疫成分的檢測反映 整體免疫力情況，而禽流感檢測技術(shù)可以及時準確地檢測到病原體和相應抗體的存 在與否。 1.2.1 野生鳥類種群免疫力檢測技術(shù)進展 ken 和 matthew 等37將野生鳥類種群免疫力定義為一個宿主種群抵御或控制被 病原體或寄生蟲感染的能力，總結(jié)出兩類常被研究鳥類生活史策略的生態(tài)學家用來 評估免疫力的技術(shù)方法：常規(guī)監(jiān)測技術(shù)（monitoring）和針對刺激原（challenge） 的檢測評估技術(shù)。監(jiān)測技術(shù)包括在每次取樣時

40、對個體健康和免疫系統(tǒng)狀態(tài)的測試， 結(jié)果除了提供個體免疫能力情況，還反映對當前感染的免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)反應，例如 淋巴細胞數(shù)量低可能代表免疫力低下，也可能反映當前沒有誘導宿主特異獲得性免 疫反應的感染發(fā)生，相反，淋巴細胞數(shù)量高可能反映了高免疫力、當前感染狀態(tài)或 者是兩者的綜合。 通過常規(guī)監(jiān)測技術(shù)，無法預示鳥類在生活史策略和免疫能力間的投資權(quán)衡。因 而近年來生態(tài)學家用檢測評估技術(shù)，在面臨一種新的病原體（為對象種群的敏感原） 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 8 出現(xiàn)時，對免疫系統(tǒng)中的一個要素，通常為體液或細胞免疫在這一病原體暴露環(huán)境 中一系列的免疫反應的研究。檢測評估的優(yōu)

41、勢在于，研究中的每一個體都通過對其 免疫系統(tǒng)的同一個標準來評估，即每一種免疫反應都以一個標準的方案檢測。在此 統(tǒng)一標準評估之下，研究作為生活史決策成分之一的免疫能力，就可以避免研究中 個體差異的影響。 由于資源限制導致個體對其他免疫成分投資的降低，并且在免疫系統(tǒng)所面臨重 要病原體挑戰(zhàn)的選擇壓力之下，個體傾向于對一種免疫成分的投資，研究中可以將 對單一免疫成分的檢測評估作為整體免疫能力的一個指數(shù)。對野生鳥類種群免疫力 的常規(guī)監(jiān)測技術(shù)，包括白細胞計數(shù)（異嗜細胞和淋巴細胞） 、血涂片法測定異嗜細 胞和淋巴細胞比例（ratio of heterophil to lymphocyte，h:l） 、以血流

42、比容計測定血 沉層指數(shù)（白細胞豐富度測量） 、血漿蛋白（標準分光光度法）和血清蛋白（標準 瓊脂糖凝膠電泳） ；檢測評估技術(shù)方法，包括對異種抗原的特異抗體檢測的 srbc(sheep red blood cell)血凝試驗和細胞免疫反應的 pha（phytohemagglutinin） 皮膚腫脹測試37。 1.2.2 禽流感檢測技術(shù)進展 禽流感檢測方法研究進展分為病毒的分離培養(yǎng)、血清學檢測、分子生物學檢測 及基因芯片技術(shù)四個方向38。病毒分離培養(yǎng)檢測周期長、操作復雜，不適用于快速 檢測。常用的血清學檢測方法有血凝和血凝抑制試驗（hemagglutinin-hemagglutinin inhibi

43、tion, ha-hi） 、瓊脂免疫擴散試驗（agar gel immunodiffusion, agp） 、免疫熒 光技術(shù)（immunofluorescence assay，ifa）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, elisa） 。分子生物學檢測技術(shù)包括，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應 （rt-pcr） 、熒光 rt-pcr、rt-pcr-elisa、依賴核酸序列的擴增技術(shù) （nasba）以及環(huán)介導的等溫擴增技術(shù)（lamp） ?；蛐酒夹g(shù)將 rt-pcr 獲得 的 cdna 固化于芯片上，利用核酸探針技術(shù)構(gòu)建檢測 aiv 的芯片平臺。 血清學

