產(chǎn)纖溶酶菌株的分離篩選

1、產(chǎn)纖溶酶菌株的分離篩選 第31卷第1期2008年1月 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 JOURNALOFAGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI ? Vol.31No.1Jan.2008 文章編號:1000-1573(2008)01-0056-04 ? 產(chǎn)纖溶酶菌株的分離篩選 鄭麗偉,?于宏偉,?賈英民 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定071001) 摘要:以脫脂奶粉作為初篩底物,纖維蛋白作為復(fù)篩底物,透明圈作為篩選標記,從肉聯(lián)廠,污水溝等地篩選出產(chǎn)纖溶酶的菌株40株,從中篩選出產(chǎn)酶活力最高的2號菌株,將其編號為ZLW-2,并采用改進的紫外分光光度法測酶活,提高了酶活測定的精確性,對提

2、高纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選效率有重要意義。菌株ZLW-2的發(fā)酵過程研究表明,纖溶酶是在菌體大量生長以后酶活力才開始增加。關(guān)?鍵?詞:纖溶酶;菌株;篩選中圖分類號:Q933 文獻標識碼:A Screeningoffibrinolyticenzyme?producingstrain ZHENGLi?wei,YUHong?wei,JIAYing?min (CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China) Abstract:Fortyfibrinolyticenzyme?producing

3、strainswereisolatedfromshambles,sewagefarmandsoon,usingthesolublecircleasscreeningmarker.Thebasalmediumwithskimmilkwasusedasthefirstscreeningmediumandthefibrinpowderwasusedasthesecondscreeningmedium.Strain2 whichhadthehighestfibrinolyticenzymewaschosenandnumberedZLW-2.Moreover,themethodofmeasuringen

4、zymeactivitywasrenovatedandthecurveofenzymeproductionwasprimar?ilystudied.Ultravioletphotometrywasadoptedtomeasureenzymaticactivityintheexperiment,whichhadimprovedaccuracyofthemeasurementandhadgreatsignificanceforimprovingefficiencyofscreeningstrainsproducingfibrinolyticenzyme.Thefermentationprocess

5、ofZLW-2indicatedthattheactivityoffibrinolyticenzymeincreasedaftermassgrowthofthali.Keywords:fibrinolyticenzyme;strain;screening?血栓栓塞性疾病是涉及到血液和循環(huán)系統(tǒng)的一種疾病,其致殘率和致死率均比較高1。纖維蛋白是血栓的主要成分,纖溶酶原在纖溶酶原活化素等物質(zhì)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶。纖溶酶是一種蛋白水解酶,可以水解纖維蛋白原和纖溶蛋白,使非纖溶蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄运槠?即血栓溶解2-3。目前使用的血栓溶解劑(尿激酶、蚓激酶、蛇激酶)均為針劑,從動物體提取,周期長,提取成本高

6、,價格昂貴,而且都有過敏反應(yīng)或血管出血現(xiàn)象,使其應(yīng)用受到限制。 ? 應(yīng)用微生物技術(shù)生產(chǎn)溶栓酶具有周期短、產(chǎn)量高、生產(chǎn)工藝簡單、成本低等特點,是生物醫(yī)藥發(fā)展的一個重要方向4。微生物來源的纖溶酶一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點,目前己經(jīng)有很多研究學(xué)者分別從枯草芽孢桿菌5、根霉6、鏈霉菌7、脈胞霉8中發(fā)現(xiàn)了纖溶酶。本研究是從肉聯(lián)廠,污水溝等地附近的土壤中分離篩選出纖溶酶產(chǎn)生菌,對酶活力的測定方法進行了改進,并對其生長發(fā)酵曲線進行了初步研究,為今后開發(fā)新的纖溶酶提供理論基礎(chǔ)。 收稿日期:2007-03-26 基金項目:河北省 十一五!科技攻關(guān)項目 農(nóng)產(chǎn)品精深加工用主要微生物菌種培育及菌種資源庫建設(shè)(0622

