鏈霉菌屬磷脂酶D的底物識(shí)別機(jī)制和縮醛磷脂的酶法測(cè)定匯編

1、鏈霉菌屬磷脂酶 D 的底物識(shí)別機(jī)制和縮醛磷脂的酶法測(cè)定Yusaku Matsumoto and Daisuke Sugimor*iDepartment of Symbiotic Systems Science and Technology, Graduate School of Symbiotic Systems Science andTechnology, Fukushima University,1 Kanayagawa, Fukushima 960-1296, JapanReceived 8 January 2015; accepted 28 February 2015Available

2、 online xxx摘要 本文研究了鏈霉菌屬磷脂酶 D 的底物識(shí)別機(jī)制和膽堿縮醛磷脂的酶法測(cè)定。 來(lái)自鏈霉 菌屬 NA684 菌株的磷脂酶 D（PLD 684）從培養(yǎng)的上層清夜中進(jìn)行純化，最終得到的酶比活 力提高了 184 倍，總活力的回收率為 23.7%。在 pH 為 5.0，溫度為 80時(shí)獲得對(duì) L- -溶血 卵磷脂（ LPC ）的最大水解活力。反應(yīng)混合物中 Triton X-100 的濃度對(duì)水解活力的影響十分 顯著。當(dāng)含有 0.05-0.5%和 0.1-0.2%（濕重 /體積）的 Triton X-100 時(shí)， 2-油酰 -1-棕櫚錫甘油 -3-磷酸膽堿 （POPC）和膽堿縮醛磷脂分別

3、被 PLD 684有效水解。 LPC 和膽堿溶菌酶縮醛磷脂不 需要 Triton X-100 ；當(dāng) Triton X-100 含量超過(guò) 0.05%時(shí)，水解活力反而被抑制。相比于脂質(zhì) 體單體底物，酶更優(yōu)先與混合膠束類底物結(jié)合， 1 小時(shí)內(nèi)對(duì)混合膠束底物的水解率達(dá)到 98.4%。動(dòng)力學(xué)分析表明，混合膠束POPC 和乳化的 LPC 水解反應(yīng)的速率限制步驟分別為bulk step 和 the surface step。這一結(jié)論表明， PLD 684在識(shí)別由于磷脂質(zhì)不同的頭部和尾部造 成具有不同物理性質(zhì)的底物時(shí)， 有至少兩種底物識(shí)別機(jī)制。 了解 PLD 684 如何識(shí)別底物類型， 對(duì)闡明自然中解脂蛋白的

4、作用是非常有用的。此外，我們還報(bào)道了利用PLD 684 和磷脂酶 B進(jìn)行酶法測(cè)定膽堿縮醛磷脂含量。這是第一次利用酶法測(cè)定膽堿縮醛磷脂含量。關(guān)鍵詞 鏈霉菌屬；磷脂酶 D；動(dòng)力學(xué)；函數(shù)式；底物識(shí)別；縮醛磷脂的測(cè)定前言 磷脂酶 D 催化 甘油磷脂中磷酸二之鍵的斷裂水解，形成磷脂酸和相應(yīng)的醇。一些 PLD 具 有轉(zhuǎn)酯活力。例如，在乙醇胺存在的環(huán)境下，卵磷脂（PC）轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺（ PE）。一些來(lái)自鏈霉菌屬（包括鏈霉菌 antibioticus ，鏈霉菌 cinnamoneum，鏈霉菌 halstedii ，鏈霉 菌 septatus 和鏈霉菌 PMF 菌株）的 PLD 已經(jīng)進(jìn)行了測(cè)序。這些 PLD

5、 都屬于 PLD 總科，顯 示出顯著的序列相似性，都含有兩個(gè)成為 HKD 基元的 HxKxxxxD 序列。 Leiros 等人做出來(lái) 了來(lái)自鏈霉菌屬 PMF 的 PLD 的晶體結(jié)構(gòu)。 PLDPMF 是一種單體蛋白質(zhì)：由兩個(gè)具有相似拓 撲結(jié)構(gòu)的域組成。晶體結(jié)構(gòu)和突變研究揭示了底物結(jié)合方式。然而， PLD 對(duì)膠束形式的底 物識(shí)別機(jī)制還不確定，只知道相比于單體底物， PLD 通常更傾向于與聚合形底物進(jìn)行結(jié)合。 之前的研究已經(jīng)說(shuō)明了 PLD 的活性取決于底物形式，例如脂質(zhì)體單體，乳化的脂質(zhì)體或混 合膠束底物。 PLD 在膠束型底物的界面處表現(xiàn)出最高的活性，與膠束形式和單體底物相比， PLD 對(duì)磷脂囊的

