【2019年整理】誘導性多潛能干細胞iPS的研究進展

1、誘導性多潛能干細胞(iPS)的研究進展 賴曉娟 (寧波大學生命科學與生物工程學院， 07 生物技術班，寧波， 315211 ) 摘要： 體細胞誘導成為多潛能性干細胞 ( induced pluripotent stem cell, iPS)的研究成 果被譽為生命科學領域新的里程碑。由于iPS 細胞既避免免疫排斥 , 又不涉及倫理道德問題 , 因此具有廣泛且重要的臨床應用價值。iPS細胞自2006年誕生以來，在短短的 3年多時間里， 得到了飛速的發(fā)展。本文結(jié)合最新的研究結(jié)果，綜述了iPS 細胞的研究概況，針對 iPS 細胞 研究領域存在的問題，包括如何提高iPS細胞的安全性及建系效率、iPS細胞

2、形成的分子機 制、應用前景等進行了討論，以期為今后關于這方面的研究提供參考。 關鍵詞：iPS細胞優(yōu)化重編程應用前景 胚胎干細胞(ES細胞)由于具有發(fā)育上的全能性而備受研究者重視，但其獲取的困難、 免 疫排斥的風險和倫理學的爭議等也使其研究和應用飽受困擾。因此，人們一直試圖找到一種 方法，將人體正常體細胞直接重編程為ES樣細胞。2006年3月，日本學者Shinya Yamanaka 首次通過導入4種基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc )，將分化成熟的小鼠正常體細胞重新誘 導成為一個多功能的干細胞， 具有類似胚胎干細胞的所有特性， 將其命名為誘導性多潛能干 細胞(induced plu

3、ripotent stem cells，iPS)。iPS細胞一經(jīng)問世，即在生命科學領域引起了一 次轟動，被譽為生命科學領域新的里程碑，之后的研究成果和技術突破更是層出不窮。iPS 細胞具有獲取方便、多向分化、無倫理學限制等優(yōu)點，在再生醫(yī)學與疾病模型等研究領域有 著廣闊的應用前景。 1 iPS細胞的研究概況 2003年，Gurdon研究小組發(fā)現(xiàn)，將已完全分化的小鼠胸腺細胞或成人外周血淋巴細胞的細胞 核注入爪蟾卵母細胞后 ，哺乳動物細胞核的分化標志物喪失 ， 而哺乳動物干細胞中最具特征 性的標志物Oct4則呈高表達，提示哺乳動物細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構 從而表達 Oct42， 這項

4、研究開啟了誘導人類體細胞轉(zhuǎn)變成干細胞的新思路。2006， 日本科學 家Takahashi和Yamanaka用4種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc)，在體外直接誘導小鼠的 皮膚成纖維體細胞成為具有像胚胎干細胞一樣有多發(fā)育潛能的多能干細胞，并將其命名為誘 導性多潛能干細胞 (induced pluripotent stem cells , iPS)。2007年，美國 Whitehead研究所 Jaenisch 研究組重復并改進了 Yamanaka的iPS細胞工作。他們建立的小鼠iPS細胞不僅在體外培養(yǎng) 條件下可以無限擴增和分化為體內(nèi)的任何種類細胞 ， 并且可以在注入囊胚后產(chǎn)生

5、嵌合體和 生殖細胞。同年,Yamanaka和美國Thomson研究組分別用特定的因子誘導人類成纖維細胞 成為iPS細胞5。同年，美國Jaenisch的研究組還利用患有鐮刀狀貧血小鼠的成纖維細胞建立 了iPS細胞，并通過基因打靶修正疾病基因 3。然后，將含有正確基因的iPS細胞誘導分化為 血液干細胞細胞并移植回患病小鼠 ， 使小鼠的貧血癥狀得到改善。這一成果證明 iPS 細胞具 有用于疾病治療的潛能。 iPS 細胞的分離培養(yǎng)成功是干細胞研究乃至生命科學領域的里程 碑。它首次證明可以用已知的幾種因子在體外逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分化的細胞， 使之成為具有發(fā)育全能 性的細胞。這種體細胞的直接重編程使我們有可能建立患

