分子醫(yī)學(xué)實驗：本科生 分子醫(yī)學(xué)技能教學(xué)課件

1、實驗實驗: 口腔粘膜細(xì)胞基因組口腔粘膜細(xì)胞基因組DNA制備（制備（p12-13） * 實驗室操作規(guī)程及注意事項實驗室操作規(guī)程及注意事項 內(nèi)容：內(nèi)容：1）離心技術(shù)（視頻）；）離心技術(shù)（視頻）； 2）核酸制備與擴增）核酸制備與擴增(P2-12) ； * 操作按鈕 容量刻度 套頭 操作按鈕 容量刻度 套頭 20 l 1000 l 100 l 1 0 0 1 0 0 2 0 0 0.5-10l 20-200l 100-1000l 1 0 . 0 2 0 0 1 0 0 0 切記: 看著刻度調(diào)大小 刻度刻度 返返 回回 實驗原理實驗原理 1、核酸的分類、核酸的分類 l DNA DNA 主要存在于細(xì)胞核的

2、染色體中。核外也有少量主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNADNA， 如線粒體如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠體），葉綠體DNADNA （cpDNAcpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNADNA。 l RNARNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。 l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和 噬菌體，其或只含噬菌體，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。 在細(xì)胞中核酸都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。在細(xì)胞中核酸都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合

3、的狀態(tài)存在。 染色體 染色質(zhì)纖維 核小體 組蛋白 DNA 核酸提取的主要步驟核酸提取的主要步驟 主要包括：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的主要包括：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的 蛋白質(zhì)及多糖、脂類等生物大分子，去除其它蛋白質(zhì)及多糖、脂類等生物大分子，去除其它 不需要的核酸分子、去除鹽類、有機溶劑等雜不需要的核酸分子、去除鹽類、有機溶劑等雜 質(zhì)，純化核酸等。質(zhì)，純化核酸等。 取材取材: 漱口后漱口后(去食屑去食屑)，含生理鹽水，含生理鹽水1015ml約約23min(偶爾咀嚼偶爾咀嚼)，用，用15ml離心管離心離心管離心 （4000rpm 10min）收集細(xì)胞，棄上清）收集細(xì)胞，棄上清 沉淀中加入沉淀中加

4、入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管管 （微量移液器的正確使用）（微量移液器的正確使用） 混勻，混勻，65 溫育溫育30min，間歇振蕩，間歇振蕩 加入等體積的飽和酚（加入等體積的飽和酚（注意：取下層的酚溶液注意：取下層的酚溶液），充分顛倒混勻），充分顛倒混勻 12000rpm 5min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管管 （高速離心機的使用與安全：管對稱平衡）（高速離心機的使用與安全：管對稱平衡） 加入等體積氯仿加入等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻異戊醇，顛倒混勻 12000rpm 5min，上層水相轉(zhuǎn)移到新的，上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP

5、管管 加入加入2倍體積倍體積95%的乙醇，顛倒混勻，的乙醇，顛倒混勻，12000rpm 5min 棄上清，沉淀中加入棄上清，沉淀中加入1 ml 75%乙醇漂洗，乙醇漂洗，12000rpm 2min 輕輕棄去上清，打開輕輕棄去上清，打開EP蓋，管平放室溫靜置蓋，管平放室溫靜置1015min 加入加入50 lTE溶液，溶液，4 保存，便于下次實驗電泳染色檢測保存，便于下次實驗電泳染色檢測 實實 驗驗 操操 作作 l分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則： 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染（排除其它分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機溶蛋白質(zhì)、脂類、糖、

6、有機溶 劑、金屬離子、外源劑、金屬離子、外源DNA、RNA等）等） 。 l核酸純化應(yīng)達到的要求：核酸純化應(yīng)達到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶 劑和過高濃度的金屬離子；劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學(xué)因素對核酸的降解減少化學(xué)因素對核酸的降解（如過量酸堿）（如過量酸堿） 。 減少物理因素對核酸的降解：機

7、械剪切力（減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力（強烈強烈 震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融）和）和高溫高溫 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解（核酸酶核酸酶的預(yù)防）的預(yù)防） 。 3 3、核酸制備時應(yīng)注意的事項核酸制備時應(yīng)注意的事項: l核酸制備的步驟：核酸制備的步驟： I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備 II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放 III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化 IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中 l核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和

