質(zhì)粒提取的原理操作步驟各溶液的作用

1、細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)， 但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與 DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分

2、子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性 而呈絮狀，離心時可沉淀下來。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離 子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但 這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學(xué)實驗室中常用。一、試劑準備1. 溶液 I : 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCI(pH 8.0

3、) , 10mM EDTA(pH 8.0 )1M Tris-HCI t1 (pH 8.0) 12.5ml, 0.5M EDTA ( pH 8.0) 10ml，葡萄糖 4.730g,加 ddH2O 至 500ml。在 10 lbf/in2 高壓滅菌15min，貯存于4C。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH,因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如 果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道 EDTA是Ca2+和 Mg2+等二價金屬

4、離子的螯合劑，配 在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達10 mM的EDTA無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕 DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的 TE緩沖液中有EDTA如果哪 天你手上正好缺了溶液 I ,可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水， 或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。NaOH也使DNA變性，但只是個副產(chǎn)物，在溶液3加入后其中的醋酸和 NaOH中和，質(zhì)粒DNA恢復(fù)活性2. 溶液n： 0.2N NaOH,

5、1% SDS 2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml 力口 ddH2O至 10ml。使用前 臨時配置t2。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和 2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N 的NaOH無非是為了保證 NaOH沒有吸收空氣中的 CO2而減弱了堿 性。很多人不知道其實 破細胞的主要是堿，而不是 SDS所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳 的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer (雙層膜)結(jié)構(gòu)向 micelle (微囊)結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新 鮮的0.4 N NaOH,即便

6、是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌(不妨可以自己試一下)，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為 SDS也是堿性的， 只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加 SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點： 第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必DNA的斷裂會帶來57.5ml，力口 ddH2O最容易產(chǎn)生的誤解須溫柔混合(象對待女孩子一樣)，

7、不然基因組 DNA也會斷裂?；蚪M 麻煩。3. 溶液川：醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 至500ml。4 C保存?zhèn)溆?。溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。是，當SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%勺SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然 SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCI，你會發(fā)現(xiàn)

8、SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS而高濃度 的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓t3人高興的是大

9、腸桿菌的基因組DNA也 一起被共沉淀了。 這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的 DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH因為長時間的堿性條件會打斷DNA所以要中和之?；蚪M DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是 50-100 kb大小的片斷，就沒有辦法再 被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩， 不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA昆入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組 DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復(fù)性的也好

10、，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。4. TE: 10mMTris-HCI(pH 8.0) , 1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCI ( pH 8.0 ) 1ml, 0.5M EDTA(pH 8.0 ) 0.2ml，力口 ddH2O至 100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌 20min , 4C保存?zhèn)溆谩?. 苯酚/氯仿 /異戊醇(25: 24: 1)不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實還有

11、很多蛋白質(zhì)不能被沉淀， 因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA不然時間一長就會因為混入的 DNase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚(Phenol )對蛋白質(zhì)的變性作用遠大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液 (比如4M的 異硫氰酸胍),離心后酚相會跑到上層， 不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶

12、反應(yīng) (比如限制性酶切反應(yīng))，因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被 除干凈而不必擔心酶切等反應(yīng)不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。6. 乙醇(無水乙醇、70%乙醇)回收后的水相含有足夠多的鹽， 因此只要加入 2 倍體積的乙醇， 在室溫放置幾分鐘后離心就 可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。這時候如果放到20C，時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點不同于普通的 DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分

13、子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70 %的乙醇多洗幾次， 每次在室溫放置一個小時以上， 并用 tip 將沉淀打碎， 就能得到好的樣品。 得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml ）的 TE 緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果的.7. 5X TBE Tris 堿 54g,硼酸 27.5g , EDTANa2 2H2O4.65g，力口 ddH20 至 1000ml。15 Ibf/in2 高壓濕熱滅菌 20min, 4C保存?zhèn)溆谩?溴化乙錠（ EB）：10mg/ml9. RNase A （ RNA酶 A）：不含 DNA酶（DNase-free）

14、 RNase A 的 10mg/ml, TE 配制，沸水加熱 15min，分裝后貯存于-20 C。10. 6 x loading buff er （上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青 FF, 40% （W/V 蔗 糖水溶液。11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5 x TBE微波爐加熱至完全溶化，冷卻至 60C左右，力口 EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5卩g/ml （注意：EB為強誘 變劑，操作時帶手 套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5 xTBE

15、，即可上 樣。二、操作步驟1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB （含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37C、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約 12-14hr ）。2. 取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000gx 1min,棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。3. 將細菌沉淀重懸于 1001預(yù)冷的溶液1（ 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCI（pH 8.0） , 10mM EDTA（pH 8.0 ）中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻， （且不至于沉淀） 。4. 加200卩1新鮮配制的溶液H, 顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解

16、（溶液n為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。5. 加入1501預(yù)冷的溶液川（醋酸甲 AcK,將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液川為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復(fù) 性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使 SDS蛋白復(fù)合物沉淀。6. 加入4501的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4C 離心12000g x 10min。沒有用PDS沉淀干凈的蛋白質(zhì)置于下層7. 小心移出上清于一新微量離心管中,加入 2.5 倍體積預(yù)冷的無水乙醇,混勻,室溫放置2-5min , 4C離 心 12000gx 15min。1. 為什么用無水乙醇沉淀 DNA？用無水乙醇沉淀DN

17、A這是實驗中最常用的沉淀 DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水 相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在， 當加入乙醇時，乙醇會奪去 DNA周圍的水分子，使DNA 失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與 DNA相混合，其乙醇的最終含量 占 67%左右。因而也可改用 95%乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA時可用95%乙醇代替無水

18、乙酵, 最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。 也可以用 0.6 倍體積的異丙醇選 擇性沉淀DNA 一般在室溫下放置 15 30分鐘即可。2. 在用乙醇沉淀 DNA寸，為什么一定要加 NaAc或NaCI至最終濃度達 0.10.25mol/L ? 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCI，使Na沖和DNA分子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNAI鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響 DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4 C離心800