44、檢測是利用抗原與抗體在體外和體內(nèi)均能發(fā)生特異性結(jié)合的特性設(shè)計的 檢測抗原或抗體的一系列免疫學檢測技術(shù)，由于體外反應一般用含有抗體的血清進 行，所以又稱為血清學技術(shù)。抗原和抗體發(fā)生結(jié)合反應的物質(zhì)基礎(chǔ)，是抗原的抗原 第一章 野生鳥類 h5n1 禽流感監(jiān)測的研究進展 9 決定基與抗體的抗原結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)互補性，二者相互結(jié)合，在適宜條件下， 出現(xiàn)可見反應。抗原抗體反應具有特異性和可見性。特異性表現(xiàn)在一種抗原一般只 能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。當抗原抗體的數(shù)量比例恰當時，抗體分子和抗原 分子結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)絡狀復合體，反應體系中基本無游離的抗原或抗體， 在適宜的鹽濃度下，有明顯的反應物（沉淀

45、物或凝集物）形成，肉眼可見?？乖?體反應可分為凝集反應、沉淀反應、采用標記物的抗原抗體反應等39。hi 試驗屬 于凝集反應，具有較高的特異性和敏感性，在試驗前需要去除樣本中的特異性凝集 因素，并對抗原進行標準化，目前 who 一般采用此方法進行全球流感病毒的監(jiān)測。 agp 是沉淀反應中的單向免疫擴散反應，一般用來檢測 aiv 的共同抗原核蛋白或 基質(zhì)蛋白。ifa 和 elisa 是用標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應。ifa 是最早用 于鑒定和定位流感病毒感染細胞中的特異性抗原，主要是 np 或 mp 抗原，比病毒 分離鑒定更適用于禽流感暴發(fā)期間的快速診斷。elisa 具有較高的敏感性和特異性

46、， 操作簡便，配套儀器設(shè)備的發(fā)展使操作程序規(guī)范化，穩(wěn)定性進一步提高。elisa 既 可檢測抗體又可以檢測抗原，尤其適用于大批樣品的血清學檢測。國內(nèi)外大多采用 間接 elisa 和競爭 elisa 檢測鳥類抗體水平40。 1.3 鳥類母源抗體及其應用 1.3.1 母源抗體 母源抗體（maternal antibody, mab） ，是免疫力低下的新生個體通過胎盤、初 乳、乳汁或卵黃從母體獲得的抗體41, 42。哺乳類動物幼體通過胎盤或初乳獲得母源 抗體，鳥類除鳩鴿科鳥類的鴿乳外，都是通過卵黃獲得母源抗體。動物胚胎生活在 無菌的環(huán)境中，離開母體后立即進入富有微生物的外界環(huán)境中，新生動物自身產(chǎn)生 的

47、免疫應答都是潛伏期長、抗體水平低的初級應答，在外界環(huán)境中會由于無法抵抗 微生物而不易存活。因而由母體提供免疫援助，這種免疫援助是通過母源抗體提供 的。由于母源抗體的存在，新生個體對病原體入侵有較強的抵抗能力，例如仔豬和 羔羊?qū)U菌類的不感受性，就是獲得了母源抗體的結(jié)果42。 剛孵出的幼鳥來自卵的無菌環(huán)境中，像哺乳類一樣，需要暫時的免疫援助。產(chǎn) 卵之前，雌鳥就將其血清中的免疫球蛋白轉(zhuǎn)移到卵黃中。卵黃免疫球蛋白 igy 通過 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 10 卵泡上皮主動轉(zhuǎn)移到卵黃囊中43。有研究發(fā)現(xiàn)，在液態(tài)卵黃中的 igy 和母體血清中 的抗體水平相似44。在