8、抑制劑 降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于 對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑 制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。 對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防 止機械剪切力則更重要。 對于RNA，因分子較小，不易被機械剪切 力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提 取中設(shè)法抑制RNase更重要。 4、核酸制備的一般方法和原理、核酸制備的一般方法和原理 l核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可 使DNase失活。 l核酸酶的抑制和抑制劑 RNa

9、se抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。 l核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用 于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑， 去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸 釋放出來； 3對RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：如：SDSSDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-1.5-二磺酸鈉、二磺酸鈉、 三異丙基萘磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉 l核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備

10、中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用：蛋白質(zhì)變性劑的作用： 1. 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去， 以防造成蛋白污染。以防造成蛋白污染。 2.2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNaseRNase活性和破裂細(xì)活性和破裂細(xì) 胞的作用。胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPCDEPC l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNaseDNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶溶

11、菌酶 l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程 1 1）破碎細(xì)胞）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后 組織搗碎。組織搗碎。 動物動物：液氮處理后用勻漿器破碎。：液氮處理后用勻漿器破碎。 細(xì)胞器細(xì)胞器DNADNA：首先純化細(xì)胞器。：首先純化細(xì)胞器。 以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑 l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程

12、 2 2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)）破碎抽提核酸除去雜質(zhì) 1 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的 核蛋白與核蛋白與 其它成分分離其它成分分離 2 2使核酸與蛋白質(zhì)分離使核酸與蛋白質(zhì)分離 3 3除去脂類除去脂類 4 4多糖的除去多糖的除去 l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程 3 3）核酸的純化）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污 染染, ,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑( (鹽、有機溶劑鹽、有機溶劑 等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 4 4）核酸

13、樣品的保存）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質(zhì)介質(zhì) 溫度溫度： 44（55）最佳和最簡單）最佳和最簡單 -70-70是長期保存的良好溫度，為一次性保存是長期保存的良好溫度，為一次性保存 -20-20保存保存 保存介質(zhì)保存介質(zhì)： TETE緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 最好使用新鮮材料，低溫保存最好使用新鮮材料，低溫保存 的樣品材料不要反復(fù)凍融的樣品材料不要反復(fù)凍融 提取血液基因組提

14、取血液基因組DNADNA時，要選時，要選 擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） 組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長， 否則會造成否則會造成DNADNA降解降解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較含量較 少，提取前先富集少，提取前先富集 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNADNA量少，量少， 純度低純度低 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K K 細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破

15、壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNADNA時，應(yīng)提供時，應(yīng)提供 相應(yīng)的緩沖體系相應(yīng)的緩沖體系 采用有機（酚采用有機（酚/ /氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動 作要輕柔作要輕柔 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng) 的去雜質(zhì)的方法的去雜質(zhì)的方法 當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀， 沉淀會

16、更充分沉淀會更充分 沉淀時加入沉淀時加入1/101/10體積的體積的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有），有 利于充分沉淀利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用7070的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干晾干DNADNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TETE緩沖液溶解緩沖液溶解 TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+ 2+或 或MnMn2+ 2+離子，抑制 離子，抑制DNaseDNase pHpH值為值為8.08.0，可防止，可防止DNADNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 1.

17、1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、 多糖、多酚類雜質(zhì)多糖、多酚類雜質(zhì) 2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有 酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑 制后續(xù)酶解反應(yīng)制后續(xù)酶解反應(yīng) 3.3.DNADNA中殘留有金屬中殘留有金屬 離子離子 1. 1.重新純化重新純化DNADNA，去，去 除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚 等雜質(zhì)等雜質(zhì) 2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓，讓 酒精充分揮發(fā)酒精充分揮發(fā) 3.3.增加增加7070乙醇洗滌乙醇洗滌 的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次） q問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 原

18、原 因因 對對 策策 A260/2801.8 1. 1.材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍 融融 2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸 酶的活性酶的活性 3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇 烈，烈，DNADNA被機械打斷被機械打斷 4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染 5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融 1. 1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避 免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融 2.2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍 前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液 3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料 的的DNADNA

19、時，可增加裂解液中螯合劑時，可增加裂解液中螯合劑 的含量的含量 4.4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔 5.5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高 溫滅菌溫滅菌 6.6.將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免 反復(fù)凍融反復(fù)凍融 q問題二：問題二：DNADNA降解降解 對對 策策 原原 因因 1. 1.實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少 2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分 3.3.沉淀不完全沉淀不完全 4.4.洗滌時洗滌時DNADNA丟失丟失 1. 1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材 料料

