反義cortactin基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定(一)

1、反義 cortactin 基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 （一）作者：許朱定，宋振順，安家澤，李韌，張福琴，竇科峰【關(guān)鍵詞】 ,基因表達(dá)Constructionandidentificationofrecombinanteukaryoticexpressionvectorof humanantisensecorticalactinassociatedproteingene【 Abstract 】 AIM:ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/corta ctincontainingfunctionalregionofh

2、umanantisensecorticalactinassociatedpr oteingene(cortactin),soastoprovideatoolforthefurtherstudyontheimpactofc ortactininhepatocellularcarcinoma(HCC)metastasis.METHODS:TotalRNAwa sextractedbyusingTrizolonestepmethodfromcelllineMHCC97.CDNAwasamp lifiedusingreversetranscriptasepolymerasechainreaction(

3、RTPCR).Productof PCR,amplifiedbybeingtransformedintoE.coliDh5 ,wasinsertedreverselyinto theeukaryoticexpressionvectorafterdigestionandligationusingrestrictionen donucleasesandligase.RESULTS:ThecorrectcortactincDNAclonewasobtaine danditwasconfirmedthatcortactincDNAwasinsertedreverselyintotheeukary ot

4、icexpressionvectorcorrectlyusingPCR,digestionidentificationandsequenci ng.CONCLUSION:TherecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/co rtactinissuccessfullyconstructed. 【 Keywords 】 geneexpression;highlymetastaticHCCcelllineMHCC97;reversetranscriptase polymerasechainreaction;humancorticalactinasso

5、ciatedprotein(cortactin)【摘要】目的：構(gòu)建一個(gè)包含人皮層肌動(dòng)蛋白( cortactin)反義基因的 全部功能區(qū)的重組真核表達(dá)載體 pcDNA3.0/cortactin，為進(jìn)一步研究人 皮層肌動(dòng)蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移影響的研究奠定基礎(chǔ).方法： Trizol試劑法提取體外培養(yǎng)的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 MHCC97 總 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn) 錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( RTPCR)擴(kuò)增目的片段， PCR產(chǎn)物及真核表達(dá)載體 分別雙酶切后進(jìn)行連接， 并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 Ecoli.Dh5 擴(kuò)增以獲得重組 載體.結(jié)果： RTPCR獲得預(yù)期大小的特異性 DNA片段，經(jīng) PCR、雙酶切 鑒定及測(cè)序證實(shí)已將

6、人皮層肌動(dòng)蛋白基因 cDNA 片段正確的反向插入 真核表達(dá)載體中 .結(jié)論：成功獲得反義 pcDNA3.0/cortactin 重組質(zhì)粒 【. 關(guān) 鍵詞】基因表達(dá)；高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞 MHCC97；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；人 皮層肌動(dòng)蛋白 cortactin0 引言原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一 ,其侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù) 發(fā)是患者死亡的主要原因 .目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究逐步深入 . 最近人們發(fā)現(xiàn)人皮層肌動(dòng)蛋白 cortactin 基因?qū)τ谀[癌的轉(zhuǎn)移有重要的 促進(jìn)作用.為此，我們利用反義核酸技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體 pcDNA3.0/cortactin，為后續(xù)的研究將該基因片段轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株， 觀察

7、該基因在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞功能進(jìn)行 研究作好準(zhǔn)備 .1 材料和方法1.1 材料高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞 MHCC97購(gòu)自上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究 所；大腸桿菌 Ecoli.Dh5 ，真核表達(dá)載體 pcDNA3.0 由第四軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)教研室吳元明博士惠贈(zèng) .高糖型 DMEM培養(yǎng)液為 Invitrogen 公 司產(chǎn)品；新生牛血清系北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；胎牛血清 為杭州四季青生物工程材料技術(shù)有限公司產(chǎn)品； 胰蛋白酶 (Trypsin)為北 京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母提取液(YeastExtrac)t 為 OXLID公司產(chǎn)品；瓊脂(

8、Agar)為 Sanland 公司產(chǎn)品； 瓊脂糖( Agarose)為上海 Yito 公司產(chǎn)品； Trizol試劑、 Taq酶、 T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶(XhoI,BamHI)、pMD18T 載體、Trizol試劑為 Takana 公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為 BioDev公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量抽提試劑盒為 Vgene公司.PCR引物：根據(jù) GeneBank中查到的 cortactin 的 mRNA序列， 用軟件 PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)上下游引物， 引物序列如下 (劃線部分分 別是 BamHI 和 XhoI 的堿基識(shí)別序列，斜體部分為保護(hù)序列) ：上游引 物 5 ATACTCG

9、AGGTGGAACAAGACCGAATGG；A3下 游 引 物 5 TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACA.1T.T23方法 1.2.1高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞 MHCC97培養(yǎng)將購(gòu)回的細(xì)胞經(jīng) 2.5g/L 胰蛋白酶消 化傳代，培養(yǎng)于含 100mL/L胎牛血清的高糖型 DMEM 完全培養(yǎng)液中， 置于 37含 50mL/LCO2的孵箱中培養(yǎng)，每 3d 換液 1次，直至鋪滿 .1.2.2 總 RNA的提取用 2.5g/L 胰蛋白酶消化培養(yǎng)鋪滿的肝癌細(xì)胞 MHCC97， PBS洗滌后轉(zhuǎn)移至 1.5mL微量離心管中，離心 1000g 離心 10min，棄上 清，加入 1mLTrizol試劑，立即反

10、復(fù)抽吸至細(xì)胞充分裂解，靜置 5min ， 加入 200L氯仿劇烈振蕩 15s，低溫離心機(jī) 4 12000g 離心 20min，取 水相至一新的微量離心管中，加入等體積的異丙醇， 4靜置 60min， 低溫離心機(jī) 412000g離心 20min，棄上清， 750mL/L 乙醇洗滌沉淀 2 次、 45000g 離心 10min，棄上清，沉淀自然干燥 3min，加入 15L 無(wú) Rnase 水溶解沉淀 .取 5L行凝膠電泳； 2L用于反轉(zhuǎn)錄 .1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 合成 cDNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明用隨機(jī)六聚體法反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA. 將反應(yīng)體系置于冰上，取總 RNA2L+引物（隨機(jī)六聚體 ）1 L

11、去+ 離子水 9L于 PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻，在 PCR反應(yīng)儀中 70靜置 5min；放 置冰上，依次加 5Buffer4 L,Rna抑se制劑 1L和 dNTP2L，輕混勻， 25 5min；立即冰浴后加入反轉(zhuǎn)錄酶 1（L終體積 20L），輕混勻后依 次進(jìn)行 2510min,42 60min,7010min 和立即冰浴 .取 cDNA 進(jìn)行 PCR.1.2.4PCR擴(kuò)增目的片段 cortactin 基因在 PCR反應(yīng)管中建立 50L反 應(yīng)體系： Buffer5 L,MgCl23 L,Sense2.5 L,Antisense2.5 L,cDNA4 L,dNTP2 L,d O31L；并用 50L礦物油封 .熱啟動(dòng) 94,4min 后加 Taq酶 0.5 反L.應(yīng)條 件為： 94預(yù)變性 4min 后，95變性 30s，56退火 2min，72延伸 2min，共 35 個(gè)循環(huán)， 72再延伸 7min. 最后 4保存 .產(chǎn)物行凝膠電泳 . 目的片段切膠按膠回收試劑盒說(shuō)明行膠回收純化 .-70保存 .1.2.5 目的 片段與 T載體連接在 0.5mLPCR反