6、者特異的iPS細胞，誘導其分化用 于細胞治療 ， 解決異體移植的免疫排斥問題并實現(xiàn)因人而異的藥物安全性和毒性檢驗; 也可 以建立疾病特異的iPS細胞，用于研究疾病的發(fā)生機理和治療途徑；此外建立iPS細胞系還避 開了建立人胚胎干細胞所涉及的倫理障礙。 2優(yōu)化建立iPS細胞的方法 早期建立iPS細胞的方法為：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導表達 4個Yamanaka因子，然后將細胞 在ES細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng),再用抗性基因篩選多潛能性相關啟動子的激活,如Oct4和Nanog啟 動子，在得到與ES細胞形態(tài)相似的iPS細胞后，鑒定iPS細胞的多潛能性。這些方法構建iPS 細胞的效率很低 , 細胞多潛能性不均一 , 而且

7、有內(nèi)在安全問題 , 如病毒的插入突變和 c-Myc 的致癌性，使其仍無法應用于臨床治療。為解決這些安全問題和提高iPS細胞建系的效率，人 們從多方面改進構建iPS細胞的方法。 2.1提高iPS細胞的安全性 由于Yamanaka因子中有c-Myc這個致癌基因，且Klf4也有一定的致癌能力6-7，因此， 在將iPS細胞用于臨床治療之前，要嚴格分析iPS細胞的成瘤趨勢。已有研究8表明，因為轉(zhuǎn) 基因c-Myc的重新激活，導致20%的通過生殖系轉(zhuǎn)移得到的iPS后代小鼠形成了腫瘤。為了 降低iPS細胞的成瘤趨勢，Nakagawa等人9和Wernig等人10又嘗試了只用Oct4, Sox2和 Klf4 3個

8、因子，而不用c-Myc來誘導iPS細胞，并獲得了成功。此后,Huangfu等人11發(fā)現(xiàn)一種組 蛋白去乙酰化酶抑制劑 (valproic acid, VPA)可提高Oct4, Sox2和Klf4 3個因子的重編程效率。 最近，F(xiàn)eng等人12用Essrb替代c-Myc和Klf4這兩個潛在的致癌因子，與Oct4和Sox2共同 作用可有效地把胎鼠成纖維細胞重編程為iPS細胞。而Aoi等人5比較不同來源的iPS小鼠后 代的成瘤趨勢和死亡率，發(fā)現(xiàn)從肝臟細胞和胃表皮細胞誘導得到的iPS細胞形成的小鼠的成 瘤趨勢比由MEF細胞衍生得到的iPS小鼠要低很多，且前者的死亡率更低，死亡時間較遲。這 說明用于iPS

9、細胞的供體細胞對于腫瘤形成有不同敏感性。盡管影響iPS細胞小鼠后代的成癌 趨勢和死亡率的機制還不清楚，但是，將來把iPS應用于臨床治療時，應選擇適當?shù)墓w細胞 種類，避免用易致瘤因子誘導iPS細胞，以提高iPS細胞的安全性。 除去c-Myc致癌基因的安全隱患，用于介導外源基因表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒也有潛 在的安全問題。因為 ， 不管是逆轉(zhuǎn)錄病毒 ， 還是慢病毒 ， 都會把外源基因整合到基因組 DNA 中，這就有可能引起插入突變。這就要求在建立iPS細胞的過程中，盡量減少使用，甚至不用 逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒。研究者將4個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4，Sox2，c-myc和Kzf4)構建到一個病毒載 體中，