20、 2.2.動植物要勻漿研磨充分；動植物要勻漿研磨充分；G G 菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶 或機械方式破壁或機械方式破壁 3.3.高溫裂解時，時間適當(dāng)延長高溫裂解時，時間適當(dāng)延長 （對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增 加加PKPK的用量）的用量） 4.4.低溫沉淀，延長沉淀時間低溫沉淀，延長沉淀時間 5.5.加輔助物，促進沉淀加輔助物，促進沉淀 6.6.洗滌時，最好用槍頭將洗滌洗滌時，最好用槍頭將洗滌 液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒 q問題三：問題三：DNADNA提取量少提取量少 對對 策策 原原 因因 1 1簡要敘述酚簡要敘述酚/ /氯仿抽提體系后出現(xiàn)的氯仿抽提

21、體系后出現(xiàn)的 現(xiàn)象及其成因?，F(xiàn)象及其成因。 2.2.沉淀時為什么要用無水乙醇？沉淀時為什么要用無水乙醇？ 實驗實驗: 1）PCR實驗（加樣和上機）實驗（加樣和上機） 2）PCR儀使用規(guī)程示教儀使用規(guī)程示教 內(nèi)容：內(nèi)容：1）PCR技術(shù)技術(shù) (P21-28) ； 2）基因診斷技術(shù)及醫(yī)學(xué)應(yīng)用；）基因診斷技術(shù)及醫(yī)學(xué)應(yīng)用； 3）視頻：）視頻：PCR技術(shù)及其應(yīng)用技術(shù)及其應(yīng)用 （1）PCR反應(yīng)體系 （2）PCR反應(yīng)參數(shù) 94 5min（預(yù)變性） 9445（變性） 5545 （復(fù)性） 共30個循環(huán) 721min（延伸） 7210min（續(xù)延伸） 4 保存 PCR一般反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù) 實驗分組實驗分組（兩人一

22、組，每組做：一份乙肝病毒基因（兩人一組，每組做：一份乙肝病毒基因PCR） 一份一份apoB基因基因PCR （1）模板制備P26 （2）PCR程序 94 3min（預(yù)變性） 9445 秒（變性） 5545 秒（退火+延伸） 共30個循環(huán) 721 min（延伸） 725 min 4 保存 2、apoB-PCR反應(yīng)體系 （1）PCR反應(yīng)體系 （2）PCR程序 94 5min（預(yù)變性） 941 min（變性） 604 min（退火+延伸） 共30個循環(huán) 605 min（延伸） 4 保存 瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、 1%膠膠3mm、凝固后拔梳）凝

23、固后拔梳） 電泳（電泳（6070mA 40min） 紫外檢測觀察結(jié)果紫外檢測觀察結(jié)果 倒緩沖液，加樣（倒緩沖液，加樣（取取PCR 反應(yīng)管中樣品液反應(yīng)管中樣品液10l直接上直接上 樣）樣） 基因診斷基因診斷 基因診斷基因診斷 w 基因突變的檢測基因突變的檢測 1、限制性酶切圖譜直接分析法 2、寡核苷酸探針斑點印跡雜交分析法 3、擴增阻滯突變體系 4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法 5、 DNA序列測定 基因診斷基因診斷 w 基因連鎖分析基因連鎖分析 限制性片段長度多態(tài)性間接 (連鎖)分析法 基因診斷基因診斷 w 外源外源 DNA的檢測的檢測 基因診斷基因診斷 基因診斷舉例基因診斷舉例 1 2 3 4 未切

24、 M 未切 7 8 9 Fas基因 SPP1基因 Fas基因PCR產(chǎn)物長度為332bp，由Mva1進行 酶切，根據(jù)切割后片段分為 A/A基因型即232bp+99bp共2個條帶，無- 670GA位點； G/G基因型即188bp+99bp+44bp共3個條帶， 無232bp條帶為-670GA多態(tài)性SNP純合子型； G/A基因型即232bp+188bp+99bp+44bp共4個 條帶，為-670GA多態(tài)性SNP雜合子型。 Spp-1基因PCR產(chǎn)物長度為252bp，由Alu1 酶切，根據(jù)切割后片段分為 C/C基因型即147bp+105bp共2個條帶，無 CT的SNP多態(tài)性位點； T/T基因型即147b