48、卵沿著輸卵管向下移動時，來自輸卵管分泌物的 igm 和 iga 融合到卵白中。在雛雞胚胎發(fā)育時，吸收卵黃中的 igy 到血液循環(huán)系統(tǒng)，而卵白中 的 igm 和 iga 混合到氨基酸液體中被胚胎吞食，因而出殼后的幼鳥在血清中含有 igy，而腸道中含有 igm 和 iga，前者待完成出殼后早期的免疫功能，后者已完成 胚胎在卵中發(fā)育的營養(yǎng)45。血清 igy 在出殼后一周內(nèi)的雛雞體內(nèi)半衰期是 729hrs45。 1.3.2 母源抗體傳遞過程及機理 母源抗體傳遞，指由具有免疫能力的成體，尤其是雌體，通過胚胎傳遞或者初 乳、乳汁、卵黃等將其抗體傳遞給免疫能力低下的新生個體41。新生個體沒有合成 內(nèi)源性抗體

49、的能力, 因而來自母體的抗體將提供其后代生命早期體液免疫防御的最 初形式, 母源抗體大約從其后代開始主動合成抗體時消失46, 47。鳥類母源抗體傳遞 歷程大致為三個階段：在親鳥產(chǎn)卵前的4-5天內(nèi)，母源抗體開始大量傳遞到卵黃囊； 產(chǎn)卵后再發(fā)育的最后5-6天（即出殼前5-6天） ，大量母源抗體由卵黃囊傳遞到胚胎； 雛鳥在出殼5天后自身開始主動合成抗體，14天后開始分解母源抗體48。這樣的傳 遞歷程表明，雛鳥出殼前5-6天的卵黃母源抗體或出殼后5天內(nèi)雛鳥的母源抗體水平 代表了母體的獲得性免疫抗體水平，子代的母源抗體水平可以在一定程度上反應親 鳥的特異性病原體感染及在其繁殖環(huán)境中的病原體狀況8。 母源

50、抗體在子代的持續(xù)時間及降解速度由動物種類、免疫球蛋白類別、原始濃 度及半衰期的不同而有差異，其持續(xù)時間從魚類的10天，到人體達到9個月不等 （見表1-1）41, 42。據(jù)研究，雛雞出殼時大部分血清的igg均來自孵化過程中最后 56天的卵黃囊，出殼后14天后開始分解母源抗體，56周齡時開始獨立合成抗體， 母源抗體水平接近成雞水平24, 29, 31, 32。在仔鴿的母源抗體i型副粘病毒血清抗體與 母源抗體的比較研究中發(fā)現(xiàn)，仔鴿的母源抗體水平高低和維持時間長短和種鴿血清 抗體濃度直接相關(guān)：當種鴿血清抗體效價在6log2以下時，其所產(chǎn)仔鴿幾乎不能得到 母源抗體(4log2以下)的免疫保護，而當種鴿血

51、清抗體效價在8log2以上時，其所產(chǎn) 仔鴿可全部得到母源抗體(4log2以上)保護49。 第一章 野生鳥類 h5n1 禽流感監(jiān)測的研究進展 11 表1-1 mab在不同物種的傳遞途徑 tab. 1-1 routes of transmission of mab across taxa41 種類出生前 mab 來源出生后 mab 傳遞途徑 被動免疫 持續(xù)時間 主動免疫 發(fā)育時間 魚類 鯉魚 (cyprinus carpio) 卵黃卵黃10 天58 個月 爬行類 沙漠龜 (gopherus agassizii) 1 年 鳥類 家雞 （gallus domesticus） 卵黃卵黃(5 天)2 周

52、6 周 6 個月 綠頭鴨 (anas platyrhynchos) 卵黃卵黃2 周 71 天 金剛鸚鵡 (anas ararauna) 卵黃卵黃 6 周 哺乳類 褐家鼠 (rattus norvegicus) 胎盤腸道（20 天）4-10 周 2 周 小家鼠 (mus musculus) 胎盤腸道（20 天）6-10 周 2 周 豚鼠 (cavia porcellus) 卵黃4 個月 兔 (oryctolagus cuniculus) 卵黃12 個月 家馬 (equus caballus) 腸道（24 小時）3239 天 人類 (homo sapiens) 胎盤腸道9 個月12 年 與哺乳類那