7、0106D)!作者簡介:鄭麗偉(1980-),女,河北徐水人,在讀碩士生,從事酶工程技術(shù)及其應(yīng)用的研究. :(),(), ?第1期?鄭麗偉等:產(chǎn)纖溶酶菌株的分離篩選 57 1?材料與方法 1.1?主要試劑和儀器 牛血纖維蛋白原、凝血酶:Sigma公司;酪氨酸:第二軍醫(yī)大學(xué)政翔化學(xué)試劑研究所;伊利脫脂奶粉:內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司;PHS-3C精密酸度計:上海理達儀器廠;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器:上海智城分析儀器制造有限公司;SP-756P紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司;GL-20G-?型高速冷凍離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1真空冷凍干燥機:北京博醫(yī)康技術(shù)公司;I

8、KAT18basic均質(zhì)分散機:廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司。1.2?樣品來源 河北、遼寧、吉林、四川等地肉聯(lián)廠,污水溝附近的土樣。1.3?培養(yǎng)基 1.3.1?富集培養(yǎng)基?2%血粉,1%蛋白胨,0?5%NaCl,0?1%牛肉膏,pH7?2,110#滅菌15min。? 1.3.2?初篩培養(yǎng)基?1%脫脂奶粉,0?2%Na2HPO4?12H2O,0?5%NaCl,2%瓊脂,pH7?2,110#滅菌15min。 1.3.3?復(fù)篩纖維蛋白平板的制備?血纖維蛋白的提取:取新鮮豬血,4#冷藏13h,待產(chǎn)生凝塊后,加入去離子水,打碎,8000r/min離心10min,去上清,反復(fù)勻漿、離心、洗滌,直至沉淀物為白

9、色,再經(jīng)冷凍干燥,研磨粉碎,得細粉狀纖維蛋白9。%初次復(fù)篩纖維蛋白培養(yǎng)基:1%葡萄糖,0?629%自制纖維蛋白,1?8%瓊脂,pH7?0,110#滅菌15min。&二次復(fù)篩纖維蛋白培養(yǎng)基:0?629%自制纖維蛋白,1?8%瓊脂,110#滅菌15min。 1.3.4?菌種傳代保藏培養(yǎng)基?1%蛋白胨,0?5%牛肉膏,0?5%NaCl,1?5%瓊脂,pH7?27?4,121#滅菌15min。 1.3.5?種子培養(yǎng)基?1%胰蛋白胨,2%葡萄糖,0?1%Na2HPO4?12H2O,0?1%NaH2PO4?2H2O,0?05%MgSO4?7H2O,pH7?07?2,121#滅菌15min。 1.3

10、.6?發(fā)酵培養(yǎng)基?2%葡萄糖,2%胰蛋白胨,0?3%酵母膏,0?1%Na2HPO4?12H2O,0?1%NaH2PO4?2H2O,0?05%MgSO4?7H2O,pH7?07?2,121#滅菌15min。 1.3.7?血瓊脂平板的制備?0?3%酵母膏,1%蛋 5%Na醇,0?175?mol/L結(jié)晶紫,1?5%瓊脂。配制方法:采用文獻10中的方法。1.4?試驗方法 1.4.1?產(chǎn)胞外纖溶酶菌株的篩選方法?取1g樣品,適當稀釋,進行富集培養(yǎng),10倍梯度稀釋后涂布于奶粉瓊脂平板進行初篩。37#培養(yǎng)72h后,挑取透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌落點植于初次復(fù)篩平板,37#培養(yǎng)72h,將產(chǎn)透明圈較大的單

11、菌落進行記錄并保存。再將初次復(fù)篩獲得的菌株進行搖瓶發(fā)酵二次復(fù)篩,測定發(fā)酵液的酶活力10-11 。 1.4.2?改進的紫外分光光度法測定纖溶酶的活性?分別取4mL水溶性纖維蛋白原溶液,加入1mL凝血酶,37#保溫10min,再將1mL酶液加入混合物中,反應(yīng)時間60min后,加入2mL0?4mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物離心,在280nm處測定吸光值,以加滅活酶液的反應(yīng)系統(tǒng)作為對照。在此反應(yīng)條件下定義:每分鐘生成1?g酪氨酸所需酶量定義為一個酶活(1U)。 圖1?酪氨酸標準曲線 Fig.1?Standardcurveoftyrosine 1.4.3?血瓊脂平板實驗?取30?L離心后的發(fā)

12、酵上清液,接入到血平板的小孔中,37#孵育7d,觀察結(jié)果。 1.4.4?生長曲線及發(fā)酵曲線的測定方法?將菌株ZLW-2接種新鮮種子培養(yǎng)基中于37#,200r/min搖床培養(yǎng)每隔2h取樣,測其600nm波長處的吸光值。以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標制作生長曲線。將菌株ZLW-2的培養(yǎng)8h后,種子液按2%的接種量轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,32#200r/min培養(yǎng),每隔4h取發(fā)酵液,通過測定其pH值、OD600及酶活力,來測定其發(fā)酵過程,為進一步進行產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。 2?結(jié)果與分析 ?58? 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第31卷 2.1.1?產(chǎn)酶菌株的初次復(fù)篩?樣品在初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得128株產(chǎn)

13、蛋白酶的菌株,將初篩獲得菌株進行初次復(fù)篩,獲得產(chǎn)具有纖溶活力酶的菌株40 株。菌株在初次復(fù)篩纖維蛋白平板中37#保溫72h后,測定的菌落直徑和透明圈直徑如表1。 表1?40株菌產(chǎn)纖溶酶活力 Table1?Fibrinolyticactivityfrom40strains 菌株Strains1234567891011121314151617181920 菌落直徑D1/cm Diameterofcolony0.8030.5500.7510.8400.9070.5892.4802.6031.0661.9430.8450.8551.0811.2020.7710.8391.3241.6291.9471.

14、232 透明圈直徑D2/cm Diameterofclaritycircle1.3611.3411.2071.0511.1550.7422.6792.7361.5972.6231.2191.3231.5211.8141.3381.9212.0661.9192.1791.506 D2/D11.6952.4381.6071.2511.2731.2601.2801.0511.4981.3501.4431.5471.4071.5321.7352.2901.5601.1781.1191.222 菌株Strains2122232425262728293031323334353637383940 菌落直徑D

15、1/cm Diameterofcolony1.7630.8630.8731.4931.1900.3092.6590.9151.2141.0951.2872.9472.4180.9030.8640.8471.0381.4040.8511.377 透明圈直徑D2/cm Diameterofclaritycircle2.0651.5541.1271.7231.5100.4662.8211.9191.5621.6341.8383.1602.6121.3481.4721.3911.3511.6611.9801.625 D2/D11.1711.8011.2911.1541.2691.5081.0612.0

16、971.2871.4921.4281.0731.0791.4931.7261.6421.3011.1832.3271.180 ?由表1可以看出,1、2、3、9、12、14、15、16、17、22、26、28、30、34、35、36、31、39號菌株所產(chǎn)的透明圈較大。由于菌株產(chǎn)透明圈的大小并不能完全代表菌株的產(chǎn)酶能力,所以液體發(fā)酵二次復(fù)篩必不可少。2.1.2?產(chǎn)酶菌株的二次復(fù)篩?菌株在二次復(fù)篩纖維蛋白平板中37#保溫72h后,測定的透明圈直徑如表2。從表2可以看出,1、2、15、16、22、28、35、39號菌株所產(chǎn)的酶活力較高,需進一步精確測定酶活力,以確定酶活力最高的菌株。 表2?不同菌株產(chǎn)

