免疫佐劑研究進(jìn)展論文

1、免疫佐劑研究進(jìn)展論文論文關(guān)鍵詞：殼聚糖；理化性；免疫佐劑；疫苗 論文摘要：免疫佐劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)抗原的免疫原性、提高免疫效果。為增強(qiáng)疫苗的免疫原性在病毒性疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗的研制中常加入免疫佐劑。目前批準(zhǔn)可用于人體的免疫佐劑是鋁佐劑，因只能引起體液免疫，不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，因此尋找新的免疫佐劑已成為疫苗研制迫切需要解決的問(wèn)題。研究表明，殼聚糖具有免疫佐劑效應(yīng)，具有良好的組織相容性，可生物降解，安全無(wú)毒，因此殼聚糖將成為一種很有應(yīng)用價(jià)值的免疫佐劑。本文就殼聚糖的理化性及其免疫佐劑研究做一綜述。 殼聚糖（Chitosan），也稱(chēng)幾丁聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、聚氨基葡萄糖、可溶性甲殼素

2、，化學(xué)名為（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，由蝦、蟹等富含甲殼素的物質(zhì)經(jīng)脫鈣、脫蛋白、脫色、脫乙酰等工藝加工而成，是甲殼質(zhì)脫乙酰反應(yīng)后的物質(zhì)，為分子量90120kDa的生物大分子。從Braconot于1811年描述甲殼素迄今，甲殼素和殼聚糖的發(fā)展歷史已有100多年。但由于殼聚糖具有提高免疫、活化細(xì)胞、預(yù)防癌癥、抗衰老，調(diào)節(jié)機(jī)體等作用，因此在醫(yī)藥、保健、食品等多領(lǐng)域具廣泛的用途。 1殼聚糖的理化性 甲殼素1廣泛存在于甲殼綱動(dòng)物蝦和蟹的甲殼、昆蟲(chóng)的甲殼、真菌（酵母、霉菌）的細(xì)胞壁和植物（如蘑菇）的細(xì)胞壁中。自然界每年生物合成的甲殼素將近100億噸，是自然界中儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的第二大天然有

3、機(jī)化合物。殼聚糖是甲殼素的N-脫乙酰基的產(chǎn)物，通常把脫去55%以上N-脫乙酸基，且能溶于1%乙酸或1%鹽酸的甲殼素稱(chēng)之為殼聚糖。甲殼素與殼聚糖的差別，僅僅是N-脫乙酰度不同而已。殼聚糖是白色無(wú)定形、半透明、略有珍珠光澤的固體。因原料不同和制備方法不同，分子量有差異，不溶于水和堿溶液，可溶于稀的鹽酸、硝酸等無(wú)機(jī)酸和大多數(shù)有機(jī)酸。在稀酸中，殼聚糖的主鏈會(huì)緩慢水解，溶液的黏度也會(huì)逐漸降低。殼聚糖氨基的氮原子上具有一對(duì)未公用的電子，能從溶液中結(jié)合一個(gè)氫質(zhì)子，從而使殼聚糖成為帶陽(yáng)電荷的聚電解質(zhì)，破壞殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使之溶于水中。殼聚糖的溶解度至少受3個(gè)因素的影響：脫乙酰度。脫乙酰度越高，分子

4、鏈上的游離氨基越多，離子化強(qiáng)度越高，也就越易溶于水；反之脫乙酰度越低，溶解度越小。分子量。分子量越大，溶解度越小，因?yàn)闅ぞ厶欠肿觾?nèi)和分子間的氫鍵使得分子彼此纏繞在一起且比較僵硬。酸的種類(lèi)。稀硫酸,稀磷酸不能溶解殼聚糖。 殼聚糖溶液的穩(wěn)定性在使用過(guò)程中特別重要。殼聚糖的糖苷鍵是半縮醛結(jié)構(gòu)，這種半縮醛結(jié)構(gòu)對(duì)酸是不穩(wěn)定的。殼聚糖的酸性溶液在放置過(guò)程中會(huì)發(fā)生酸催化的水解反應(yīng)，殼聚糖分子的主鏈不斷降解，黏度越來(lái)越低，分子量逐漸降低，最后被水解成寡糖和單糖。殼聚糖稀溶液的黏度不僅和溶液的PH有關(guān)系,也與殼聚糖的分子量有關(guān)系，殼聚糖分子量越高，其溶液的黏度就越大，分子量越低，黏度就越小。殼聚糖稀溶液的離子強(qiáng)