53、樣能夠終生產(chǎn)生新的抗原結(jié)合特性不同，鳥類只有在孵化期之前的 一段短暫的時間內(nèi)由法氏囊產(chǎn)生的發(fā)育 b 細胞產(chǎn)生抗體結(jié)合的受體45，這是母源抗 體產(chǎn)生的基礎(chǔ)。雖然已證實干細胞，b 細胞的前體，在進入孵化期之前就存在于胚 胎的骨髓中，但是 b 細胞在法氏囊中的克隆一般發(fā)生在胚胎發(fā)育的 8-14 天之間45, 50。法氏囊的發(fā)育還受到激素的控制，因而雄鳥會在表達第二性征和免疫能力之間 權(quán)衡，例如具有較大雞冠的雄性家禽趨向于產(chǎn)生較少的抗體45, 51。 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 12 鳥類有三種免疫球蛋白，igm、igy 和 iga。不同于哺乳類的免疫球蛋白具有兩

54、條輕鏈( 鏈和 鏈)，鳥類中有一條輕鏈( 鏈)。1969 年 leslie 和 clem 首次證實 52，鳥類的主要免疫球蛋白類型區(qū)別于哺乳類的 igg，為一種完全不同的蛋白，并 將其命名為 igy。鳥類的 igy 可能同時具有哺乳類 igg 和 ige 兩種屬性。盡管存在 鳥類患急性過敏性反應癥狀的事實，但沒有遺傳學或其他研究證據(jù)表明鳥類會產(chǎn)生 ige，而這種類過敏反應可能是由 igy 介導的45。鳥類通過產(chǎn)卵將母源抗體（母源 免疫球蛋白）通過卵中內(nèi)容物傳遞給后代，其中卵黃含有 igy，而卵清中含有 iga。iga 是鳩鴿科鳥類通過鴿乳傳遞給后代的免疫球蛋白，這是鳥類母源抗體傳遞 免疫球蛋白

55、類型 igy 的一個著名的例外。雉雞科鳥類都含有保守且完整的 igy，而 雁形目鳥類不但含有完整的 igy 分子，而且具有特殊的 igy 分子片段(fc)26-28。 擁有如 igy(fc)類小的抗體分子，有特殊的優(yōu)勢，例如小分子不會結(jié)合到巨噬細胞， 因而機體不會有激發(fā)致命超敏反應的潛在風險45。此外，雁形目鴨科鳥類的完整的 igy 分子和家雞非常相似，有 25%的氨基酸完全同源，54%的氨基酸序列在恒定區(qū) 的半胱氨酸和色氨酸殘基完全保守45。 盡管具有以上區(qū)別，抗體在所有物種的生物學角色都是抵御胞外入侵物，正因 為如此，抗體反應的基本機理和功能在不同脊椎動物類別中都是比較保守的。然而， 鳥類

56、表現(xiàn)防御功能的過程與哺乳類有一定區(qū)別，即使兩者抗體分子在一定程度上相 似，b 細胞選擇過程和多樣性抗體產(chǎn)生的機制有顯著不同45。鳥類 b 細胞選擇過程 和哺乳類明顯不同，可分為三個階段24, 27, 28：首先，起源于干細胞的 b 細胞前體依 次在卵黃囊和骨髓中生長；然后，前提 b 細胞從骨髓遷移到法氏囊，在此經(jīng)歷陰陽 性選擇；最后，只有在法氏囊中選擇過程完成之后，成熟 b 細胞遷移到次級淋巴器 官，在此遇見外源微生物并產(chǎn)生抗體。抗體生成系統(tǒng)在鴨科鳥類的發(fā)育較晚。因而 在鴨科鳥類的卵中，孵化 16 天以后才能在法氏囊或脾臟中檢測到 mrna 編碼的 igm 的重鏈，23 天之后才能在頸淋巴結(jié)中