25、p+61bp+44bp共3個條帶， 無105bp條帶為多態(tài)性SNP純合子型； C/T基因型即147bp+105bp+61bp+44bp共4 個條帶，為多態(tài)性SNP雜合子型。 基因突變的直接檢測基因突變的直接檢測 正常片段 突變片段 PCR擴增 變性成單鏈 PAGE比較 其基本過程是: 1. PCR擴增靶DNA; 2. 將特異的PCR擴增 產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使 之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子; 3. 將適量的單 鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳; 4. 最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯 色分 析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相 比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)

26、象發(fā)生改變，進 而推斷該DNA片段中有堿基突變. 實驗實驗: 1）PCR擴增乙肝病毒基因及電泳鑒定擴增乙肝病毒基因及電泳鑒定 2）apoB-PCR基因多態(tài)性分析基因多態(tài)性分析 內(nèi)容：內(nèi)容：1）核酸檢測）核酸檢測 (P29) ； 2）電泳技術(shù)（視頻）；）電泳技術(shù)（視頻）； 3）基因診斷與基因多態(tài)性）基因診斷與基因多態(tài)性 u核酸檢測即對其純度、含量或堿基序列的核酸檢測即對其純度、含量或堿基序列的 檢測和鑒定；檢測和鑒定； u常用技術(shù)包括電泳分析、分光光度法分析常用技術(shù)包括電泳分析、分光光度法分析 以及序列分析。以及序列分析。 一、一、DNADNA瓊脂糖凝膠電泳實驗原理瓊脂糖凝膠電泳實驗原理 瓊脂糖

27、是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解， 45 開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決 定于瓊脂糖的濃度定于瓊脂糖的濃度 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用 下向正極泳動下向正極泳動 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子 篩效應(yīng)。不同篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小、構(gòu)象及電荷數(shù)不同，的分子量大小、構(gòu)象及電荷數(shù)不同， 電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶 DNA

28、顯色劑多用顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在 波長為波長為254nm365nm的紫外光照射下呈橘紅色的紫外光照射下呈橘紅色 （530nm）的熒光。）的熒光。 二、實驗?zāi)康亩?、實驗?zāi)康?掌握瓊脂糖凝膠電泳分離掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法的原理和方法 掌握檢測掌握檢測DNA的實驗方法的實驗方法 基因組基因組DNA及及PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭， 微波爐，紫外透射檢測儀等。微波爐，紫外透射檢測儀等。 瓊脂糖，瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），），6X

29、加樣緩加樣緩 沖液沖液 ： 0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液蔗糖水溶液; 0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，30%甘油水溶液甘油水溶液 三、實驗材料三、實驗材料 四、實驗步驟四、實驗步驟 1g 1g 瓊脂糖加入瓊脂糖加入100ml 1100ml 1TAETAE電泳緩沖液中，搖勻。在微電泳緩沖液中，搖勻。在微 波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到冷卻到6060，加入，加入 100l100l的的0.5mg/ml EB0.5mg/ml EB或替代品，并搖勻。也可電泳完畢后或替代品，并搖勻。也可電泳完畢后 將膠

30、浸于將膠浸于EBEB溶液中溶液中1010分鐘，爾后清水浸泡分鐘，爾后清水浸泡1010分鐘后紫外等分鐘后紫外等 下觀察下觀察） 將制膠板兩端安裝好，將制膠板兩端安裝好，插入適當(dāng)梳子插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖，將溶解的瓊脂糖 （約（約5050）倒入，室溫冷卻凝固）倒入，室溫冷卻凝固 充分凝固后，將凝膠置入電泳槽中，加充分凝固后，將凝膠置入電泳槽中，加1 1TAETAE電泳緩沖液電泳緩沖液 至液面覆蓋凝膠至液面覆蓋凝膠1-2mm1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。，小心垂直向上拔出梳子。 (4) (4) 用移液器吸取總用移液器吸取總DNADNA樣品樣品10l10l于封口膜上，再加入于封口膜上，再加入

31、2l 2l 的的6X6X載樣緩沖液，混勻后，載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔小心加入點樣孔。 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶，可見到溴酚藍(lán)條帶 由負(fù)極向正極移動，電泳約由負(fù)極向正極移動，電泳約30min-60min30min-60min。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩， 打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNADNA條帶。條帶。 瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、 1%膠膠3mm、凝固