6、活性顯著降低。因此，底物的形式是決定酶活的關(guān)鍵。但是 PLD 是如何識(shí) 別底物形式的尚不清楚。為了清楚底物識(shí)別機(jī)制，對(duì)解脂蛋白提出了一個(gè)新看法。在當(dāng)前的研究中， 我們報(bào)道了來(lái)自鏈霉菌屬 NA684 菌株的磷脂酶 PLD 684對(duì)脂質(zhì)體單體， 乳化的脂質(zhì)體或混合膠束底物的水解活力。此外，我們演示了在有Triton X-100 時(shí)，對(duì)混合的 PC 膠束和乳化的 LPC 這種不同底物的識(shí)別機(jī)制和酶法測(cè)定膽堿縮醛磷脂。藥品及研究方法藥品 L-溶血卵磷脂，雞蛋（ LPC）， 1-十六?；?-2-油酰 -錫-丙三醇 -3-磷脂酰膽堿 （POPC），1-O-1-（Z）-油胺-2-羥基-錫-丙三醇 -3-磷脂

7、酰膽堿（膽堿溶血縮醛磷脂， LPLS-PC ）， 1-（ 1Z-油胺） -2-四烯酸 -錫-丙三醇 -3-磷脂酰膽堿（膽堿縮醛磷脂， PLS-PC）， 1-十六酰基 -2-油酰-錫-丙三醇 -3-磷脂酰乙醇胺 （POPE），1-O-1-（Z）-油胺-2-羥基-錫-丙三醇 -3-磷脂酰乙 醇胺（乙醇胺溶血縮醛磷脂， LPLS-PE ）， 1-（1Z-油胺） -2-四烯酸 -錫-丙三醇 -3-磷脂酰乙 醇胺（乙醇胺縮醛磷脂， PLS-PE），1-十六?；?-2-油酰-錫-丙三醇 -3-磷脂酰甘油（ POPG）， L-溶血磷脂酰乙醇胺（ LPE）， L-磷脂酰肌醇（ PI），產(chǎn)自雞蛋黃的鞘磷脂（ S

8、M），錫 -甘油-3-磷脂酰膽堿（GPC），細(xì)菌蛋白胨， Toyopearl Phenyl-650M ，HiTrap Q HP ，RESOURCE PHE 和 Mono S 色譜柱，膽堿氧化酶（ COD），過(guò)氧化物酶（ POD ）4-氨基安替比林， N， N-二（ 4-磺丁基） -3-甲基苯胺的二鈉鹽（ TODB ）重組的 PLD （PLD 684），其他藥品均為最 高級(jí)或分析級(jí)純。菌株，質(zhì)粒和培養(yǎng)條件 從日本福島的土壤樣本中分離出來(lái)鏈霉菌屬NA684 。NA684菌株在 28，5mL3%（濕重/體積）的 TSB 中培養(yǎng) 48小時(shí)，震蕩（160轉(zhuǎn)/分鐘）。在 500mL 錐形瓶中加入 100m

9、L3% （濕重 /體積）的 TSB 培養(yǎng)基，取 1mL 上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到此錐形瓶 中， 28搖床培養(yǎng) 48小時(shí)（ 180轉(zhuǎn)/分鐘）。大腸桿菌 HST08 感受態(tài)細(xì)胞作為基因克隆的宿主。 pGEM-T 載體和 pMD20-T 載體作為 載體。 重組的大腸桿菌細(xì)胞在 37下培養(yǎng)于 LB 瓊脂板上； 如果有必要， 可在瓊脂培養(yǎng)基中 加入安比西林， 異丙基 -D- 硫代半乳糖苷和 X- 半乳糖苷。 從生物資源中心獲得的變鉛青鏈 霉菌 1326（NBRC15675 ）作為 PLD684表達(dá)的宿主。 pUC702 作為表達(dá)載體。重組的鉛青鏈 霉菌細(xì)胞培養(yǎng)在含有 5g/mL 硫鏈絲菌素的 3%（濕重 /體積

10、）的 TSB 中， 28搖床培養(yǎng) 48 小時(shí)（ 180 轉(zhuǎn)/ 分鐘）。PLD 684的純化 所有程序都在 4下進(jìn)行。培養(yǎng) 48小時(shí)后，通過(guò)離心分離獲得上清液 （18800xg,10min ）。產(chǎn)生的上清液置于含有 A緩沖液（ 20mMTtis-HCL 緩沖液， pH8.0 ）的80% 硫酸銨溶液中 . 4下培養(yǎng) 2小時(shí)，離心分離收集沉淀（ 18800g，10min ）。對(duì)酶樣品進(jìn)行離 心（ 21800g，10min）除去不可溶物質(zhì)。為了獲得上清液，將硫酸銨加到1M ，并將這個(gè)樣品加入到 toyopearl苯基 -650M的柱子（ 2.5 3.5cm）中，用含有 1M（NH 4）2SO4的A緩沖