5、度直接影響殼聚糖分子在溶液中的形態(tài)。殼聚糖能被人體吸收利用，與人體的組織器官及細(xì)胞有良好的組織相容性，無(wú)毒，具有生物降解性，幾乎無(wú)免疫原性，同時(shí)具有多種生物活性。經(jīng)過(guò)化學(xué)改性得到的殼聚糖衍生物,其物理化學(xué)性質(zhì)得到改善,使其應(yīng)用范圍大大拓展,因此殼聚糖及其衍生物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究已引起人們廣泛的興趣。 2殼聚糖作為DNA疫苗的免疫佐劑研究 有效的疫苗都需要一個(gè)合適的抗原傳遞系統(tǒng)，即存在佐劑依賴(lài)性或載體依賴(lài)性。許多研究表明殼聚糖可有效的促進(jìn)局部，特別是粘膜局部的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗原傳遞系統(tǒng)功能，具有免疫佐劑的效應(yīng)。DNA疫苗是利用重組DNA技術(shù)將保護(hù)性抗原蛋白基因克隆到真核表達(dá)載體，然后將重組的質(zhì)粒D

6、NA直接導(dǎo)宿主體內(nèi)，使抗原蛋白經(jīng)過(guò)內(nèi)源性表達(dá)遞呈給免疫系統(tǒng)，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。盡管DNA疫苗已經(jīng)用于治療一些動(dòng)物疾病，但DNA疫苗在人體的免疫原性弱，不能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答限制了它的應(yīng)用。將基因疫苗涂抹在皮膚表面進(jìn)行免疫，由于免疫原性弱，影響皮膚對(duì)質(zhì)粒的吸收及免疫效果，同時(shí)由于質(zhì)粒本身容易降解，不能產(chǎn)生足夠高的抗體水平來(lái)保護(hù)宿主不受疾病的感染。殼聚糖及其衍生物能與DNA形成聚電解質(zhì)聚合物，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行保護(hù)，可減少質(zhì)粒DNA的降解，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的識(shí)別，延長(zhǎng)疫苗的作用時(shí)間，從而加強(qiáng)免疫效果。王焱冰2等以殼聚糖包裹不同的草原兔尾鼠卵透明帶3(

7、LZP3)基因DNA疫苗pcDNA3-Lzp3(pLzp3)和pLC，通過(guò)皮膚擦拭免疫小鼠，以ELISA方法檢測(cè)抗體水平，對(duì)卵巢做病理切片檢測(cè)。ELISA結(jié)果顯示用殼聚糖包裹的pLC組在皮膚免疫中顯示出優(yōu)勢(shì)，卵巢病理切片結(jié)果正常，說(shuō)明殼聚糖包裹質(zhì)粒皮膚免疫小鼠較純質(zhì)粒免疫效果更為顯著。殼聚糖-DNA提高了皮膚免疫效果，有望成為一種有效的介導(dǎo)DNA疫苗進(jìn)行皮膚免疫的載體物質(zhì)。口服和鼻腔接種疫苗能夠誘導(dǎo)黏膜免疫，這種局部免疫對(duì)于抵御經(jīng)黏膜感染的病原微生物是極其重要的。然而，口服疫苗在消化道內(nèi)易被降解，抗原的吸收效率低。經(jīng)鼻腔接種的疫苗雖不像在腸道內(nèi)那樣降解明顯，但在鼻腔內(nèi)半清除時(shí)間僅15min，抗

