CHAPTER7分子克隆工具酶

1、分子克隆工具酶 The enzymes in the molecular cloning Chapter 7 Chapter7 分子克隆工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶(特異性切割) 甲基化酶(DNA分子的甲基化) DNA聚合酶(合成DNA) 其他分子克隆工具酶(細(xì)胞破壁、 核酸純化等) 第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶 1.限制與修飾現(xiàn)象 限制酶的發(fā)現(xiàn) 命名： 宿主屬名第一個字母(大寫) + 種名頭兩個字母(小寫) + 菌株號 + 羅馬序號 一、限制與修飾 the 1st such enzyme found Escherichia coli Species category R13 strain How to

2、name a restriction endonuclease? EcoRI 限制性內(nèi)切核酸酶的命名 名 稱 屬名 種名 株名 序數(shù) 來源菌株 EcoRI E co R I Escherichia coli R HindIII H in d III Haemophilus influenzae HindII H in d II Haemophilus influenzae HindI H in d I Haemophilus influenzae REBASE(The Restriction Enzyme Database) New England Biolabs 限制與修飾系統(tǒng)的種類 II（

3、93%）I（1%）III（1%） 酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶 分子不在一起 三亞基雙功 能酶 二亞基雙功 能酶 識別位點4-6bp，大多數(shù)回 文對稱 二分非對稱5-7bp非對 稱 切割位點在識別位點中或靠 近識別位點 無特異性， 在識別位點 外1000bp 在識別位點 下游24- 26bp 限制反應(yīng)與 甲基化反應(yīng) 分開的反應(yīng)互斥同時競爭 限制反應(yīng)是 否需要ATP 否是是 5內(nèi)切酶 3內(nèi)切酶 ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口, 缺口, 斷口 缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut) 3HO P53HO P5 1、限制酶識別序列的長度 一般4-8bp，常見6bp ，當(dāng)識別序列為4或者 6bp時，他們可

4、識別的序列在完全隨機的情況下， 平均每44=256和46=4096bp中會出現(xiàn)一個識別 位點。 2、限制酶識別序列的結(jié)構(gòu) 一般為回文對稱結(jié)構(gòu) EcoRI：G AATTC CTTAA G 3、限制酶切割的位置：大多在內(nèi)部，也有在外部 二、限制酶識別的序列 nConsider a linear DNA molecule with 6 copies of GAATTC: nit will be cut into 7 fragments which could be separated by the gel electrophoresis. (The largest fragment) (The sm

5、allest fragment) digestion of a DNA fragment with endonuclease EcoRI A given molecule will generate a characteristic series of pattern when digested with a set of different enzymes. e.g. the combination of EcoRI + HindIII Use of multiple REs allows different regions of a DNA molecule to be isolated

6、1、匹配黏端(matched end) 識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的末端為匹配 黏端(黏性末端，cohesive end)，形成的兩個末 端是相同的，也是互補的。 2、平末端(Blunt end) 在回文對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn) 生平末端。 三、限制酶切割產(chǎn)生的末端 (1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different. (2)Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus

7、 the frequencies differ. Differences of REs (3) Restriction enzymes differ in : blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端). (4) Restriction enzymes differ in the . Differences of REs sticky ends (粘性末端) blunt ends (平末端) Recognition sequences and cut sites of various endonucleases Cleavage o

8、f an EcoRI site. The 5 protruding ends are said to be “sticky” because they readily anneal through base-pairing to DNA molecules cut with the same enzyme 許多限制酶切割DNA產(chǎn)生非對稱突出端。當(dāng)識別 序列為非對稱序列時，切割的DNA產(chǎn)物的末端 是不同的，如BbvC，它的識別切割位點 CCTCAGC GGAGTCG 有些限制酶識別簡并序列，其識別的序列中有幾 種是非對稱的。如Acc，它的識別切割位點如 下，GTAT/CGAC CATA/GCTG

9、 3、非對稱突出末端 (1)同序同切酶 這些酶識別序列和切割位置都相同。 Hind與Hinc 識別切割位點為 GTYRAC (Y為C或T，R為A或G) Hpa與 Hap 識別切割位點為 CCGG Mob與 Sau3A識別切割位點為 GATC 4、同裂酶(isoschizomer)：識別相同序列的 限制酶稱為同裂酶，但切割位點可能不同。 (2)同序異切酶 Kpn 和 Acc65 識別的序列是相同的，但它 們的切割位點不同，分別為： Kpn： GGTACC Acc65： GGTACC 4、同裂酶(isoschizomer) (3)“同功多位” 許多識別簡并序列的限制酶包 含了另一種限制酶的功能。