11、液進(jìn)行 平衡。柱子用相當(dāng)于 3倍柱體積的 1M（NH 4）2SO4/ 緩沖液，流速為 10 mL/min （2 cm/min） 進(jìn)行洗 脫。收集有效部位， 此時(shí)，緩沖液換為緩沖液 B（20 mM TriseHCl, pH 9.0） ，裝載到 1mL的Mono Q色譜柱中，并用緩沖液 B進(jìn)行平衡。過(guò)完柱子之后洗三遍 （3CV），以1 mL/min 含有0-1M NaCl 的緩沖液 B線性洗脫蛋白質(zhì) （20CV） 。收集活性部位，緩沖液換為 1M （NH 4）2SO4/緩沖液 A，樣 品裝載到 1 mL的RESOURCE PHE 色譜柱中，并用1M （NH 4）2SO4/緩沖液A進(jìn)行平衡。過(guò)完柱

12、子之后洗三遍（ 3CV ），以2 mL/min含有0.1-0.2 M （NH 4）2SO4的緩沖液 B線性洗脫蛋白質(zhì) （40CV） 。收集活性部位，緩沖液換為 C（20 mM MES-NaOH ，pH 6.0），樣品裝載到 1 mL的 Mono S色譜柱中 , 并用緩沖液 C進(jìn)行平衡。過(guò)完柱子之后洗三遍（ 3CV），以 1 mL/min 含有 0-0.5 M NaCl 的緩沖液 C線性洗脫蛋白質(zhì) （40CV） 。收集表現(xiàn)出高比活的部分進(jìn)一步研究。PLD活性的檢測(cè) 包含50mM醋酸鹽緩沖液 （ pH5.6 ），0.8mMLPC 和10% （vol/vol） 酶液的 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定混合物（ 50L ），

13、 65培養(yǎng)下 5 min，加熱到 100， 5min終止反應(yīng)。離心分離之后 （21800g，1min），200L包含0.03%4- 氨酰安替比林， 0.02%TODB，0.75U/mLCOD和5U/mLPOD 的比色溶液加入到酶反應(yīng)混合物中，來(lái)測(cè)定酶促反應(yīng)釋放膽堿的濃度。一個(gè)單元（U ）的酶活定義為磷脂底物每分鐘釋放 1mol 膽堿。pH和溫度對(duì) PLD活性的影響 用不同緩沖液（醋酸鹽， Bis-Tris-HCl, Tris-HCl 和甘氨酸 -NaOH ）來(lái)研究 pH對(duì)酶活和穩(wěn)定性的影響。在具有 0.8mM LPC 的50 mM 緩沖液中， 37下 培養(yǎng)5min來(lái)確定最適酸堿度酸堿穩(wěn)定性鑒定

14、。 通過(guò)4下， 45 mM 緩沖溶液中培養(yǎng)酶 12小時(shí)。 60下，在pH為5.0的具有 0.8mM LPC的50 mM醋酸鹽緩沖液中培養(yǎng) 5min，測(cè)量殘留的酶活。 在pH為5.0的具有0.8mM LPC 的50 mM 醋酸鹽緩沖液中5m培in，養(yǎng)在每個(gè)溫度下測(cè)量酶活確 定最適溫度。將50 酶mM在，HEPES-NaOH（pH7.5）中，各溫度下60m培in養(yǎng)來(lái)測(cè)定其熱穩(wěn) 定性，60下，p在H為5.0的具有0.8mM LPC的50 mM醋酸鹽緩沖液中5m培in，養(yǎng)測(cè)量殘留 的酶活。所有實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次。底物專一性 存在不同濃度 Triton X-100 的條件下，研究酶對(duì)膽堿磷脂質(zhì)的底物專一性

15、 （POPC,LPC,PLS-PC和LPLS-PC ）。在37下，在具有不同濃度 Triton X-100 的 pH為5.0的具 有0.8mM底物的50 mM醋酸鹽緩沖液中5m培in ，養(yǎng)測(cè)定酶活。研究磷脂質(zhì)頭部基團(tuán)對(duì)水解（活PO力PC的,PO影PE響,POPG和PI）。酶促反應(yīng)37在下， 在具有609 ng-蛋白質(zhì)/mL（2 .27mU）的純PLD 684（LPC 372 U/mg- 蛋白質(zhì) ），含有15.9mMTriton X-100的5mM混合膠束底物或含有脂質(zhì)體底物的 50mM pH 為5.0醋酸鹽緩沖液，反應(yīng) 5min。 反應(yīng)混合物中的剩余底物（ 100 L ），用400L體積比2為

16、:1的氯仿-甲醇溶液萃取。氯仿相蒸 發(fā)掉之后，將剩余的物2質(zhì)0L溶體解積在比4為:1的氯仿-甲醇溶液中，多余的磷脂質(zhì)用 Inertsil NH2 柱子分離，并用高效液相色譜在 215nm處檢測(cè)。洗脫劑用乙醇： CH3CN ：10 mM NH4H2PO4 （體積比為 50:40:10，pH 5.8）。柱子保持 40，泵的運(yùn)行流速為 0.4 mL/min 。所有 實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次。動(dòng)態(tài)光散射分析 如POPC和LPC等底物與 Triton X-100 作用形成混合膠束或乳化劑。 基 于DLS ，其粒徑分布通過(guò)粒度分析儀進(jìn)行測(cè)量。 DLS測(cè)量在 37下進(jìn)行，膠束粒徑分布通過(guò) SZ-100Z計(jì)算設(shè)備進(jìn)行