8、原很難逾越上皮屏障。將疫苗和遞呈系統(tǒng)混合制備成微粒，就可以有效地防止疫苗在到達(dá)黏膜組織前被降解，因此許多學(xué)者將殼聚糖用于黏膜遞呈和免疫佐劑作用研究。 胡云章3等選取乙肝病毒表面抗原的亞單位疫苗及DNA疫苗作為模型，以殼聚糖作為載體，通過(guò)沉淀/凝聚法制備殼聚糖微球疫苗，構(gòu)建了鼻腔免疫釋放系統(tǒng)，對(duì)其免疫效果進(jìn)行分析，并與腹腔及肌肉注射免疫方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在HBV亞單位疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，微球疫苗體現(xiàn)出一定程度的緩釋作用，腹腔免疫及鼻腔免疫在產(chǎn)生抗體應(yīng)答方面的差異無(wú)顯著意義，由此提示鼻腔免疫可以作為亞單位微球疫苗接種的新型途徑，但其有效性還待進(jìn)一步確定。在HBVDNA微球疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)

9、答中，傳統(tǒng)形式肌肉注射所誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答在12周時(shí)升至最高，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)；而微球形式的肌肉注射和鼻腔免疫所誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答，則在16周時(shí)才達(dá)最高，且峰值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)形式肌肉注射組。說(shuō)明殼聚糖微球?qū)τ贒NA疫苗具有保護(hù)作用及緩釋作用，能夠使誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答水平閾值的時(shí)間延長(zhǎng)，并且鼻粘膜可能比肌肉組織更有利于吸收和提呈DNA疫苗。此實(shí)驗(yàn)表明微球疫苗鼻腔免疫能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)力和免疫記憶，為發(fā)展一種疫苗新型免疫形式及途徑提供了理論依據(jù)。 Jiang等對(duì)殼聚糖-乙肝核心抗原微粒能否誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答及其潛在機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示和裸DNA相比吞噬細(xì)胞對(duì)殼聚糖微粒有較高

10、的攝取率；殼聚糖微粒注射部位未見(jiàn)明顯組織學(xué)改變。高抗體效價(jià)、高水平IFN-的分泌說(shuō)明殼聚糖微粒顯著提高了免疫原性。Khatri等對(duì)乙肝病毒殼聚糖微粒鼻粘膜免疫進(jìn)行了研究。復(fù)凝聚法制備具有特定大小、形態(tài)、表面電荷、荷載率和抗核酸酶消化能力及高轉(zhuǎn)染效率的乙肝病毒殼聚糖微粒。結(jié)果顯示鼻粘膜免疫后乙肝病毒殼聚糖微粒誘導(dǎo)的血清抗HBsAg抗體滴度比裸DNA疫苗和鋁佐劑疫苗均要低，而且既能誘導(dǎo)粘膜分泌sIgA，也能產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。此研究表明殼聚糖微粒作為DNA疫苗的載體和佐劑，通過(guò)鼻粘膜免疫途徑，能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。 3殼聚糖作為微生物疫苗的免疫佐劑研究 Kang等采用三聚磷酸鹽與殼聚糖發(fā)生離子

11、交聯(lián)的方法，制備得到包裹支氣管敗血性博德特氏菌皮膚壞死毒素(BBD)的殼聚糖載藥微球。然后將載有BBD的殼聚糖微球直接通過(guò)鼻腔給大鼠進(jìn)行免疫后，采用ELISA法來(lái)檢測(cè)血清、鼻流出液及唾液中BBD特異的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，鼻腔中BBD特異的IgA抗體滴度和血清中的IgG及IgA滴度均與給藥時(shí)間和給藥劑量有關(guān)。說(shuō)明鼻內(nèi)免疫對(duì)鼻相關(guān)的淋巴樣組織有靶向作用，同時(shí)也說(shuō)明殼聚糖對(duì)于鼻黏膜免疫具有免疫佐劑作用。常海燕4等將殼聚糖和流感病毒滅活疫苗混合后經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠，免疫后檢測(cè)血清中IgG抗體及鼻洗液中IgA抗體水平，加強(qiáng)免疫后1周，用致死性(40LD50)流感病毒A/PR/8/34(H1N1)