32、后拔梳）凝固后拔梳） 電泳（電泳（6070mA 40min） 紫外檢測觀察結(jié)果紫外檢測觀察結(jié)果 倒緩沖液，加樣（倒緩沖液，加樣（取取PCR 反應(yīng)管中樣品液反應(yīng)管中樣品液10l直接上直接上 樣）樣） 五、結(jié)果與分析五、結(jié)果與分析 圖圖1 HBV-PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖 (1、2、3、4為為PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物，M為為Marker) 圖圖2 apoB-PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖 六六 注意事項注意事項 1 倒膠時把握好膠的溫度，不要高于倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60 ，否則溫度，否則溫度 太高會使制板變形太高會使制板變形 2 膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要

33、豎直向上，膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上， 不要弄壞點樣孔不要弄壞點樣孔 3 點樣時槍頭下伸，點樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不點樣時槍頭下伸，點樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不 要太多要太多 4 EB染料有毒（強致癌物），切勿用手接觸，更不要染料有毒（強致癌物），切勿用手接觸，更不要 污染環(huán)境，膠勿亂扔污染環(huán)境，膠勿亂扔 5 紫外線觀察不要太久紫外線觀察不要太久 補充資料補充資料 1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系 （1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移 率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移 動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片 段的大小

34、。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝 膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大 小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜 超過此值。 （2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用 不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。 表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍 瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 線狀DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1 瓊脂糖凝膠分辨瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為片段的范圍為0.2 50kb之間之間;聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為聚丙烯酰胺凝膠

35、分辨范圍為1 1000bp之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介 質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其 分辨能力就越強。例如，分辨能力就越強。例如，20%的聚丙烯酰的聚丙烯酰 胺凝膠可分離胺凝膠可分離1-6bp的的DNA小片段，而若要小片段，而若要 分離分離1000bp的的DNA片段，就要用片段，就要用3%的聚丙的聚丙 烯酰胺凝膠。再如，烯酰胺凝膠。再如，2%的瓊脂糖凝膠可分的瓊脂糖凝膠可分 離離300bp的雙鏈的雙鏈DNA分子，而分離大片段分子，而分離大片段 DNA就要用低濃度就要用低濃度(0.3%1.0%)的瓊脂糖的瓊脂糖 凝膠。凝

36、膠。 2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：供價閉環(huán) DNA（covalently closed circular，cccDNA）直線 DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時， 環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷 移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA （剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm0），由 此可見，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝 膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子 強度等的影響。 3、緩沖液系統(tǒng) 缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反， 高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán) 重時，會造成膠熔化和DNA的

37、變性。 常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸 （TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE） 等，濃度約為50mmol/L(pH7.57.8)。電泳緩沖液一 般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。 TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力， 因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為 避免此缺點，室溫下貯存5溶液，用時稀釋10倍 0.5工作溶液即能提供足夠緩沖能力。 4、電泳條件 瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié) 果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在 低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用 的電壓呈正比。但是，在電場強

38、度增加時，較大的 DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的 增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離 DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。 電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳 行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只 有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在 4進行電泳。 5、染色觀察、染色觀察 在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠(ethidium bromide，簡稱，簡稱EB)染料對核酸分子進行染色，然染料對核酸分子進行染色，然 后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，檢測靈敏快后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，檢測靈敏快 捷，

39、捷，DNA帶中含帶中含0.05g的微量的微量DNA，可以清晰地，可以清晰地 檢測出來。檢測出來。EB能插入到能插入到DNA或或RNA分子的相鄰堿分子的相鄰堿 基之間，并在基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。 把把EB直接加到凝膠介質(zhì)中，染料便會與直接加到凝膠介質(zhì)中，染料便會與DNA分子分子 結(jié)合，卻不能與凝膠相結(jié)合。這樣就只有結(jié)合，卻不能與凝膠相結(jié)合。這樣就只有DNA分分 子能吸收子能吸收EB并發(fā)出熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，并發(fā)出熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下， 熒光強度與熒光強度與DNA片段的數(shù)量成正比。片段的數(shù)量成正比。 實驗實驗: 1）質(zhì)粒DNA的提取

40、（p70） 2）限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒（）限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒（p82） 內(nèi)容：內(nèi)容：1）基因克??；）基因克??； 2）復(fù)習(xí)基因重組與基因工程章節(jié)；）復(fù)習(xí)基因重組與基因工程章節(jié)； 基因克隆基因克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳 物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然 的或人工的的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有自我接合成一具有自我 復(fù)制能力的復(fù)制能力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而，繼而 通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出