17、分析。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué) 純化的酶用來(lái)做穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析。對(duì) POPC的水解，酶促反應(yīng)的初速度由 POPC/ Triton X-100 （1:3）的濃度決定。酶濃度恒定為 60.9 ng-蛋白質(zhì)/mL。對(duì)LPC的水解， 酶促反應(yīng)的初速度由不含 Triton X-100 的LPC濃度決定。酶濃度恒定為 244 ng-蛋白質(zhì)/mL 。 LPC的濃度（LPC ）以分子量503為.33進(jìn)行計(jì)算。酶促3反7應(yīng)下在50 mM 醋酸緩沖液中 （pH 5.0 ）進(jìn)行5min 。動(dòng)力學(xué)參Km數(shù), Vmax 和kcat由米氏方程對(duì)不同濃度 POPC和LPC初速 度的非線性數(shù)據(jù)決定。 PLD 684的kcat值以一個(gè)單體蛋白

18、質(zhì)和一個(gè)活性中心分子量為54000進(jìn)行計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次。蛋白質(zhì)分析 蛋白質(zhì)濃度以 BSA作為標(biāo)樣，用雙鋅丁酸蛋白質(zhì)分析法測(cè)定。純PLD 684的分子量通過(guò)和藍(lán)色聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分析， 估計(jì)。排阻色譜利用一個(gè) Superdex 200 10/300 GL的柱子， 將含有0.15 M NaCl 的20 mM Tris-HCl （pH 8.0）以0.5mL/min的流速通入。 色譜柱用標(biāo)準(zhǔn)蛋白凝膠過(guò)BN濾-P校AGE準(zhǔn)和。SDS-PAGE 分析分別按廠家說(shuō)明進(jìn)行操作。 在氨基酸序列內(nèi)部，蛋白質(zhì)離開 SDS-PAGE 凝膠，被胰蛋白酶消化，根據(jù) Shevchenko等人 的方法，對(duì)獲

19、得的氨基酸進(jìn)行萃取。萃取出來(lái)的氨基酸，根據(jù)之前報(bào)道的方法，利用 nano Acquity UPLC BEH130 C18 和Xevo QTOF MS 色譜柱進(jìn)行分析。PLD 684基因的克隆鏈霉菌屬 NA684 菌株的染色體 DNA ，根據(jù) Pospiech和 Neumann，通過(guò)鹽析法進(jìn)行純化。兩分子引物 （S1; 5-cccaccccscayctg-3和A1; 5 -ccasgcsgggtagaggttc-3） 是基于 PLD 684內(nèi)部氨基酸序列設(shè)計(jì)和合成的。首次 PCR反應(yīng)混合液（ 50 L）組成K為OD FX Neo, 20 nmol dNTPs, 每種引物 15 pmol, KOD

20、 FX Neo DNA 聚合酶 1 U的 1PCR緩沖液以，30 ng的染色D體NA 作為模板PC。R的兩步9在8,10 s和68，1.3 min 下循環(huán)30次。獲得的DNA 碎片（1.3kbp）被克隆pG到EM-T Easy載體上，產(chǎn)生的重組質(zhì)粒稱為 pPAT 。為了揭示 PLD 684 ORF編碼的完整序列，基于 PLD 684中的 pPAT的部分序列，設(shè)計(jì)上游引物 IS1 （5-ggggatcacattgaggtgatagagaggcgc-3） 和下游引物 IA1 （5 -atctcgcagcaggacatgaacgcgacctgc-3） 這兩種反向 PCR引物?；蚪M DNA （2.4

21、 g）被Sac I和selfligated消化了。反向 PCR反應(yīng)混合 液（50 L）組成K為OD FX Neo, 20 nmol dNTPs, 每種引物 15 pmol, KOD FX Neo DNA 聚合 酶1 U的1PCR緩沖液，1以00 ng的Sac I-digested和self-ligated DNA 作為模板。P反CR向的 兩步在98,10 s和68，4 min 下循環(huán)20次。獲得的DNA 碎片（3kbp）被克隆p到GE M-T Easy 載體上，產(chǎn)生的重組質(zhì)粒稱為 pINV 。為了克隆完整的 PLD 684基因，用到了兩種克隆引物： 上游引物 SE1 （5-gcgggagccg