10、并成功利用該載體誘導小鼠和人體細胞形成iPS細胞，單個病毒載體有助于減少載體 整合引起基因突變的幾率 13利用瞬時表達的腺病毒載體轉(zhuǎn)染4個基因同樣能夠?qū)崿F(xiàn)誘導成 纖維細胞和小鼠肝細胞獲得iPS細胞，而且腺病毒載體并不整合到細胞基因組內(nèi)，這就解決 了 iPS細胞建系中最大的安全問題14。更進一步的研究表明誘導iPS細胞生成可以不應用任何 病毒載體，僅用兩個表達質(zhì)粒就可實現(xiàn)誘導小鼠胚胎成纖維細胞形成iPS細胞，其中一個質(zhì) 粒攜帶Oct3/4, Sox2和Klf4的cDNA序列，另一個質(zhì)粒攜帶 c-Myc的cDNA序列，該方法對 解決iPS細胞應用巾的安全性問題具有十分重要的意義15。另有報道，直接

11、轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)分子 可實現(xiàn)體細胞重編程，甚至可以只在培養(yǎng)體系巾添加誘導因子來實現(xiàn)iPS細胞的建立，提高 重編程的效率 16。 2.2提高iPS細胞的建系效率 iPS細胞系建立的效率低,特別是在減少因子或不用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的情況下，效 率更低。第一篇關于iPS細胞的報道中，iPS細胞建系效率只有0.02%。誘導iPS細胞形成的低 效率對iPS細胞的臨床應用有一定影響，更重要的是不利于人們研究iPS細胞形成的機理。所 以， 大家都在尋找新的因子或小分子化合物來提高誘導 iPS 細胞的效率。已有研究表明，組 蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的抑制劑BIX-01294可提高Oct4和Klf4兩個因子重編程NPCs

12、的效率 17。此外，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑 5-aza-cytidine(AZA)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑 VPA都可 顯著提高誘導iPS細胞的效率11,18,19。另外，Zhao等人20發(fā)現(xiàn)使用4個Yamanaka因子，甚至在 不包括C-MYC的情況下，同時下調(diào)p53和過量表達UTF1可使誘導iPS細胞的效率增加100倍。 從另一個角度來看，不同的供體細胞也能顯著地影響iPS細胞建系的效率。Aasen等人21 發(fā)現(xiàn)以青少年的角化細胞為供體細胞 ， 同樣用逆轉(zhuǎn)錄病毒來介導表達 Oct4， Sox2， Klf4 和 c-Myc,這樣獲得iPS細胞的效率比用成纖維細胞為供體細胞建立iPS細胞的效

13、率高至少100 倍，而且iPS克隆出現(xiàn)的速度也提高了兩倍。利用角化細胞重編程的高效率，他們還從一根來 自30歲成年女子的頭發(fā)中分離了角化細胞，然后成功地把這些角化細胞誘導成iPS細胞。這 項研究證明了，在建立iPS細胞時，供體細胞只要一根頭發(fā)即可，避免了繁瑣的、有傷害性的 手術操作。 3 iPS細胞形成的分子機制 iPS細胞形成的分子機制研究對iPS細胞的制備、制備效率的提高、安全性評估、定向誘 導分化、 疾病分子機制研究、 以及今后的臨床應用等均具有重要意義。 雖然目前我們對體細 胞誘導重編程的機制還知之甚少，但是最近在ES細胞等干細胞中對基因組水平和表觀遺傳 學水平開展的大規(guī)模的研究將對了

14、解整個重編程機制有重要的提示作用。 3.1 iPS細胞形成過程中多潛能性分子標記物的激活動態(tài) 人們研究了在誘導iPS細胞形成的過程中，與干細胞多潛能性相關的標記基因和表面特 異性抗原被激活的次序，以期了解iPS細胞形成的分子機制。Stadtfeld等人22和Brambrink等 人23都利用了可誘導表達4個Yamanaka因子的胎鼠成纖維細胞來進行重編程實驗，他們 發(fā)現(xiàn)在重編程的早期 ， 先是成纖維細胞的標記基因 Thy1 的表達下降 ， 同時伴隨著堿性磷酸 化酶 (Alkaline phosphatase) 和細胞表面抗原 SSEA1 的表達增加 ， 而內(nèi)源的 Nanog， Sox2 和 O