10、如 EcoR識別和切割位點為 GAATTC Apo 識別和切割位點為 RAATTY 后者可識別前者的序列。 4、同裂酶(isoschizomer) (4)其它有些限制酶識別的序列有交叉。 如在 pUC 系列質(zhì)粒的多克隆位點中有一個 Sal位點（識別切割位點為 GTCGAC），該位 點也可被 Acc位點（識別切割位點為 GTMKAC）和 Hinc位點（識別切割位點為GTYRAC）切割。 4、同裂酶(isoschizomer) 5、同尾酶(isocaudarner) 不同的 限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的， 且是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的黏性末端。 BamH I : G GATCC Bgl I

11、I : A GATCT 6、歸位內(nèi)切酶(homing endonuclease) 內(nèi)含子編碼的內(nèi)切酶。 1、限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別 序列有長度的要求。 2、酶單位：在適合的緩沖液及溫度下，在20l 反應(yīng)體系中反應(yīng)1h，使1gDNA完全消化所需 要的酶量。 3、在設(shè)計PCR引物時，如果要在末端引入酶切位 點，就需要考慮加上一些滿足酶切要求的堿基 數(shù)目。 四、DNA末端長度對限制酶切割的影響 對同一底物中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，導(dǎo) 致其對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同 的切割效率。 1、酶切位點對酶的敏感性不同， 2、在切割相同量的不同DNA時所需要的酶量是不 同的。 五

12、、位點偏愛(site preference) 緩沖液：pH、Mg2+、DTT、BSA 反應(yīng)溫度：大多數(shù)37 反應(yīng)時間：1-2h 終止酶切的方法：EDTA、加熱、苯酚抽提 去除蛋白、試劑盒純化DNA。 六、酶切反應(yīng)條件 在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相 似的序列。 1、引起星星活性的因素：甘油濃度過高，酶過量， 離子強度低，pH過高等。 2、抑制方法：減少甘油濃度，減少酶的用量，提 高離子強度，降低pH，保證反應(yīng)體系無有機溶 劑等。 七、星星活性(star activity) l 部分切割雙鏈DNA的酶也可以消化單鏈，但切 割效率不同或降低。 l 某些限制酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈

13、，產(chǎn)生 單鏈缺口，即切口酶，命名時在前面加上一個N。 八、單鏈DNA的切割 1、將產(chǎn)生的5突出末端補平后，再連接可產(chǎn)生新 的酶切位點。 2、同尾末端的連接：不同的同尾酶切割DNA產(chǎn)生 的末端再相互連接時，可產(chǎn)生新的酶切位點， 同時原來的酶切位點消失。 3、平末端連接產(chǎn)生新的酶切位點 Pvu II (CAGCTG) +EcoR V (GATATC) Mbo I: GATC 九、酶切位點的引入 1、外部因素(可預(yù)見和控制) 反應(yīng)條件、底物純度、酶量、反應(yīng)體積、反應(yīng)時 間等 2、內(nèi)部因素 星星活性、底物甲基化和底物的構(gòu)象(切割線性 DNA和超螺旋DNA的活性差異) 十、影響酶活性的因素 第二節(jié) 甲基

14、化酶 1、Dam甲基化酶 在GATC序列中的腺嘌呤N6位置引入甲基。 某些限制酶的識別位點含GATC序列，對Dam甲基 化的DNA敏感，不能切割相應(yīng)的序列。 一般哺乳動物DNA不會在腺嘌呤N6上甲基化，因 此不受影響。 當(dāng)需要在這些敏感位點完全切割DNA時，可利用 dam型E.coli擴增并提取DNA。 一、甲基化酶的種類(methylase) 2、Dcm甲基化酶。識別CCAGG或CCTGG序列， 在第二個胞嘧啶C的C5位置引入甲基。受Dcm甲 基化作用影響的酶有EcoRII (CCWGG)，但其 同裂酶不受影響，因其切點不同。 3、EcoK I甲基化酶，其識別位點少，識別 AAC(N)6GT