22、ataccttctg- 3和）下游引物 AN1（5-gcgcccgcgccccgtccgc- 3， ）都是基 于PLD 684內(nèi)部pINV的序列設(shè)計(jì)和合成的。 染色體的 PCR反應(yīng)混合液（50 L）組成為KOD FX Neo, 20 nmol dNTPs, 每種引物 15 pmol, KOD FX Neo DNA 聚合酶 1 U的1PCR緩沖液，以30 ng的染色體 DNA 作為模板。提純獲得的 DNA 碎片，使用 pMD20-T vector 直接測(cè)序，產(chǎn)生的 重組質(zhì)粒稱為 pPLD。核苷酸和多肽序列檢索號(hào) 鏈霉菌屬 NA684菌株的 16S rDNA核苷酸序列和 PLD 684基 因，儲(chǔ)存

23、在 DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中，其檢索號(hào)分別為 AB738936和AB771745 。重組PLD 684的表達(dá)及純化不具有PLD活性的S鉛青鏈霉菌 1326 （NBRC15675） 被用作PLD684胞外生產(chǎn)的載體。利用如下引物實(shí)現(xiàn) PCR：5-ctagctagcgcggacaccccgcccac-3（N he1pld） 和5-gaagatcttcagccggccccgttgc-3（p ldBgl2） ，成熟的 PLD 684包含N-端密碼子 （Nhe I, single underline; Ala, italics） 和結(jié)束子 （Bgl II, single underline; stop codo

24、n, italics） 。 PCR反應(yīng)混合液 （50 L）組成為 KOD FX Neo, 20 nmol dNTPs, 每種引物 15 pmol, KOD FX Neo DNA 聚合酶 1 U的1PCR緩沖液，以 30 ng的pPLD作為模板。熱循環(huán)參數(shù)為 94 ,2min ，然后在 98,10 s 和68， 1.5 min下循環(huán) 25次。對(duì)獲得的 DNA碎片進(jìn)行純化，并用 Nhe I和Bgl II 消化。信號(hào)肽 序列和來(lái)自鏈霉菌屬 cinnamoneumPLD的終止子。對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并命名為 pUC702/pld 。對(duì)S鉛青鏈霉菌的改造技術(shù)借鑒于 Bibb和Thompson等人的

25、方法。使用乳化的卵 磷脂營(yíng)養(yǎng)基篩選搭載了 pUC702/pld的轉(zhuǎn)化株。克隆的一個(gè)不足之處是收集， 在5mL的培養(yǎng)液 中選擇出活性最高的個(gè)體。利用改造的S鉛青鏈霉菌生產(chǎn)重組 PLD 684，通過(guò)硫酸銨（ 80%飽和）沉淀法，從 72小時(shí)的培養(yǎng)上清液中對(duì)其進(jìn)行提純，并用Toyopearl Phenyl-650M 和RESOURCE Q色譜柱進(jìn)行柱層析。PLD 684的同源建模從序列信息中， PLD 684起催化作用的 HKD 基元與已經(jīng)獲得結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的PLD PMF保留了高度一致性（ 73.0%）?；谝粋€(gè)模板，利用 HHPRED 和Modeller 9.11進(jìn) 行PLD 684的同源建模。 VE

26、RIFY3D 用來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)計(jì)模型的可靠性，它表明72.6%的氨基酸殘基具有3D-1D的得分。使用PLD 684和PLB 684酶法測(cè)量縮醛磷脂含量首先，包含 POPC, LPC, SM 和PLS-PC的磷脂混合物被 PLD 684水解，如下：反應(yīng)混合物（ 35L）中含有 1.14 mM POPC, 1.14 mM LPC, 1.14 mM SM 和0-0.571 mM PLS-PC,0.357% Triton X-100 ，28.6 mM Tris-HCl （pH 8.0） 和11.2 U PLD 684（比活力： 800 U/mg-蛋白質(zhì)）， 37下培養(yǎng) 10min。然后加熱滅活（ 100,5

27、min）， 10 L 0.2 M 醋酸鹽緩沖液和 2.35U PLD684加入到上述反應(yīng)混合物中（總共 50L）。37下反 應(yīng)10 min 。釋放膽堿的濃度由上述提到 PLD測(cè)活方法決定。結(jié)果PLD 684的純化胞外的 PLD 684用電泳法從 48小時(shí)培養(yǎng)液中進(jìn)行提純（圖 S1）。表1總結(jié)了PLD 684純化的結(jié)果。純化的PLD684的比活力為 372 U/mg-蛋白質(zhì)，從培養(yǎng)上清液中（265mL） 提純出來(lái)的酶總量達(dá)到 244 g。pH和溫度對(duì) PLD 活性的影響如圖1A和B所示，在 LPC水解過(guò)程中的最高酶活，是在80， pH 5.0，不存在Triton X-100 的條件下。在 4，p