15、ct4的表達只有在重編程的晚期才能檢測到。此外，端粒酶(telomerase)的表達以及X染色 體的重新激活也發(fā)生在重編程的晚期 22。 這兩個科研小組還報道了至少要持續(xù) 1012 天表 達外源的Yamanaka因子，才能夠誘導出iPS克隆。 3.2 iPS 細胞形成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳重編程 由于最常用的4個Yama naka因子都是轉(zhuǎn)錄因子，即使在Thoms on小組使用的4個因子 中，也有3個轉(zhuǎn)錄因子OCT4, NANOG 和SOX2。因此，一個重要的問題就是這些因子是通 過調(diào)控哪些下游基因來誘導iPS細胞形成的。研究發(fā)現(xiàn)24-28，Oct4,Nanog和Sox2之間可相 互調(diào)節(jié) ，

16、形成一個 ES 細胞多潛能性的調(diào)控中心 ， 可維持對 ES 細胞多潛能性必要的基因表 達，同時抑制與分化相關的基因表達。Sridharan等人29進一步分析了 4個Yamanaka因子在 iPS細胞、ES細胞以及部分重編程的細胞中的全基因組結(jié)合位點。他們發(fā)現(xiàn)4個丫amanaka 因子的結(jié)合位點在 iPS 細胞和 ES 細胞有很大的重疊 ， 但與部分重編程的細胞中的結(jié)合位點 有較大區(qū)別。他們還發(fā)現(xiàn)在體細胞重編程早期 ， c-Myc 在抑制成纖維細胞特異性基因表達和 激活胚胎代謝程序中起重要作用，表明了4個Yamanaka因子在重編程的不同階段起著不同 的作用。 通過使用一些可調(diào)控表觀遺傳修飾的小

17、分子化合物可提高誘導iPS 細胞的效率 ，表明表 觀遺傳信息的重編程是iPS細胞形成過程中的重要步驟。Maherali等人和Mikkelsen等人19 較系統(tǒng)地比較了 iPS，ES和MEF細胞的表觀遺傳特性，發(fā)現(xiàn)iPS和ES細胞在DNA甲基化、組 蛋白H3賴氨酸4(H3K4)和賴氨酸27(H3K27)的甲基化上十分相似，而與iPS細胞的供體MEF 細胞有著顯著的差異。而且在雌性的iPS細胞中，原來被沉默的一條X染色體也被激活了。 這些都表明了在建立iPS細胞的過程中，要將體細胞原有的表觀遺傳信息進行重編程，以建 立多潛能性細胞所特有的表觀遺傳信息。 Mikkelsen 等人19還分離出不完全重

18、編程的細胞系 這些細胞系的表觀遺傳特性介于iPS細胞和MEF細胞之間，同一克隆的不完全重編程細胞 可生長成兩群細胞一一表達或不表達Oct4-GFP報告基因，并且用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑 AZA處理該細胞系可促進這些細胞向完全重編程的iPS細胞的轉(zhuǎn)化。這就表明了目前建立 iPS細胞中，表觀遺傳重編程是一個隨機的過程，且該過程的效率不高，如能有效地人為控 制表觀遺傳重編程將大大提高iPS細胞形成的效率。 3.3 iPS細胞形成中端粒的重編程 端粒是染色體末端 DNA 重復序列 (TTAGGG)n, 并結(jié)合有多種端粒相關蛋白 , 以保護染 色體末端和維持基因組穩(wěn)定性。 一般情況下 , 端粒長度由特

