血清尿素測(cè)定

1、【目的】學(xué)習(xí)血清尿素(Urea)測(cè)定方法，了解其意義?！驹怼垦迥蛩?Urea )是蛋白質(zhì)的正常代謝產(chǎn)物。它的測(cè)定是常用的衡量腎小球功能的指標(biāo)之一。腎性血清尿素含量增加， 提示腎小球損傷。是研究藥物腎毒性的重要指標(biāo)之一。【器材】兔固定架、注射器、燒杯、可見分光光度計(jì)、試管、水浴【藥品】0.5%氯化高汞溶液、生理鹽水【動(dòng)物】家兔2只【方法】取家兔 2只，1只注射氯化高汞 5ml/kg ( 0.5%氯化高汞溶液1.0ml/kg)，另1只注射等量的生理鹽水。48小時(shí)后，從家兔耳靜脈取血1ml，制取血清，按血清尿素測(cè)定方法測(cè)定血清尿素含量。【結(jié)果】記錄2只家兔血清尿素含量，比較并分析其差別。附血清尿

2、素(Urea)測(cè)定方法【原理】尿素與二乙酰在酸性反應(yīng)環(huán)境中加熱，縮合生成色素原二嗪化合物。因二乙酰不穩(wěn)定，不宜直接加入，可由化學(xué)反應(yīng)生成。 通常由反應(yīng)系統(tǒng)中二乙酰一肟與強(qiáng)酸作用，產(chǎn)生乙 二酰。二乙酰和尿素反應(yīng)，縮合生成紅色的二嗪。根據(jù)顏色深淺確定尿素含量的多少?！驹噭?1) 酸性試劑：在三角燒瓶中加蒸餾水約100ml ，然后加入濃硫酸 44ml及85%磷酸66ml。冷至室溫，加入硫氨脲 50mg 及硫酸鎘(CdSO4 8H2O)2g 。溶解后用蒸餾水稀釋至1L ,置棕色瓶中冰箱保存，可穩(wěn)定6個(gè)月。(2) 二乙酰-肟溶液：稱取二乙酰-肟20g，加蒸餾水約900ml ，溶解后，再用蒸餾水稀釋 至

3、1L ,置棕色瓶中，貯放冰箱內(nèi)可保存半年。尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液(100mmol/L):稱取干燥純尿素(MW=60.06)0.6g,溶解于蒸餾水 中，并稀釋至100ml ，加0.1g疊氮鈉防腐，置冰箱內(nèi)可穩(wěn)定半年。(4)尿素標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)用液(5mmol/L):取5.0ml貯存液用無氨蒸餾水稀釋至100ml.【操作】按表T4-1 進(jìn)行混勻后，置沸水中加熱12分鐘，置冷水中冷卻5分鐘后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 540nm以空白管調(diào)至零點(diǎn)。比色讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管的吸光度?！居?jì)算】【正常參考值】2.868.20mmol/L尿素【注意事項(xiàng)】1 .本法線性范圍達(dá) 14 mmol/L 尿素，如遇高于此濃度的標(biāo)本必須用生理鹽

4、水作適當(dāng)?shù)南♂尯笾販y(cè)，然后乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。2 試劑中加入硫氨脲和鎘離子，增進(jìn)顯色強(qiáng)度和色澤穩(wěn)定性，但仍有輕度退色現(xiàn)象(每小時(shí)小于5%)。加熱顯色冷卻后應(yīng)及時(shí)比色。3 吸管必須校正，使用時(shí)務(wù)必注意清潔干凈，加量務(wù)必準(zhǔn)確。4 世界衛(wèi)生組織推薦用 mmol/L尿素表示濃度，不再使用尿素氮一詞。5 .血清尿素增高的病理因素常見于腎臟原因，腎臟原因又可分為腎性、腎前或腎后：腎性：急性腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎及中毒性腎炎都可見血液中尿素含量增高。腎前或腎后：引起尿量顯著減少或尿閉，如脫水、水腫、腹水、循環(huán)功能衰竭、尿路結(jié)石或前列腺腫大引起的尿路梗阻等均可引起血清尿素含量升高。此外

5、，生理因素也可導(dǎo)致血清尿素增高。如體內(nèi)蛋白質(zhì)分解過多：急性傳染病、上消化道出血、大面積燒傷、 大手術(shù)后和甲狀腺功能抗進(jìn)等。雖然血清尿素增高，此時(shí)其它腎功能試驗(yàn)結(jié)果一般均正常。（注：本法引自中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編著的全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程）尿素的測(cè)定方法可分為兩大類：一類直接法，尿素直接和某試劑作用， 測(cè)定其產(chǎn)物，最常見的為二乙酰一肟法；另一類是 尿素酶法，用尿 素酶將尿素變成氨，然后用不同的方法測(cè)定 氨。1）尿素酶法（直接法）：尿素酶法利用尿素酶催化尿素水解生成銨鹽，銨鹽可用納氏試劑直接顯色、酚-次氯酸鹽顯色或酶偶聯(lián)反 應(yīng)顯色。尿素測(cè)定目前多采用尿素酶偶聯(lián)法：用尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨在谷

6、氨酸脫氫酶的作用下使 NADH氧化為NAD+時(shí),通過34 Onm吸光度的降低值可計(jì)算出尿素含量。此反應(yīng)是目前自動(dòng)生化分析儀上常用的測(cè)定原理。此外，尿素酶水解尿素產(chǎn)生氨的速率，也可用電導(dǎo)的方法進(jìn)行測(cè)定，其電導(dǎo)的增加 與氨離子濃度有關(guān)，反應(yīng)只需要很短的時(shí)間，適用于自動(dòng)分析儀。2）酚-次氯酸鹽顯色法：尿素酶水解尿素生成氨和酚及次氯酸鹽，在堿性環(huán)境中作用形成對(duì)-醌氯亞胺，亞硝基鐵氰化鈉催化此反 應(yīng)：對(duì)-醌氯亞胺同另一分子的酚作用，形成 吲哚酚，它在堿性溶液中產(chǎn)生藍(lán)色的解離型 吲哚酚：此反應(yīng)敏感，血清用量少（10卩I）,無需蛋白沉淀，一般用于手工操作測(cè)定中。3）納氏試劑 顯色法：尿素經(jīng)尿素酶作用后生成氨

7、，氨可與納氏試劑（Hgl2.2KI的強(qiáng)堿溶液）作用，生成棕黃色的碘化雙汞銨。尿素酶法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)專一，特異性強(qiáng)，不受尿素類似物的影響，缺點(diǎn)是操作費(fèi)時(shí)，且受體液中氨的影響。二乙酰一肟法（直接法）：尿素可與二乙酰作用，在強(qiáng)酸加熱的條件下，生成粉紅色的二 嗪化合物（Fearom反應(yīng)），在54 Onm比色，其顏色強(qiáng)度與尿素含量成正比。二乙酰不穩(wěn) 定，用二乙酰一肟代替， 后者遇酸水解成二乙酰。試劑中加入Fe3+或Cd2+及硫氨脲，可提高靈敏度，增加顯色穩(wěn)定性，其中Fe3+和Cd2+有氧化作用，還能消除 羥胺的 干擾作用。提高酸的濃度可增加靈敏度。二乙酰一肟與尿素的反應(yīng)不是專一的，與瓜氨酸也有顯色。本法靈敏、簡(jiǎn)單，產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定，缺點(diǎn)是加熱時(shí)有異味釋放，一般臨床已很少使用此方法。尿素測(cè)定用血清或血漿，體液中尿素的濃度常用尿素中含有的氮來表示，稱為尿