28、H 4.0到10.5之間時(shí)，酶活維持 12小時(shí) （圖1A）。酶在 4-55之間， pH 5.0時(shí)穩(wěn)定（圖 1B）。蛋白質(zhì)分析SDS-PAGE 分析表明， 純化的酶表現(xiàn)為 54kDa的單頻帶 （圖S1）。排阻色譜法和 PAGE分析法說(shuō)明了， PLD 684為單體蛋白質(zhì)。通過(guò) LC-MS/MS 分析確定了 25個(gè)多肽。 選擇這兩個(gè)肽序列： ADTPPTPHLD 和 KNLYPAWLQD 設(shè)計(jì)為 PCR的引物。底物專一性 對(duì)膽堿磷脂質(zhì)的底物專一性由不同 Triton X-100 濃度決定（圖 2和表2）。 Triton X-100 濃度在 0.05-0.25% （wt/vol） 之間時(shí)， POPC和

29、 PLS-PC 被有效水解。有趣的是，在 Triton X-100濃度不超過(guò) 0.005% （wt/vol） 時(shí)，溶血磷脂， LPC和LPLS-PC 被有效水解。 Triton X-100濃度對(duì)水解活力影響顯著。 每種類型的磷脂底物水解都有最適的 Triton X-100 濃度。相 反，在任何 Triton X-100 濃度下， PLD684對(duì)SM和GPC無(wú)活性。不同雙?；视土姿狨サ乃?率如圖 3所示。相比于脂質(zhì)體單體底物， PLD 684優(yōu)先與混合膠束型底物結(jié)合， PLD684對(duì)混合 膠束 POPC表現(xiàn)出最高的水解率（ 98.4%）。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)以POPC或LPC為底物時(shí)， 酶促反應(yīng)遵循標(biāo)

30、準(zhǔn)的米氏動(dòng)力學(xué) (圖4)。POPC或 LPC 水解的表觀 Km (Km(app), Vmax (Vmax(app) and kcat (cat(app) 值分別為 0.271和 0.0513 mM； 4.44和0.270 mmol min -1mg蛋白質(zhì) -1;；4.0103和2.43102 s-1。PLD 684對(duì)混合 膠束 POPC (kcat(app)/Km(app) =1.48 104 s-1mM -1)的催化效率為乳化的PLD 684基因的核苷酸序列PLD 684基因編碼的核苷酸序列由基因組 PCR生產(chǎn)的 1.7 kbp的序列決定。 PLD的ORF包含 538個(gè)氨基酸殘基的 1617

31、bp的編碼蛋白，從罕見的 ttg起始 密碼子開始， 其與位于下游的終止密碼子 tga有相同的框架和核糖體結(jié)合位點(diǎn)， gaagg（圖 S2）。預(yù)測(cè)信號(hào) P展示了活化型 PLD 684的N端氨基酸直接從推導(dǎo)出的氨基酸的Ala1 處開始，表明開始的 30個(gè)氨基酸殘基代表了 Sec信號(hào)肽序列（圖 S2）。同源研究由 BLAST 算法實(shí)現(xiàn)， 表明成熟 PLD684的氨基酸序列與鏈霉菌屬 antibioticus 產(chǎn)的PLD具有89%的同一性。PLD 684的表達(dá)、純化和表征胞外PLD 684的高效生產(chǎn)已經(jīng)在經(jīng)過(guò) 表達(dá)載體 pUC702/pld改造過(guò)的 S鉛青鏈霉菌細(xì)胞中得以實(shí)現(xiàn)。在培養(yǎng)上清液中PLD的比

32、活力（ 9.6 U/mg-蛋白質(zhì)）是野生型菌株 （2.0 U/mg-蛋白質(zhì) ）的4.8倍。利用電泳法從 265mL的培養(yǎng)上清液中通過(guò)簡(jiǎn)單的純 化步驟將具有高的比活力 （384 U/mg- 蛋白質(zhì)）和高產(chǎn) （4.98 mg-蛋白質(zhì)）的重組 PLD 684提純 出來(lái)。在磷脂混合物中縮醛磷脂的酶法測(cè)量如圖 5所示，可看出，膽堿濃度與反應(yīng)混合物中PLS-PC的濃度有關(guān)，當(dāng)磷脂混合物中 PLS-PC的濃度在 0-0.4 mM時(shí)，兩條校正曲線均為線 性，其回歸線可分別用方程 y=0.00231x+0.169 （R 2=1）和 y=0.00200x+0.0830（R 2=0.992）表示。 校正曲線可能適用

33、于如血樣等粗樣本，監(jiān)測(cè)的敏感度可能適用于檢測(cè)血漿中的 PLS-PC 的濃 度(其濃度已經(jīng)通過(guò)放射性碘 (125I-3)的高效液相色譜法測(cè)得( 50-100 M )。這種酶法可以 非常簡(jiǎn)便的測(cè)得縮醛磷脂的含量，并且可以高通量的篩查血樣。討論酶純化的結(jié)果表明 PLD 684在培養(yǎng)上清液的總蛋白質(zhì)含量中占很高的比率。鏈霉菌屬NA684是一種很好的生產(chǎn)具有催化活性的 PLD的菌株。此外，我們利用 鉛青鏈霉菌細(xì)胞 成功 的獲取了高效的胞外 PLD684。PLD684產(chǎn)品達(dá)到 16.3 mg/L- 培養(yǎng)液。使用PC/Triton X-100 混合膠束來(lái)研究 LPC的水解活力， PLD 684的最適 pH為