12、攻擊小鼠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖作佐劑能顯著增強(qiáng)血清抗體含量，并提高小鼠抗病毒攻擊的能力。Read等則將殼聚糖和三價(jià)流感滅活疫苗一起鼻腔及肌肉免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以明顯提高其局部和血清抗體反應(yīng)。研究結(jié)果顯示殼聚糖作為流感病毒滅活疫苗的新型佐劑，可以增強(qiáng)疫苗的抗體反應(yīng)。 謝勇5等對(duì)以殼聚糖為佐劑的幽門(mén)螺桿菌疫苗的免疫保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。他們將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（PBS溶液）、殼聚糖酸溶液組、殼聚糖顆粒組、Hp抗原組、Hp抗原+殼聚糖酸溶液組、Hp抗原+殼聚糖顆粒組、Hp抗原+霍亂毒素（CT）組、Hp抗原+殼聚糖酸溶液+CT組及Hp抗原+殼聚糖顆粒+CT組，各組于第0、7、14

13、、21天灌胃各免疫1次。結(jié)果顯示以殼聚糖為佐劑的Hp疫苗的免疫保護(hù)率達(dá)60,與以CT為佐劑的Hp疫苗的免疫保護(hù)率(58.33)相似，同時(shí)以CT+殼聚糖為佐劑的Hp疫苗的保護(hù)率為84.62、85.71。含佐劑的Hp疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的HpIgG水平顯著高于對(duì)照組及無(wú)佐劑組，而以CT+殼聚糖為佐劑組所產(chǎn)生的抗HpIgG水平顯著高于僅以CT或殼聚糖為佐劑組。胃黏膜內(nèi)sIgA及特異性抗HpIgA水平在殼聚糖為佐劑組與以CT為佐劑組無(wú)差別，顯著高于無(wú)佐劑組，而殼聚糖與CT聯(lián)合應(yīng)用組顯著高于單以CT為佐劑組。研究結(jié)果表明以殼聚糖為佐劑的Hp疫苗對(duì)Hp感染具有免疫保護(hù)作用，并可成功誘導(dǎo)黏膜局部的特異性體液免疫應(yīng)

14、答，這可能在其免疫防御中起作用；而且可促進(jìn)Thl和Th2的混合免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)Hp感染所致Th2反應(yīng)的抑制、使Thl和Th2反應(yīng)達(dá)到平衡，從而發(fā)揮其免疫保護(hù)作用。 Ahire等對(duì)殼聚糖包裹的破傷風(fēng)毒素（tetanustoxoid，TT）疫苗誘導(dǎo)的全身和局部免疫應(yīng)答進(jìn)行了研究。小鼠隨機(jī)分為殼聚糖+TT抗原組（Chitosanencapsulatedtetanustoxoid，CS-TT）、TT抗原組、殼聚糖組，三組均經(jīng)口服途徑免疫小鼠。ELISA法檢測(cè)血清中抗破傷風(fēng)毒素IgG，檢測(cè)洗腸液及糞便中抗破傷風(fēng)毒素IgA。觀察到CS-TT組小鼠的免疫反應(yīng)有劑量依賴(lài)性，全身和局部免疫有很大程度的提高，表明殼

15、聚糖微粒懸液包裹了高分子量的破傷風(fēng)毒素，誘導(dǎo)了腸的IgA分泌和體循環(huán)的IgG的產(chǎn)生。David等將殼聚糖抗原蛋白溶液皮下免疫小鼠，結(jié)果顯示小鼠特異性抗體滴度增加5倍，脾CD4+T細(xì)胞增值增加6倍。強(qiáng)的抗體滴度增長(zhǎng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）揭示殼聚糖誘導(dǎo)了體液免疫和細(xì)胞免疫。可能的機(jī)制為：粘稠的殼聚糖溶液增加了抗原的滯留時(shí)間，免疫7天后，大于60%的抗原蛋白仍保留在注射部位；殼聚糖誘導(dǎo)了67%引流淋巴結(jié)細(xì)胞的瞬時(shí)膨脹，膨脹的高峰期持續(xù)在殼聚糖免疫后14-21天，之后以多糖的方式降解。 結(jié)語(yǔ) 綜上所述，殼聚糖作為免疫佐劑，通過(guò)皮膚、口服、鼻腔、皮下等不同的免疫途徑，在多種疫苗研究中發(fā)揮重要作用，可有效的誘導(dǎo)局部黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。殼聚糖及其衍生物良好的生物黏附性，促進(jìn)吸收作用及免疫調(diào)節(jié)作用使其在疫苗黏膜給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用有著其他載體材料不可比擬的優(yōu)勢(shì)。以殼聚