15、GC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6 位置。 4、Sss I甲基化酶，來源于原核螺原體，可使CG 序列中的C在C5位置上甲基化。 一、甲基化酶的種類(methylase) 二、依賴于甲基化的限制系統(tǒng) 1、E.coli：McrA，McrBC和Mrr，識別序列不同， 但只識別經(jīng)過甲基化的序列，都限制由CG甲基 化酶(M.SssI)作用的DNA。 McrA：限制HpaII甲基化修飾的位點。 McrBC：限制兩套半位點(G/A) m5C。 Mrr：限制m6A。 三、甲基化對限制酶酶切的影響 修飾酶切位點 主要使酶切位點甲基化，而不受限制性核酸內(nèi)切酶 的切割。 2.產(chǎn)生新的酶切位點 有些酶是依賴甲

16、基化的限制酶，因此甲基化后可產(chǎn) 生新的酶切位點。 第三節(jié) DNA聚合酶 DNA polymerase主要功能：催化 DNA的合成 l 真核生物五種： 、 l 原核生物三種： DNA聚合酶I,II和III 1、活性：大腸桿菌DNA聚合酶I為單鏈多肽，相 對分子質(zhì)量為109103，有三種活性：53 DNA聚合酶活性，53 外切核酸酶活性，3 5 外切核酸酶活性。 交換反應(yīng)：如果只有一種dNTP存在，3 5外切 核酸酶活性將從3-OH端降解DNA，然后在該 位置發(fā)生一系列連續(xù)的合成和外切反應(yīng)，直到 露出與該dNTP互補的堿基。 一、大腸桿菌聚合酶I (1)利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53外切核酸 酶

17、活性，可用切口平移法標(biāo)記DNA，用作雜 交探針。 方法：在Mg2存在下用DNaseI處理雙鏈DNA 模板，產(chǎn)生少量切口，在切口處，利用DNA 聚合酶I的53外切核酸酶活性使切口沿5 3平移，同時產(chǎn)生的切口可作為DNA聚合 酶I催化合成DNA的引物。合成過程中，標(biāo) 記的dNTP不斷加入到DNA鏈上，可作為雜 交探針。 2、大腸桿菌DNA聚合酶I的用途 (2)用于cDNA克隆中第二鏈合成 利用聚合酶活性。但已被淘汰，改用Klenow酶或 反轉(zhuǎn)錄酶。 (3)對3突出末端的DNA作末端標(biāo)記 利用交換反應(yīng)?，F(xiàn)改用T4或T7 DNA聚合酶。 2、大腸桿菌DNA聚合酶I的用途 二、Klenow DNA聚合酶

18、 是大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)蛋白酶裂解后， 從全酶中除去53外切酶活性的肽段 后的大片段肽段，其聚合活性和35 外切酶活性不受影響，相對分子質(zhì)量為 76103。 可利用基因工程生產(chǎn)。 (1)補平DNA的3凹端。(利用DNA聚合酶活性，要 加足夠的dNTP，如帶標(biāo)記，則可進行末端標(biāo) 記) (2)抹平DNA的3凸端。(3-5外切核酸酶活性，切 除3凸端，要加足夠的dNTP。T4和T7 DNA 聚合酶可替代) (3)通過置換反應(yīng)對DNA進行末端標(biāo)記 (4)隨機引物標(biāo)記(聚合酶活性) (5)其他用途，如測序，cDNA合成第二鏈。 Klenow DNA聚合酶作用 三、T4噬菌體 DNA聚合酶 T4 ph

19、age DNA polymerase來源于T4噬 菌體感染的大腸桿菌， 相對分子質(zhì)量為114103，活性與Klenow DNA聚合酶相似， 但其35外切核酸酶活性強200倍，且不 從單鏈DNA模板上替換引物，常用于誘 變反應(yīng)。 四、T7噬菌體 DNA聚合酶 來源于T7噬菌體感染的大腸桿菌，是由兩種緊密 結(jié)合的蛋白質(zhì)形成的復(fù)合體，一種是噬菌體基 因5編碼的蛋白，另一個是宿主細(xì)胞的硫氧還 原蛋白。 活性與T4噬菌體DNA聚合酶和Klenow DNA聚合 酶相似，但其35外切核酸酶活性為Klenow DNA聚合酶1000倍，可替代T4噬菌體DNA 聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。 五、耐熱 DNA