41、含有目的基因 的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一 D N A 分 子 ， 也 稱分 子 ， 也 稱 D N A 克 隆 或 重 組克 隆 或 重 組 D N A (recombinant DNA) 。 基因克隆示意圖基因克隆示意圖 載體DNA (限制性內(nèi)切酶切開)目的基因 宿主細(xì)胞 重組體 已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞 陽性克隆株 繁殖 表達 基因克隆基本原理基因克隆基本原理 基因克隆基因克隆操作過程：操作過程： 分分 分離目的基因分離目的基因 切切 限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體 接接 拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩 篩

42、選重組體篩選重組體 存在于細(xì)菌體內(nèi)的一類獨立于染 色體的自主復(fù)制的遺傳成分，在細(xì)胞 內(nèi)常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。 質(zhì)粒質(zhì)粒 開環(huán)開環(huán)DNA如果兩條鏈中有一條發(fā)生一 處或多處斷裂，分子因旋轉(zhuǎn)而消除鏈的 張力。 線狀線狀DNA如果兩條鏈均斷開，即為 線狀DNA。 質(zhì)粒DNA的一般特性 ： 質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，有相對獨立性質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，有相對獨立性 它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型 它是雙鏈閉合環(huán)狀它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等，分子量大小不等 質(zhì)粒DNA與宿主菌染色體DNA的兩點不同： 宿主菌染色體DNA通常

43、比質(zhì)粒 DNA要大得多 純化分離的宿主菌DNA多為線 性分子，而質(zhì)粒DNA呈閉合環(huán)的 形式。 是基因克隆(gene clone)的第一步（分離得 到轉(zhuǎn)運目的基因的載體）； 為基因重組(gene recombination)作準(zhǔn)備； 質(zhì)?？梢灾苯愚D(zhuǎn)化(transform)細(xì)胞； 為目的基因(target gene)的表達提供條件。 基因載體（基因載體（gene vector） 在細(xì)胞中能大量繁殖 polylinker 堿法抽提質(zhì)粒的主要溶劑 溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisCl組成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少 抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質(zhì) 粒. EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二

44、價金屬 離子,防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。 TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最 適PH范圍。 溶液：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成 SDS的作用是解聚核蛋白并與 蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性； NaOH的作用是破壞氫鍵，使 DNA分子變性。 溶液 由KAc與HAc組成 溶液能中和溶液的堿性， 使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞并 使質(zhì)粒DNA復(fù)性。 SDS堿裂解法制備質(zhì)粒堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理：的原理： 在有EDTA、溶菌酶及SDS存在的條 件下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的細(xì) 胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（染色體 DNA、蛋白質(zhì)和RNA等）。 高堿環(huán)境可以使細(xì)菌線性分子染色 體DN

45、A氫鍵斷裂，雙鏈解開變性，而質(zhì) 粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀的雙鏈并 不完全分離， 當(dāng)加入高濃度酸性鹽時，buffer中的 pH恢復(fù)至中性，并在有高鹽存在的條件 下：線性染色體DNA凝聚成不溶性沉淀 物；變性的蛋白質(zhì)與SDS形成的復(fù)合物 也形成沉淀；小分子的質(zhì)粒DNA卻呈天 然構(gòu)型，能溶解在buffer中，離心后可以 把線粒體DNA、不穩(wěn)定的大分子RNA、 蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。 實 驗 步 驟 及 注 意 事 項 加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm30S 除去上清，加入冰的100 l溶液I，顛倒EP管，混勻 加入200l溶液II，溫和混勻，冰浴35min 加入150l冰溶

46、液III，溫和混勻，冰浴35min， 12000rpm5min 轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿，12000rpm5min 上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻， -20 冰箱中放置20min，120005min 棄上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室溫靜置1015min ， 20 l TE 溶解DNA 雙酶切 （1人1份菌液） 雙酶切體系：雙酶切體系： ddH2O 6l 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l 合計合計 20l 混勻后，混勻后，37 孵育孵育1-2h 注意事項：注意事項

47、： 1、加樣槍正確使用； 2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒（pUC119-U6 ）； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干； 6、轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉淀； 7、吸取酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到皮 膚。 酶切鑒定 雙酶切反應(yīng) 單酶切反應(yīng) 電泳鑒定： 1. 1Agrose gel的制備 2. 上樣 3. 電泳（120V） 4. 紫外燈下觀察和拍照 點樣孔點樣孔 細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組DNA OC 型質(zhì)粒 型質(zhì)粒DNA L型質(zhì)粒 型質(zhì)粒DNA SC 質(zhì)粒 質(zhì)粒DNA 細(xì)菌細(xì)菌RNA 質(zhì)質(zhì) 粒粒 電電 泳泳 圖圖 譜譜 1 Kb ladder 2 Posi