19、異性端粒酶來維持。 端粒在 iPS 細胞的形成和多潛能性中也起著重要作用。相對于體細胞,iPS細胞中端粒酶活性升高22,而 且iPS細胞的端粒長度也增加30。此外,iPS細胞端粒的表觀遺傳修飾與ES細胞相似，如較低 水平的組蛋白H3K9和H4K20的三甲基化,以及端粒轉(zhuǎn)錄活性的增加。雖然iPS細胞可以由端 粒酶缺失(Terc-/-)MEF誘導而來，但是這些Terc-/- iPS細胞的端粒延長有缺陷,而且不能 產(chǎn)生活的嵌合體后代，說明Ter iPS細胞并不具有完整的發(fā)育多潛能性。重編程的效率還 與端粒酶缺陷小鼠的傳代次數(shù)相關 ,傳代越多的端粒酶缺陷小鼠的 MEF 越難重編程 30。 4 iPS細

20、胞的應用前景 iPS細胞的出現(xiàn)為整個干細胞生物學和再生醫(yī)學領域帶來了革命性的影響，伴隨著的與 iPS應用相關的研究也迅速開展，如將其向造血細胞誘導分化，治療小鼠的鐮刀狀細胞性貧血 3。將小鼠iPS細胞誘導分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，整合入小鼠大腦組織內(nèi)發(fā)揮功能； 將小鼠iPS細胞在體外分化為多巴胺能神經(jīng)元，移植入帕金森氏病模型的大鼠腦內(nèi)以改善疾 病癥狀等31o iPS細胞分化而來的內(nèi)皮細胞治愈了血友病因子8缺陷的小鼠32。這些都證明 以iPS細胞為基礎的細胞治療在動物體內(nèi)可以實現(xiàn)。iPS細胞技術的建立已經(jīng)取得了鼓舞人心 的突破。哈佛大學的研究人員成功地將一個患家族性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)的8

21、2歲女性患者 的成纖維細胞重編程為iPS細胞，并且誘導iPS細胞成為有一定缺陷的運動神經(jīng)元。該模型的 建立可以用來研究該疾病的發(fā)病機制， 篩選可能的治療藥物， 并有可能最終應用于自體細胞 移植治療ALS33。從患脊髓性肌萎縮的兒童患者皮膚成纖維細胞也已成功獲得iPS細胞，其 能夠在體外增殖，并且能夠保持疾病的基因表型，體外誘導分化能夠形成運動神經(jīng)元34o 此外更多種類的人類疾病iPS細胞系已經(jīng)成功建立35，這些細胞系的建立為研究相關疾病的 發(fā)生機制和相關藥物開發(fā)提供了十分珍貴的模型。 5 結(jié)語 iPS細胞之所以引起人們的興趣，是因為它解決了免疫排斥的問題，并避免了倫理道德 的制約，使離實現(xiàn)細胞

22、替代治療又近了一步。但是，由于iPS細胞自身的安全性問題，目前 iPS細胞還無法應用于臨床治療。要得到符合臨床應用標準的iPS細胞，我們必須避免使用整 合性病毒，以及有致癌性的外源基因。此外，提高iPS細胞的建系效率，以及建立高效的iPS 細胞體外分化和純化體系也有助于iPS細胞的臨床應用。不久前，美國食品藥品監(jiān)督管理局 (the U.S. Food and Drug Administration)批準了 Geron進行關于在脊椎受傷的病人身上應用ES 細胞治療的臨床一期的安全測試36。盡管這僅僅是將ES細胞應用在人體上的第一步，但在可 以預見的將來，會有更多的臨床實驗推動將干細胞研究應用到臨

23、床治療上。iPS細胞所提供 的新思路、 新技術和新方法具有重大的理論意義和實用價值， 將為干細胞和再生醫(yī)學的應用 提供治療用的種子細胞； 同時， 也是研究發(fā)育生物學、疾病發(fā)生發(fā)展機制、 基因與蛋白質(zhì)功 能分析、藥物篩選與評價等的一項十分重要的工具?？梢灶A言，iPS細胞的研究會成為生命 科學領域的一個重要方向，隨著技術的不斷進步，相信iPS細胞研究的進展會比人們想象的 更為迅速。今天，我們從iPS細胞上看到了它為人類疾病治療所帶來的希望和契機，我們更期 待在不遠的將來，iPS細胞的不足會在人們的努力下逐一地被克服，iPS細胞最終有望真正用 于造福人類健康。 參考文獻 1 Takahashi K，