20、聚合酶 在高溫下具有活性的DNA聚合酶，來自嗜 高溫的細(xì)菌，主要用于PCR反應(yīng)。 Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶。 六、反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 依賴于RNA的DNA聚合酶， 有53合成DNA活性， 無35外切酶活性。 來自AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒) 和Mo-MLV (Moloney鼠白血病病毒，又稱 M-MuLV)。 具有53聚合酶活性和很強的RNase H活性(特 異性水解DNA:RNA雜交鏈上RNA鏈的磷酸 二酯鍵，產(chǎn)生5核苷酸，該酶對單鏈的核酸、 雙鏈DNA或雙鏈RNA沒有作用

21、)。 cDNA合成起始：引物和mRNA模板雜交體可成 為RNase H的底物，模板的降解和cDNA的 合成相競爭。 反應(yīng)終止:RNase H可在正在增長的 DNA3端 切割模板，抑制cDNA的合成。 AMV反轉(zhuǎn)錄酶 RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV)反轉(zhuǎn)錄酶是一種RNA介導(dǎo)的 DNA聚合酶。 該酶能以RNA(合成cDNA時)或單鏈DNA 做模板由引物起始合成一個互補的DNA 鏈。RNase H活性的缺失增強了該酶合 成長鏈cDNAs的能力。 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄酶的活性 3DNA聚合酶活性(需Mg2+)，即以RNA 或DNA為模板及帶3-OH的RNA或DNA引物

22、 合成DNA。 53和35外切核酸酶活性，產(chǎn)生含5磷 酸及3-OH的長420個堿基的核苷酸。 無35外切核酸酶校正作用，在高濃度 dNTP等條件下每500個堿基會有一個錯誤的 摻入。 七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminal ransferase) 來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期 的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種DNA聚合酶，不依賴 于模板的DNA聚合酶。 在2價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于 DNA分子的3-OH端。若dNTP為T或C，首選 Co2，若dNTP為A或G，首選Mg2。 可在cDNA或載體的3末端加同聚尾，便于克隆， 也可用標(biāo)記的rNTP、dNTP或ddNTP來標(biāo)記 DNA

23、片段的3末端。 第四節(jié) 其他分子克隆工具酶 包括：SP6噬菌體RNA聚合酶、T4噬菌體RNA聚 合酶、T7噬菌體RNA聚合酶。 活性：識別DNA中各自特異的啟動子序列，并沿此 DNA模板起始RNA的合成，無需引物。 用途：體外合成RNA分子，表達外源基因。 一、依賴于DNA的RNA聚合酶 二、連接酶(ligase) 1.T4 DNA連接酶 催化DNA5磷酸基與3羥基形成磷酸二酯鍵， 反應(yīng)底物為黏端、切口、平末端的RNA 或者DNA。 2.大腸桿菌DNA連接酶 需NAD+的參與，作cDNA克隆時，不會將 RNA連接到DNA，不連接RNA。 3.Taq DNA連接酶 在兩個核苷酸之間進行連接反應(yīng)，

24、同時必須 與另一DNA鏈形成雜交體，相當(dāng)于連接 雙鏈DNA中的缺口，作用在45-65， 需NAD+,主要用于在PCR擴增中引入寡 核苷酸。 二、連接酶(ligase) 4.T4 RNA連接酶 可以催化單鏈DNA或RNA的5磷酸與另一 單鏈DNA或RNA的3羥基形成共價連接， 用于標(biāo)記RNA的3末端、單鏈DNA或 RNA的連接等。 二、連接酶(ligase) 三、T4多核苷酸激酶 T4 polynucleotide kinase 是一種磷酸化酶，可 將ATP的-磷酸基團轉(zhuǎn)移至DNA或者RNA的 5末端: 1.正反應(yīng)：將ATP的-磷酸基團轉(zhuǎn)移至無磷酸的 DNA的5末端，用于對缺乏5磷酸的DNA進 行磷酸化。 2.交換反應(yīng)：在過量ATP存在的情況下，將DNA 的5端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP,然后DNA從ATP上獲 得-磷酸而重新磷酸化。 四