48、tive clones digested with different restriction enzymes Empty vector Restriction mapping 常見問題： 1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過 程反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。 2、提取的DNA成涂布狀：操作過程中用力 過猛，動作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。 3、與染色體DNA分離不全；變性過程不完 全；試劑配置有問題。 思考題思考題 1. 1. 染色體染色體DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA分離的主要依據(jù)分離的主要依據(jù) 是什么？是什么？ 2. 2. 如果一個如果一個DNA DNA 酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)酶解液

49、在電泳后發(fā)現(xiàn) DNA DNA 未被切動未被切動, , 你認(rèn)為可能是什么原因你認(rèn)為可能是什么原因 3. 3. 瓊脂糖凝膠電泳中瓊脂糖凝膠電泳中DNA DNA 分子遷移率受分子遷移率受 哪些因素的影響？哪些因素的影響？ 實驗實驗: 1）重組質(zhì)粒的酶切鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）重組質(zhì)粒的酶切鑒定（瓊脂糖凝膠電泳p82） 2）紫外分光光度法檢測）紫外分光光度法檢測DNA含量（含量（p39） 內(nèi)容：內(nèi)容：1）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用；）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用； 2）分光光度技術(shù)原理與應(yīng)用）分光光度技術(shù)原理與應(yīng)用(P33) ； 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶是識別限制性核酸內(nèi)切酶是識別DNA的特異序列的特異序列,

50、并并 在識別位點或其周圍切割雙鏈在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)的一類內(nèi) 切酶。切酶。 【限制性內(nèi)切酶】 限制性內(nèi)切酶是DNA操作過程中所使用的基 本工具。限制酶特異性地結(jié)合于一段被稱 為限制酶識別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其 附近的特異位點上，并在此切割雙鏈DNA。 分子克隆中常用的為II類限制酶，其識別位 點長度為4、5或6個核苷酸的反向重復(fù)序列。 限制酶的切割點因酶而異，有些產(chǎn)生帶平 端的DNA片段，而另一些產(chǎn)生帶有粘性末端 的DNA。 pUC系列質(zhì)粒物理圖譜及酶切位點示意圖 BamH、Hind切割重組質(zhì)粒 作用作用 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修

51、飾系統(tǒng)，限制外源飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護自身保護自身DNA。 分類分類 、 （基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型） 第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫； 第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株；第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名命名 Hin d 屬屬 系系 株株 序序 Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶 類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)

52、構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG 平端切口平端切口粘端切口粘端切口 1、重組質(zhì)粒的酶切鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）、重組質(zhì)粒的酶切鑒定（瓊脂糖凝膠電泳） 1g 1g 瓊脂糖加入瓊脂糖加入100ml 1100ml 1TAETAE電泳緩沖液中，搖勻。在微電泳緩沖液中，搖勻。在微 波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到冷卻到6060，加入，加入 100l100l的的0.5mg/ml EB0.5mg

53、/ml EB或替代品，并搖勻。也可電泳完畢后或替代品，并搖勻。也可電泳完畢后 將膠浸于將膠浸于EBEB溶液中溶液中1010分鐘，爾后清水浸泡分鐘，爾后清水浸泡1010分鐘后紫外等分鐘后紫外等 下觀察下觀察） 將制膠板兩端安裝好，將制膠板兩端安裝好，插入適當(dāng)梳子插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖，將溶解的瓊脂糖 （約（約5050）倒入，室溫冷卻凝固）倒入，室溫冷卻凝固 充分凝固后，將凝膠置入電泳槽中，加充分凝固后，將凝膠置入電泳槽中，加1 1TAETAE電泳緩沖液電泳緩沖液 至液面覆蓋凝膠至液面覆蓋凝膠1-2mm1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。，小心垂直向上拔出梳子。 (4) (4) 用移液器吸取總

54、用移液器吸取總DNADNA樣品樣品10l10l于封口膜上，再加入于封口膜上，再加入2l 2l 的的6X6X載樣緩沖液，混勻后，載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔小心加入點樣孔。 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶，可見到溴酚藍(lán)條帶 由負(fù)極向正極移動，電泳約由負(fù)極向正極移動，電泳約30min-60min30min-60min。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩， 打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNADNA條帶。條帶。 瓊脂糖凝膠板的制備（封板