24、 Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 2006, 126(4): 663-676. 2 Byrne JA, Simonsson S, Western PS, Gurdon JB.Nuclei of adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by

25、amphibian oocytes. Curr Biol 2003;13: 1206-1213. 3 Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin, Science, 2007, 318(5858): 1920-1923. 4 Maherali N, Sridharan R, Xie W, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show g

26、lobal epigenetic remodeling and widespread tissue contribution, Cell Stem Cell, 2007, 1(1): 55-70. 5 Aoi T, Yae K, Nakagawa M, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells, Science,2008, 321(5889): 699-702. 6 Meyer N, Penn L Z. Reflecting on 25 years with MYC.

27、 Nat Rev Cancer, 2008, 8: 976 990. 7 Rowland B D, Peeper D S. KLF4, p21 and context-dependent opposing forces in cancer. Nat Rev Cancer, 2006, 6: 11 23. 8 Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448: 313 317. 9 Nakagawa M, Koyan

28、agi M, Tanabe K, et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.Nat Biotechnol, 2008, 26: 101 106. 10 Wernig M, Meissner A, Cassady J P, et al. c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell, 2008, 2: 10 12. 11 Hua

29、ngfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol, 2008, 26: 795 797. 12 Feng B, Jiang J, Kraus P, et al. Reprogramming of fibroblasts into induced pluripotent stem cells with orphan nuclear receptor

30、Esrrb. Nat Cell Biol, 2009, 11: 197 203. 13 Carcy BW ，Markoulaki S ，Hanna J，et a1Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector Proc NatI Acad Sci U S A ， 2009， 106(1)： 157-162. 14 Stadtfeld M ，Nagaya M ，Utikal J，et a1Induced pluripotent stem cells generated with

31、out viral integration Science，2008，322(5903)：945-949. 15 Okita K ，Nakagawa M Hyenjong H ，et a1Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors Science，2008，322(5903)： 949-953. 16 Marson A ，F(xiàn)oreman R，Chevalier B ，et a1 Wnt signaling promotes reprogramming of somatic cells to p

32、luripotency Cell Stem Cell ，2008，3(2)： 132 135. 17 Shi Y, Do J T, Desponts C, et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2008, 2: 525 528. 18 Huangfu D, Osafune K, Maehr R, et al. Induction of pluripotent stem cells from prim

33、ary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol, 2008, 26: 1269 1275. 19 Mikkelsen T S, Hanna J, Zhang X, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature, 2008, 454:49 55. 20 Zhao Y, Yin X, Qin H, et al. Two supporting factors greatly improve the eff

34、iciency of human iPSC generation. Cell Stem Cell, 2008, 3:475 479. 21 Aasen T, Raya A, Barrero M J, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol, 2008, 26: 1276 1284. 22 Stadtfeld M, Maherali N, Breault D T, et al. Defining molecula

35、r cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell, 2008, 2: 230 240. 23 Brambrink T, Foreman R, Welstead G G, et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell, 2008, 2: 151 159. 24 Boyer L A, Lee

36、 T I, Cole M F, et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell, 2005, 122:947 956. 25 Loh Y H, Wu Q, Chew J L, et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet, 2006, 38: 431 440. 26 Jiang J, Chan Y

37、S, Loh Y H, et al. A core Klf circuitry regulates self-renewal of embryonic stem cells. Nat Cell Biol, 2008, 10:353 360. 27 Chen X, Xu H, Yuan P, et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell, 2008, 133: 1106 1117. 28 Marson A, Levine S S, Cole M F, et al. Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells. Cell, 2008, 134: