臨床血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)：4實(shí)驗(yàn)四 POXandPAS-

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 過氧化物酶染色（過氧化物酶染色（POX） 過碘酸過碘酸-雪夫反應(yīng)（雪夫反應(yīng)（PAS） 實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 請(qǐng)問：請(qǐng)問： 以上都是什么細(xì)胞？以上都是什么細(xì)胞？ 化學(xué)染色 細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞化學(xué)染色Cytochemical Staining 實(shí)質(zhì)是原位顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，對(duì)各種化學(xué)成 分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于急性白血病鑒別，血液病輔助診斷、鑒別 診斷、療效觀察和預(yù)后判斷及發(fā)病機(jī)制探討。 細(xì)胞化學(xué)染色包括三個(gè)步驟： 固 定 有色沉淀 反應(yīng) 復(fù)染 過氧化物酶染色過氧化物酶染色 Peroxidase Staining （POX） 過碘酸雪夫反應(yīng)（糖原染色過碘酸雪夫反應(yīng)（

2、糖原染色) ) Periodic Acid-Schiff (PAS) reaction 酯酶染色、堿性磷酸酸染色、鐵染色酯酶染色、堿性磷酸酸染色、鐵染色 過氧化物酶染色（過氧化物酶染色（POX） 原理：原理： POXPOX分解分解H H2 2O O2 2 ，產(chǎn)生新生態(tài)氧，使底物氧化，變?yōu)橛?，產(chǎn)生新生態(tài)氧，使底物氧化，變?yōu)橛?色染料沉積。色染料沉積。 POXPOX存在于存在于粒細(xì)胞、部分單核細(xì)胞粒細(xì)胞、部分單核細(xì)胞胞漿胞漿內(nèi)。內(nèi)。 細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能將無色的二氨基聯(lián)苯胺的氫原子轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能將無色的二氨基聯(lián)苯胺的氫原子轉(zhuǎn) 移給移給H2O2 ，釋放新生氧，使前者變?yōu)橛猩玖希ㄗ攸S色或，

3、釋放新生氧，使前者變?yōu)橛猩玖希ㄗ攸S色或 藍(lán)黑色）沉積在細(xì)胞質(zhì)酶所在部位。藍(lán)黑色）沉積在細(xì)胞質(zhì)酶所在部位。 組成組成主要成份主要成份 聯(lián)苯胺液（聯(lián)苯胺液（A）聯(lián)苯胺聯(lián)苯胺 H2O2液（液（B）H2O2 瑞姬氏染液（瑞姬氏染液（C）瑞姬氏染料瑞姬氏染料 磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（D）磷酸鹽磷酸鹽 二氨基聯(lián)苯胺法（二氨基聯(lián)苯胺法（DAB ） 國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSHICSH）推薦法）推薦法 二二 氨氨 基基 聯(lián)聯(lián) 苯苯 胺胺 法法 注意：所用染液覆蓋血膜即可，不要浪費(fèi)注意：所用染液覆蓋血膜即可，不要浪費(fèi) 10 min 新鮮涂片新鮮涂片 A A液液聯(lián)苯胺溶液聯(lián)苯胺溶

4、液3 3滴（覆蓋標(biāo)本即可）滴（覆蓋標(biāo)本即可） B B液液等量等量H2O2溶液溶液3 3滴滴, ,吹勻吹勻 流水沖洗流水沖洗2min2min，甩干，甩干， 水洗，待干，鏡檢水洗，待干，鏡檢 滴加滴加C液液3滴，滴，D液液6滴混勻滴混勻 然后然后 min 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) （1 1）標(biāo)本要新鮮）標(biāo)本要新鮮 （2 2）使用前，試劑平衡至室溫，用前搖勻。）使用前，試劑平衡至室溫，用前搖勻。 （3 3）用后要蓋好，防止揮發(fā)）用后要蓋好，防止揮發(fā) （4 4）加試劑要充分混勻，使染色均勻）加試劑要充分混勻，使染色均勻 結(jié)果判斷結(jié)果判斷（100100） 陽性：陽性：胞漿中出現(xiàn)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或藍(lán)黑色棕黃色或藍(lán)

5、黑色顆粒顆粒 （）無顆粒沉著）無顆粒沉著 （） 顆粒細(xì)小，分布稀疏顆粒細(xì)小，分布稀疏 （+）顆粒較粗，常呈局灶性分布，）顆粒較粗，常呈局灶性分布，1/4 （+）顆粒粗大，彌散分布，）顆粒粗大，彌散分布，1/2 （+）顆粒粗大，均勻分布或聚集，）顆粒粗大，均勻分布或聚集，3/4 （+）顆粒布滿細(xì)胞，可覆蓋胞核）顆粒布滿細(xì)胞，可覆蓋胞核 正常血細(xì)胞正常血細(xì)胞POX染色染色 1.粒細(xì)胞系統(tǒng)：早幼粒以下階段細(xì)胞均為粒細(xì)胞系統(tǒng)：早幼粒以下階段細(xì)胞均為陽性（粗陽性（粗 大）大），且細(xì)胞成熟逐漸加強(qiáng)，嗜酸粒細(xì)胞且細(xì)胞成熟逐漸加強(qiáng)，嗜酸粒細(xì)胞陽性最強(qiáng)陽性最強(qiáng) 2. 單核細(xì)胞內(nèi)單核細(xì)胞內(nèi)POX呈弱陽性（呈弱陽性

6、（顆粒細(xì)小疏松、彌散性顆粒細(xì)小疏松、彌散性 分布分布）。）。 3.正常人淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、漿細(xì)胞、成正常人淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、漿細(xì)胞、成 熟嗜堿性粒細(xì)胞，均無熟嗜堿性粒細(xì)胞，均無POX； 1.1.輔助鑒別急性白血病的類型，首選、最重要化學(xué)染輔助鑒別急性白血病的類型，首選、最重要化學(xué)染 色（觀察白血病細(xì)胞內(nèi)顆粒）色（觀察白血病細(xì)胞內(nèi)顆粒） 急性粒細(xì)胞白血病急性粒細(xì)胞白血病 AMLAML（+ +） 急性淋巴細(xì)胞白血病急性淋巴細(xì)胞白血病 ALLALL（- -）( (陽性率陽性率33) ) 急性單核細(xì)胞白血病急性單核細(xì)胞白血病 AMOLAMOL（-/-/） 2. 2. 輔助鑒別急性早

7、幼粒細(xì)胞白血?。ㄝo助鑒別急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL)APL)（強(qiáng)陽（強(qiáng)陽 性）性）、急性單核細(xì)胞白血?。?、急性單核細(xì)胞白血病（AMOL)AMOL)（弱陽性）（弱陽性）、 惡性組織細(xì)胞?。◥盒越M織細(xì)胞病（MH)MH)（陰性）（陰性） 臨床意義臨床意義 A: APL B: AMML C: AMOL D: ALL 觀察對(duì)象：克隆增生細(xì)胞群觀察對(duì)象：克隆增生細(xì)胞群 過碘酸是一種氧化劑，能使細(xì)胞內(nèi)含有過碘酸是一種氧化劑，能使細(xì)胞內(nèi)含有乙二醇乙二醇 的糖類的糖類氧化產(chǎn)生雙醛基，醛基與氧化產(chǎn)生雙醛基，醛基與schiff試劑中的試劑中的 品紅結(jié)合，形成品紅結(jié)合，形成紫紅色紫紅色化合物，定位于含有多化合物，定

8、位于含有多 糖成分的部位。糖成分的部位。 Periodic Acid-Schiff (PAS) reaction 過碘酸雪夫反應(yīng)（糖原染色）過碘酸雪夫反應(yīng)（糖原染色） 組成組成主要成份主要成份 固定液（固定液（A）甲醛甲醛 高碘酸溶液（高碘酸溶液（B）高碘酸高碘酸 雪夫試劑（雪夫試劑（C）無色品紅無色品紅 甲基綠溶液（甲基綠溶液（D）甲基綠甲基綠 過碘酸雪夫試劑主要組成成份過碘酸雪夫試劑主要組成成份 過過 碘碘 酸酸 雪雪 夫夫 反反 應(yīng)應(yīng) 將干燥血片浸入將干燥血片浸入A A液，固定液，固定6060秒秒 （沖洗，待干）（沖洗，待干） 浸入浸入B B液氧化液氧化10 min10 min， 沖洗，

9、待干沖洗，待干 浸入浸入C液，氧化液，氧化15 min， 沖洗沖洗 ，待干，待干 滴加滴加D D液，復(fù)染液，復(fù)染5min5min 鏡檢鏡檢 沖洗，待干沖洗，待干 浸染 結(jié)果結(jié)果 陽性反應(yīng)：胞質(zhì)內(nèi)陽性反應(yīng)：胞質(zhì)內(nèi)染紅色染紅色或或紫紅色紫紅色，呈彌，呈彌 散狀、顆?；驂K狀。胞核染成散狀、顆粒或塊狀。胞核染成綠色綠色。 PAS反應(yīng)反應(yīng)沉淀顆粒特點(diǎn)沉淀顆粒特點(diǎn) 粒系統(tǒng)粒系統(tǒng)（+ +） 隨著細(xì)胞成熟而加強(qiáng)隨著細(xì)胞成熟而加強(qiáng) 細(xì)顆粒狀或均勻紅色細(xì)顆粒狀或均勻紅色 淋巴系統(tǒng)淋巴系統(tǒng)少數(shù)（少數(shù)（+ +）（）（2020）粗顆粒狀或塊狀粗顆粒狀或塊狀 單核系統(tǒng)單核系統(tǒng)（+ +） 細(xì)顆粒狀細(xì)顆粒狀 紅系紅系（- -

10、） 巨核系巨核系（+ +） 顆粒狀或塊狀顆粒狀或塊狀 正常血細(xì)胞正常血細(xì)胞PAS染色特點(diǎn)染色特點(diǎn) 臨床意義臨床意義 1、鑒別白細(xì)胞疾病的性質(zhì)、鑒別白細(xì)胞疾病的性質(zhì)（白血病細(xì)胞）（白血病細(xì)胞） 淋巴系統(tǒng)惡性增生時(shí)多呈強(qiáng)陽性淋巴系統(tǒng)惡性增生時(shí)多呈強(qiáng)陽性-ALL、CLL、淋巴瘤、淋巴瘤（紅色顆粒或塊狀）（紅色顆?；驂K狀） 急性粒細(xì)胞白血病陽性為：細(xì)顆粒，彌散狀分布。急性粒細(xì)胞白血病陽性為：細(xì)顆粒，彌散狀分布。 急性單核細(xì)胞白血病陽性為：細(xì)顆粒，胞質(zhì)邊緣顆粒較粗大。急性單核細(xì)胞白血病陽性為：細(xì)顆粒，胞質(zhì)邊緣顆粒較粗大。 急性巨核細(xì)胞白血病陽性為：粗顆粒狀、小塊狀或彌散分布。急性巨核細(xì)胞白血病陽性為：粗

11、顆粒狀、小塊狀或彌散分布。 2 2、鑒別紅系增生的性質(zhì)鑒別紅系增生的性質(zhì)（有核紅細(xì)胞）（有核紅細(xì)胞） 紅血病、紅血病、紅白血病紅白血病、MDS為為強(qiáng)陽性強(qiáng)陽性 地中海貧血、地中海貧血、IDA 、巨幼細(xì)胞性貧血巨幼細(xì)胞性貧血、HA 、AA 陰性陰性 3. 3. GaucherGaucher 細(xì)胞細(xì)胞 ：強(qiáng)陽性：強(qiáng)陽性 4. 4. Niemman-pickNiemman-pick 細(xì)胞細(xì)胞 (-/(-/) )（空泡陰性，空泡之間胞質(zhì)為陽性）（空泡陰性，空泡之間胞質(zhì)為陽性） 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1.1.試劑要在室溫試劑要在室溫 2.2.雪夫試劑勿在空氣中暴露過久，否則雪夫試劑勿在空氣中暴露過久，否