34、5.0，這一 pH 也適合其他鏈霉菌屬 PLD ( pH5.5-6.0 )。最適溫度 80，比其他鏈霉菌屬 PLD (60 )高出 很多。不含 Triton X-100 的LPC進(jìn)行乳化處理獲得乳狀液。然而， Triton X-100 在63-69具有 濁點(diǎn)，在混合膠束溶液中，底物狀態(tài)受以上濁點(diǎn)溫度的影響。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下， Triton X-100 的濁點(diǎn)與酶活無(wú)關(guān)。據(jù)報(bào)道，鏈霉菌屬tendaePLD 和鏈霉菌屬 olivochromogenesPLD分別在 70和75下穩(wěn)定。 另一方面， PLD 684在4培養(yǎng) 12小時(shí)，pH在4.1-10.5之間時(shí)穩(wěn)定。 在55下培養(yǎng) 1小時(shí)，

35、pH在7.5左右時(shí)穩(wěn)定；然而， 65下 pH7.5時(shí)培養(yǎng) 1小時(shí)，相對(duì)活力降到 1%以下，說(shuō)明酶在高溫下非常不穩(wěn)定。磷脂酶對(duì)脂質(zhì)體的底物特異性之前也有過(guò)報(bào)道。另一方面，通常利用Triton X-100 來(lái)刺激鏈霉菌屬磷脂酶的活力。膠束的大小可能是鏈霉菌屬磷脂酶進(jìn)行底物識(shí)別的一個(gè)重要因 素。當(dāng)前的研究， PLD 684高效水解雙?；字|(zhì) / Triton X-100 混合膠束， 說(shuō)明了 Triton X-100 可以增強(qiáng) PLD684-POPC（ES） 絡(luò)合物的形成，也說(shuō)明了水解反應(yīng)符合表面約束模型。在表面約 束模型中，水溶性酶（ E）首先和混合膠束 POPC（M ）形成酶 -混合膠束復(fù)合物（

36、 EM ，速率 控制步驟）。相反，在磷脂約束模型中，對(duì)乳化的 LPC膠束水解，酶結(jié)合到 LPC 分子表面。 這兩者都有平衡步驟， 酶快速結(jié)合在膠束表面， 然后其活性部位與磷脂底物分子結(jié)合， 隨后 使底物分子水解。PLD 的催化機(jī)理已經(jīng)被研究了，眾所周知，它有兩個(gè)以 HKD 基元作為催化劑基團(tuán)的組 氨酸殘基。因此， POPC和 LPC在與酶形成 ES復(fù)合物之后，通過(guò)相同的催化機(jī)制，它們的兩 個(gè)組氨酸殘基被催化水解。 然而， 相比于單體， PLD 通常優(yōu)先水解聚合的底物， 如混合膠束， 乳濁液，微脂囊。因此，如圖 6所示，研究 PLD形成EM 或EL復(fù)合物和 ES復(fù)合物的連續(xù)反應(yīng) 催化步驟非常重要

37、。然而，在 PLD 和混合膠束或乳化的磷脂質(zhì)的親和力以及ES的形成率還沒有確切研究出來(lái)， 也沒有關(guān)于速率限制步驟的報(bào)道。 在本研究中， 我們通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分 析了 Km和kcat的值。我們假設(shè) kcat的值反映了平衡步驟的速率。與混合膠束POPC水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù) （Km= 0.271 mM,Kcat=4. 0103 s-1）相比，乳化的 LPC水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù) （Km= 0.0513 mM,Kcat=2.43 102 s-1）要小得多。說(shuō)明相比于混合膠束 POPC，PLD684對(duì)乳化的 LPC具有高 的親和性和低的轉(zhuǎn)換數(shù)。從這一結(jié)論可以得出，對(duì) POPC/ Triton X-100 混合膠束水

38、解的速率限制步驟應(yīng)該為結(jié)合步。 反之，對(duì)乳化的 LPC 水解過(guò)程的速率限制步驟應(yīng)該為表面反應(yīng)步驟。 此外，表面約束模型中 PLD 684識(shí)別混合膠束 POPC，脂質(zhì)體約束模型中 PLD 684識(shí)別乳化的 LPC。因此， 我們得出結(jié)論： PLD684是通過(guò)不同的機(jī)制識(shí)別混合膠束 POPC和乳化的 LPC的。 因此， PLD 684應(yīng)該具有兩種或兩種以上的底物識(shí)別機(jī)制。這一方法有助于研究酶對(duì)不同形式的底物的親和力和 ES的形成率。PLD 684的信號(hào)肽具有一個(gè)典型的 Sec信號(hào)序列，表明 PLD 684通過(guò)分泌機(jī)制進(jìn)行分泌。此 外，分泌物通過(guò)轉(zhuǎn)化路徑不需要 R-R-x- -雙 -精氨酸 氨基酸基元