57、檢測到，而骨髓、血沉層、哈氏腺和肝臟 中只有在孵化 7 天后才能檢測出。對于 igy 的一種或兩種同種異形分子，首次在鴨 科鳥類的卵中胚胎的頸淋巴結(jié)中檢測到是在孵化的第 25 天，在脾臟和法氏囊檢測 到是幼鳥孵化出殼一天后，在哈氏腺、骨髓和肝臟中檢測到是在出殼后的 10-17 天， 血沉層中是出殼后的第 46 天檢出45。 第一章 野生鳥類 h5n1 禽流感監(jiān)測的研究進展 13 1.3.3 鳥類母源抗體傳遞與疾病防御 鳥類母源抗體傳遞與種群疾病防御的對應關(guān)系體現(xiàn)在間接遺傳效應（indirect genetic effects, ige）和間接環(huán)境效應（indirect environmenta

58、l effect, iee）兩種機 理41：首先，ige表現(xiàn)在以下三點，決定母源抗體傳遞的基因在親代表達，而選擇 作用則主要發(fā)生在子代接受母源抗體時，子代存活比起親代更易受到這種傳遞變化 的影響；決定母源抗體傳遞的基因頻率直到子代成熟并傳遞母源抗體給其下一代時 才有明顯的變化；如果親鳥選擇升高體液免疫水平以傳遞母源抗體給后代將導致自 身細胞免疫和天然免疫的相應降低。其次，如果親代暴露給特定的病原體并誘導產(chǎn) 生抗體后傳遞給其子代個體，再次受到同一病原體入侵時，子代個體會增高更有效 的母源抗體水平，稱為iee或跨代表型可塑性53, 54。相反，親鳥在傳遞前未曾暴露 給特定的病原體將不會傳遞這種病原

59、體誘導的抗體給雛鳥，使其子代易被感染55, 56。 在缺乏母源抗體時，后代的免疫反應會被抑制，若遇到嚴酷的病原體傳播環(huán)境，存 活率必定降低57。盡管親鳥產(chǎn)卵中抗體水平穩(wěn)定，但同一繁殖對的雛鳥間的母源抗 體水平可能不同58, 59。 用來解釋引起疾病暴發(fā)的典型機制的有以下三個因素60：第一， 暴露給病原 體的機會增多（如由于物種間新的接觸） ；第二，病毒的突變；第三，宿主種群的 易感性增大（通過暴露給藥物或污染） 。母源抗體可以改變病原體的表達，尤其是 其引發(fā)疾病的嚴重程度。在病毒傳播率低時，大部分宿主種群在母源抗體缺乏的情 況下發(fā)生感染，從而發(fā)展到劇烈的疾病暴發(fā)；相反，在病毒傳播率高時，大多數(shù)

60、宿 主帶有母源抗體，感染后疾病的嚴重程度較小，并誘發(fā)免疫反應以保護宿主集體抵 御潛在的再次感染。因而，病毒傳播率的降低改變了宿主和病毒的關(guān)系，使得大多 數(shù)疾病被母源抗體減弱，變?yōu)榕紶柋┌l(fā)但是劇烈的疾病61。 鳥類生活史策略選擇中，是對生活史還是免疫力投資的權(quán)衡是限制免疫能力的 一個可控因素，其中有三個可以肯定的規(guī)律：鳥類的免疫能力一定收到資源的限制； 對生活史成分（如繁殖努力、性別修飾等）的投資與對免疫能力的投資之間成反向 相關(guān)，即在生活史投資越多，免疫能力越低，免疫能力與適合度之間呈正相關(guān)關(guān)系 37。 青海湖斑頭雁 h5n1 亞型禽流感病毒母源抗體檢測與免疫力評估 14 1.3.4 母源抗體