PCR技術(shù)及其應用

1、生物化學實驗技術(shù) 多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應 PCR是由美國科學家是由美國科學家 體內(nèi)體內(nèi)DNADNA的復制體系的復制體系 引物引物 引物引物 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合酶 Saiki（1988）將耐熱）將耐熱DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。模板可行。 PCR反應循環(huán)反應循環(huán) dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：模板：DNA 引物：引物：P1 +P2 DNA聚合酶：聚合酶：TaqE 原料：原料：dNTP 反應緩沖液反應緩沖液10 xBu

2、ffer 輔助因子：輔助因子：Mg2+ 單、雙鏈單、雙鏈DNADNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制劑、聚合酶抑制劑、DNADNA 結(jié)合蛋白類。結(jié)合蛋白類。 DNADNA模板一般模板一般100ng /100100ng /100 L L。 模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 濃度過高易導致模板與引物錯配濃度過高易導致模板與引物錯配, ,反應特異性下降。反應特異性下降。 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反應特異性下

3、降酶量增加使反應特異性下降; ;酶量過少影響反應產(chǎn)量。酶量過少影響反應產(chǎn)量。 dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度濃度取決于擴增片段的長度 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入, ,濃度過低則降低濃度過低則降低 反應產(chǎn)量反應產(chǎn)量 dNTPdNTP可與可與MgMg2 2+ +結(jié)合結(jié)合, ,使游離的使游離的MgMg2+ 2+濃度下降 濃度下降, ,影響影響DNADNA 聚合酶的活性。聚合酶的活性。 Mg2+ Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激活劑。濃度為聚合酶的激活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L0.5-2.5mmol/L。 Mg2+Mg2+濃度過低會使?jié)舛冗^低

4、會使TaqTaq酶活性喪失、酶活性喪失、PCRPCR產(chǎn)量下降；產(chǎn)量下降； Mg2+Mg2+過高影響反應特異性。過高影響反應特異性。 Mg2+Mg2+可與負離子結(jié)合可與負離子結(jié)合, ,所以反應體系中所以反應體系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等等 的濃度影響反應中游離的的濃度影響反應中游離的Mg2+Mg2+濃度。濃度。 使雙鏈使雙鏈DNADNA解鏈為單鏈解鏈為單鏈 9494， 30-60 30-60秒秒 溫度由引物長度和溫度由引物長度和GCGC含量決定。含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合; ;降降 低溫度可增加反應的靈敏性。低溫度可增加反

5、應的靈敏性。 Tm =（G+C）x 4 + （A+T）x 2 70-75,70-75,一般為一般為7272 延伸時間由擴增片段長度決定延伸時間由擴增片段長度決定 主要取決于模版主要取決于模版DNADNA的濃度的濃度 一般為一般為25-3525-35次次 次數(shù)過多：擴增效率降低次數(shù)過多：擴增效率降低 錯誤摻入率增加錯誤摻入率增加 1 1、特定、特定DNADNA片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離 或制備?；蛑苽?。 A A、DNA BDNA B、cDNAcDNA 2 2、基因表達分析（原位、離體）、基因表達分析（原位、離體） A A、基因是否表達、基因是否表達 B

6、B、基因表達水平高低、基因表達水平高低 3 3、基因突變、基因突變 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 聚合酶聚合酶 mRNA cDNA 雜交雙鏈雜交雙鏈 PCRPCR擴增擴增 1. 1. 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理 后便適于一般后便適于一般PCRPCR試劑（包括引物和試劑（包括引物和TaqTaq酶）進入酶）進入 2. PCR2. PCR擴增細胞內(nèi)目的片段擴增細胞內(nèi)目的片段 3. 3. 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物原位雜交檢測擴增產(chǎn)物 A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針, ,

7、對對 PCRPCR產(chǎn)物進行標記跟蹤產(chǎn)物進行標記跟蹤, ,實時在線監(jiān)控反應過程實時在線監(jiān)控反應過程, ,結(jié)合結(jié)合 相應的軟件可以對結(jié)果進行分析相應的軟件可以對結(jié)果進行分析, ,計算待測樣品的初計算待測樣品的初 始模板量。始模板量。 I 53 53 SG SG SG SG SG Excitation Emission 用反向的互補引物來擴增兩引物以外的用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNADNA片段，片段， 對某個已知對某個已知DNADNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 實時熒光定量實時熒光定量PCR儀儀 梯度梯度PCR儀儀 普通普通PCR儀儀 1 1、材料：含、材料：

8、含0.3Kb0.3Kb插入片段的克隆載體插入片段的克隆載體 2 2、儀器：微量移液器及吸頭、儀器：微量移液器及吸頭、PCRPCR儀及儀及PCRPCR 管管 瓊脂糖凝膠電泳設備瓊脂糖凝膠電泳設備 3 3、試劑：、試劑：1010X XPCRPCR 反應緩沖液反應緩沖液 25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP 10mmol/L dNTP 10mol/L 10mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2 二、實驗材料、儀器和二、實驗材料、儀器和試劑試劑 1.1.反應體系（反應體系（5050l l體系）：體系）： 10 X PCR反應緩沖液反應緩沖液 25

9、mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物引物1 10mol/L引物引物2 模板模板DNA TaqE 補充水補充水 三、操作步驟三、操作步驟 10 X B 10 X P1 P2 10 X T 10 X E 2.2.按照如下體積向按照如下體積向PCRPCR管中按順序加入各試管中按順序加入各試 劑劑 并混勻：并混勻： 三、操作步驟三、操作步驟 10 X Buffer 2.5 L 10 X P1 2.5 L 10X T 2.5 L 10 X E 2.5 L 25 L 水水 12.5 L 10 X P2 2.5 L 3.PCR3.PCR擴增程序：擴增程序： 9494 5

10、-10min（預變性）（預變性） 94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸）（后延伸） 4 保溫保溫 30Cycles 屏幕顯示方式屏幕顯示方式 Main Run Enter List Edit File Lid 運行已運行已 有程序有程序 已有程已有程 序菜單序菜單 刪除已刪除已 有程序有程序 新建反新建反 應程序應程序 編輯已編輯已 有程序有程序 熱蓋關(guān)熱蓋關(guān) 閉調(diào)節(jié)閉調(diào)節(jié) 輸入文件名輸入文件名,滿滿8個字個字 符自動生成程序名符自動生成程序名,不不 滿滿8個字符時用個字符時用#終止終止 BLOCK:屏幕顯示樣品臺屏幕顯示樣品臺 溫度溫度(樣品臺溫控方式樣品臺溫控方式) Sim-Tube:屏幕顯示反應屏幕顯示反應 液溫度液溫度(模擬管溫控方式模擬管溫控方式) 選擇預變性保溫選擇預變性保溫 循環(huán)內(nèi)第一步溫度和時間循環(huán)內(nèi)第一步溫度和時間 預變性溫度和時間預變性溫度和時間 循環(huán)參數(shù)設置循環(huán)參數(shù)設置 循環(huán)內(nèi)步驟數(shù)循環(huán)內(nèi)步驟數(shù) 不需要拓展功能不需要拓展功能 循環(huán)內(nèi)第二步溫度和時間循環(huán)內(nèi)第二步溫度和時間 不需要拓展功能不需要拓展功能 循環(huán)內(nèi)第三步溫度和時間循環(huán)內(nèi)第三步溫度和時間 不需要拓展功能不需要拓展功能 設置循環(huán)數(shù)設置循環(huán)數(shù) 后延伸保溫后延伸保溫 后延伸溫度和時間后延伸溫度和時間 選擇反應完后保溫選擇反應完后保溫 設置反應完后的保