39、。磷脂酶 Cs和C型酶通 過(guò)Tat-體系進(jìn)行分泌，除此之外，大多數(shù)鏈霉菌屬磷脂酶通過(guò)Sec-體系進(jìn)行分泌。眾所周知， 磷脂酶 D源于酵母， 植物和哺乳類動(dòng)物， 都具有兩個(gè) HxKxxxxD 基元。 PLD 684 也包含兩個(gè) HxKxxxxD 基元 （168HSKLLVVD 175和 441HHKLVSVD 448）。人們認(rèn)為這些保守殘基 形成催化磷酸雙酯鍵的水解和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的活性部位。 推導(dǎo)出的 PLD684與 SaPLD的氨基酸序列 具有 89%的同一性，與其他鏈霉菌屬 PLD 也具有相當(dāng)高的同一性（ 70% ）。此外，同源建 模的研究說(shuō)明 PLD 684的結(jié)構(gòu)與 PLDPMF非常類似（圖

40、S4）。關(guān)于序列同一性 30%的蛋白質(zhì)， 公認(rèn)其結(jié)構(gòu)和功能具有類似性。 事實(shí)上，PLD 684的最適pH與其他 PLD相類似。因此我們認(rèn)為，底物識(shí)別機(jī)制也是保守的，因此那些已知的PLD ，就會(huì)像 PLD 684一樣，也優(yōu)先結(jié)合POPC/Triton X-100 的混合膠束和乳化的 LPC。不幸的是， 其他 PLD的底物識(shí)別機(jī)制還未見報(bào) 道。最近， PLD作為診斷劑備受關(guān)注。例如， Morita 等人報(bào)道了利用鏈霉菌屬 chromofuscus 產(chǎn)PLD 酶法測(cè)量磷脂酰絲氨酸。還有報(bào)道稱縮醛磷脂含量與癡呆和癌癥等疾病有關(guān)，因此， 縮醛磷脂可以作為這些疾病的生物標(biāo)記物。 目前，血樣中縮醛磷脂的含量

41、可以通過(guò)高效液相 色譜和液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定。但其程序復(fù)雜，耗時(shí)。因此，人們想要一種能簡(jiǎn)便 迅速確定縮醛磷脂含量的方法。我們通過(guò)以下酶法，測(cè)定了磷脂混合物中PLS-PC的含量。首先 PLD684將POPC和LPC水解為 GPC和脂肪酸，然后從 PLS-PC中釋放出膽堿。膽堿的濃度 測(cè)定利用傳統(tǒng)的 COD 和POD比色測(cè)定。盡管對(duì) PLS-PC的線性校正曲線(在存在或不存在 POPC， LPC 和 SM的情況下)是通過(guò)酶法獲得的，存在磷脂混合物時(shí)，曲線在y軸的截距顯著高于磷脂混合物不存在的情況。然而，兩條曲線都呈現(xiàn)幾乎相同的斜率，A550的值對(duì)應(yīng)PLS-PC 。正如 PLD 684水解

42、 POPC，反應(yīng)相當(dāng)不完全， 通過(guò)PLD 684使多余的膽堿從殘余的 POPC 中釋放出來(lái)。 然而，我們認(rèn)為這兩種校正曲線也許對(duì)粗樣中 PLS-PC 的確定有所幫助。 我們 的酶法不使用放射性 125I和昂貴的分析儀，能夠?qū)﹃P(guān)于 PLS-PC的疾病進(jìn)行高通量的篩選。這 是第一個(gè)報(bào)道描述酶法測(cè)量 PLS-PC的文章，縮醛磷脂作為癡呆和癌癥的生物標(biāo)記物，利用 這一方法能夠簡(jiǎn)便的測(cè)定其含量，有利于盡早發(fā)現(xiàn)這些疾病。文章的補(bǔ)充數(shù)據(jù)在線網(wǎng)址 /10.1016/j.jbiosc.2015.02.020 。鳴謝感謝日本的 Asahi Kasei制藥公司提供的膽堿氧化酶， Ch

43、iaki Ogino 副教授提供的表達(dá)載 體。感謝日本科技廳對(duì)本研究的大力支持，以及Takahashi工業(yè)和 經(jīng)濟(jì)研究基金會(huì)提供的科研補(bǔ)助金。References1. Damnjanovic, J. and Iwasaki, Y.: Phospholipase D as a catalyst: application in phospholipid synthesis, molecular structure and protein engineering, J. Biosci. Bioeng., 116, 271e280 (2013).2. Iwasaki, Y., Nakano, H.,

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