12、則 溶液變紅失效溶液變紅失效 3.3.結(jié)果及時(shí)觀察，放置結(jié)果及時(shí)觀察，放置1 1周后逐漸褪色周后逐漸褪色 粒細(xì)胞陽性呈彌散性、細(xì)顆粒狀。粒細(xì)胞陽性呈彌散性、細(xì)顆粒狀。 粒細(xì)胞陽性呈彌散性、細(xì)顆粒狀。粒細(xì)胞陽性呈彌散性、細(xì)顆粒狀。 單核細(xì)胞陽性呈細(xì)顆粒狀，分布邊緣顆粒大。單核細(xì)胞陽性呈細(xì)顆粒狀，分布邊緣顆粒大。 巨核細(xì)胞陽性呈顆粒狀或塊狀。巨核細(xì)胞陽性呈顆粒狀或塊狀。 幼紅細(xì)胞陰性。幼紅細(xì)胞陰性。 CLLALL ALLALL中粗中粗 顆粒散在分布顆粒散在分布 A:紅白血病紅白血病 B:巨幼貧巨幼貧 紅白血病紅白血病 PAS 染色染色 示教示教1101室室 進(jìn)門后從左到右進(jìn)門后從左到右 12345

13、 白細(xì)胞反白細(xì)胞反 應(yīng)性增高應(yīng)性增高 POX染色染色 白細(xì)胞反白細(xì)胞反 應(yīng)性增高應(yīng)性增高 PAS染色染色 急性早幼急性早幼 粒細(xì)胞白粒細(xì)胞白 血病血病 瑞氏染色瑞氏染色 POX PAS 急性單急性單 核細(xì)細(xì)核細(xì)細(xì) 胞白血胞白血 病病 瑞氏染瑞氏染 色色 POX PAS 急淋急淋 瑞氏染色瑞氏染色 POX PAS 骨髓檢查順序：骨髓檢查順序： 1.瑞氏染色發(fā)現(xiàn)異常數(shù)量細(xì)胞（如白血病細(xì)胞）。瑞氏染色發(fā)現(xiàn)異常數(shù)量細(xì)胞（如白血病細(xì)胞）。 2.化學(xué)染色確定異常細(xì)胞歸屬?；瘜W(xué)染色確定異常細(xì)胞歸屬。 3.回到瑞氏染色分類，觀察形態(tài)?；氐饺鹗先旧诸?，觀察形態(tài)。 4.下診斷。下診斷。 實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料與

14、方法 血片或骨髓片血片或骨髓片 病例病例1：反應(yīng)性白細(xì)胞增高（大部分同學(xué)）（觀察正常細(xì)胞）：反應(yīng)性白細(xì)胞增高（大部分同學(xué)）（觀察正常細(xì)胞） 病例病例2：急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血前幾天、：急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血前幾天、 急性單核細(xì)胞白血病（部分同學(xué)）（觀察白血病細(xì)胞）急性單核細(xì)胞白血病（部分同學(xué)）（觀察白血病細(xì)胞） 病例病例3：巨幼貧（部分同學(xué)）（觀察有核紅細(xì)胞）：巨幼貧（部分同學(xué)）（觀察有核紅細(xì)胞） 每人每人2張玻片，分別做張玻片，分別做POX和和PAS 明確需要化學(xué)染色鑒別的目的明確需要化學(xué)染色鑒別的目的細(xì)胞群細(xì)胞群 POX與與PAS化學(xué)染色的原理、正常細(xì)胞特點(diǎn)與臨床化學(xué)染色的原理、正常細(xì)胞特點(diǎn)與臨床 意義。意義。 記錄本次課中記錄本次課中POX和和PAS的細(xì)胞染色結(jié)果。的細(xì)胞染色結(jié)果。 作業(yè)作業(yè) 1 min -10 min 新鮮涂片新鮮涂片 A A聯(lián)苯胺溶液聯(lián)苯胺溶液4-54-5滴滴 B B等量等量H2O2溶液溶液, ,吹勻吹勻 流水沖洗流水沖洗2min2min，待干，待干， 水洗，待干，鏡檢水洗，待干，鏡檢 C:D液（液（1:2）復(fù)染）復(fù)染35 min 注意：所用染液覆蓋血膜即可，不要浪費(fèi)注意：所用染液覆蓋血膜即可，不要浪費(fèi) 將干燥血片浸入將干燥血片浸入A A液