55、、梳子位置與高度、瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、 1%膠膠3mm、凝固后拔梳）凝固后拔梳） 電泳（電泳（6070mA 40min） 紫外檢測觀察結(jié)果紫外檢測觀察結(jié)果 倒緩沖液，加樣（倒緩沖液，加樣（取取PCR 反應(yīng)管中樣品液反應(yīng)管中樣品液10l直接上直接上 樣）樣） 點樣孔點樣孔 細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組DNA OC 型質(zhì)粒 型質(zhì)粒DNA L型質(zhì)粒 型質(zhì)粒DNA SC 質(zhì)粒 質(zhì)粒DNA 細(xì)菌細(xì)菌RNA 質(zhì)粒電泳圖譜質(zhì)粒電泳圖譜 1 Kb ladder 2 Positive clones digested with different restriction enzymes Empty

56、vector Restriction mapping 常見問題： 1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過 程反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。 2、提取的DNA成涂布狀：操作過程中用力 過猛，動作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。 3、與染色體DNA分離不全；變性過程不完 全；試劑配置有問題。 思考題思考題 1. 1. 染色體染色體DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA分離的主要依據(jù)分離的主要依據(jù) 是什么？是什么？ 2. 2. 如果一個如果一個DNA DNA 酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn) DNA DNA 未被切動未被切動, , 你認(rèn)為可能是什么原因你認(rèn)為可能是什么原因 3. 3. 瓊脂糖凝膠電泳中

57、瓊脂糖凝膠電泳中DNA DNA 分子遷移率受分子遷移率受 哪些因素的影響？哪些因素的影響？ 分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的 吸收光譜對其進行定性、定量分析的吸收光譜對其進行定性、定量分析的 實驗技術(shù)。實驗技術(shù)。 2、紫外分光光度法檢測DNA 分子醫(yī)學(xué)技能p39 特點特點 n靈敏度高靈敏度高：測定下限可達：測定下限可達10 5 10 6mol/L, n準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測定要求：能夠滿足微量組分的測定要求： 相對誤差相對誤差25 （12） n操作操作簡便快速簡便快速 n應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 吸光光度法是基于被測物質(zhì)的分子對光具有吸光光度法是基于被測物質(zhì)的分子對光

58、具有 選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。 光學(xué)光譜區(qū)光學(xué)光譜區(qū) 遠(yuǎn)紫外遠(yuǎn)紫外近紫外近紫外 可見可見近紅外近紅外中紅外中紅外 遠(yuǎn)紅外遠(yuǎn)紅外 （真空紫外）（真空紫外） 10nm200nm 200nm 380nm 380nm 780nm 780 nm 2.5 m 2.5 m 50 m 50 m 300 m 電磁波譜電磁波譜 氫燈氫燈 復(fù)合光復(fù)合光 (陽光及鎢燈陽光及鎢燈) 發(fā)射光譜發(fā)射光譜 紅紅 橙橙 黃黃 綠綠 青青 藍(lán)藍(lán) 紫紫 單色光單色光 三棱鏡三棱鏡 可見光分光光度計光源可見光分光光度計光源 紫外分光光度計光源紫外分光光度計光源 高高 低低 有關(guān)光學(xué)

59、原理有關(guān)光學(xué)原理 吸收光譜吸收光譜 在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液， 光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收 而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該 溶液的溶液的吸收光譜吸收光譜。 苯苯和和甲苯甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜在環(huán)己烷中的吸收光譜 苯苯 (254nm) 甲苯甲苯 (262nm) A 230 250 270 光吸收基本定律光吸收基本定律: Lambert-Beer定律定律 A=lg(I0/It)=kbc It I0 b dx I I-dI s 朗伯定律朗伯定律(1760)(1760

60、) A=lg(I0/It)=k1b 比爾定律比爾定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 吸光度吸光度 介質(zhì)厚介質(zhì)厚 度度(cm) Lambert-Beer定律定律 A或或DK C L 吸光度吸光度 摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù) 吸收物質(zhì)的光徑（吸收物質(zhì)的光徑（cm） 溶液濃度（溶液濃度（mol/L） 分光光度計的基本部件分光光度計的基本部件 光光 電電 1. 光源光源 分光光度計上常用的光源有兩種：分光光度計上常用的光源有兩種： 近紫外光區(qū)近紫外光區(qū) 可見光區(qū)可見光區(qū) 鎢絲燈鎢絲燈 近紅外光近紅外光 紫外光區(qū)紫外光區(qū) 氫燈氫燈 氘燈氘燈 2. 單色器單色器 單色器是把混合光波分解為單一波