17、酶比較 Table2?Fibrinolyticactivityconstractofdifferentstrains菌株Strains12391214151617 透明圈直徑/cmDiameterofclaritycircle1.5281.7121.3551.3131.3511.3211.5651.6451.350 菌株Strains222628303134353639 透明圈直徑/cmDiameterofclaritycircle1.5731.3311.5731.2501.2381.2411.2571.4131.730 2.2?菌株的確定 對1、2、15、16、22、28、35、39號菌株產(chǎn)

18、纖溶酶的活力采用改進的紫外分光光度法進行了精確測定,結(jié)果見表3。通過本次試驗,從中篩選出1株產(chǎn)纖溶酶較高的2號菌株,其最高酶活力為58U,并將其編號為ZLW-2。通過血平板試驗來確定菌株ZLW-2是否安全,觀察發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生溶血現(xiàn)象,可以初步認定為安全菌株。 表3?不同菌株產(chǎn)酶比較 Table3?Fibrinolyticactivityconstractofdifferentstrains菌株Strains121516 酶活/(U?mL-1)Enzymeactivity 36.94 58.4337.8249.91 菌株Strains22283539 酶活/(U?mL-1)Enzymeactivi

19、ty 39.26 45.7137.6253.14 2.3?菌株ZLW-2的生長曲線 菌株ZLW-2在種子培養(yǎng)基中的生長情況如圖2所示。從圖2中可以看出,培養(yǎng)8h后,菌株ZLW-2生長進入對數(shù)末期,因而采用對數(shù)生長末期即培養(yǎng)時間8h的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基為好。 ?第1期?鄭麗偉等:產(chǎn)纖溶酶菌株的分離篩選 59 長,且由于制備平板時所用的試劑或尿激酶標準品不同,所得的結(jié)果可比性差。本試驗采用改進的紫外分光光度法測酶活,提高了測定酶活力的精確性,對提高纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選效率有重要意義。參考文獻: 1?木內(nèi)斡,鈴木英.也高活性纖溶酶納豆開發(fā)的現(xiàn)狀 圖2?ZLW-2生長曲線Fig.2?Growthcur

20、veofZLW-2 J.食品科學(xué),1991,33(6):85-87. 2?王光利.芽胞桿菌纖溶酶的純化、性質(zhì)及其發(fā)酵條件 的研究D.重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué),2001. 3?王中樞.纖溶蛋白溶解的生物化學(xué)M.北京:科學(xué)出 版社,1991:12?57,155-166. 4?FujitaM,NoumuraK,HongK,etal.Purificationand characterizationofastrongfibrinolyticenzyme(Nattok?inase)inthevegetablecheesenatto,apopularsoybeanfermentedfoodinJapanJ.Bio

21、chemBiophyResCom?mun,1993,197(3):1340-1346. 5?焦?jié)?霍烽.源于枯學(xué)溶栓酶的研究進展J.科研動 態(tài),2003(4):43-45. 6?路福平,杜連祥,杜冰,等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的 研究J.天津輕工業(yè)學(xué)院報,1999(1):5-9. 7?王駿,王敏,王以光.鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶的純化 和性質(zhì)的研究J.生物工程學(xué)報,1999(4):147-152. 8?許愛清,劉曉蘭,吳耘紅,等.高產(chǎn)纖溶酶的脈胞霉誘變 育種研究J.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報,2003,19(4):5-7.9?齊海萍,錢和,王璋,等.高活性豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌出 發(fā)菌株的篩選J.中國調(diào)味品,2004,2(2):12-15. 10?張自強.豆豉纖溶酶高產(chǎn)菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的研 究D.南寧:廣西大學(xué),2005. 11?AstrupT,MullertzS.Thefibrinplatemethodforthe estimationoffibrinolyticactivityJ.ArchBiochemBio? 圖3?ZLW-2發(fā)酵曲線 Fig.3?FermentationcurveofZLW-2 phs,1952,40:346-348. 12?孫月娥,錢和.豆豉纖溶酶生產(chǎn)菌液體發(fā)酵條件的優(yōu) 化J.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,