酒精酵母.doc

1、 一株耐酒精的酵母菌株的誘變育種四 川 理 工 學 院設計（論文）題目： 一株耐酒精的酵母菌株的誘變育種 1畢業(yè)設計（論文）的主要內容及基本要求1大曲中分離及純化酵母菌。2紫外線誘變，氯化鋰誘變和紫外線與氯化鋰復合誘變。3分別對誘變菌的發(fā)酵性能和產氣情況的測定。2指定查閱的主要參考文獻及說明1釀造酒工藝學（第二版） 中國輕工業(yè)出版社 顧國賢主編2微生物學（第二版） 高等教育出版社 周德慶主編3微生物學實驗指導 高等教育出版社 黃秀梨主編4現代微生物遺傳學化學工業(yè)出版社 陳三鳳 劉德虎 編著3進度安排設計（論文）各階段名稱起 止 日 期1文獻檢索：收集資料、撰寫開題報告2009.03.23-20

2、09.03.292文獻、資料查閱整理，撰寫文獻綜述2009.03.30-2009.04.05 3擬訂實驗方案，提出實驗條件及需求2009.04.06-2009.04.114實驗儀器及藥品的準備 2009.04.11-2009.05.125實驗實施，現象觀察并做好數據記錄2009.04.13-2009.05.20 6分析實驗結果，整理數據2009.05.21-2009.05.28 7撰寫論文、修改論文2009.05.29-2009.06.108論文定稿、打印 、準備及答辯2009.06.10-2009.06.17 注：本表在學生接受任務時下達一株耐酒精的酵母菌株的誘變育種 本文主要介紹了耐酒精酵

3、母的誘變育種，通過誘變得到高發(fā)酵力和高耐酒精性能的酵母菌。本實驗擬從大曲中分離及純化得到具有發(fā)酵產酒精能力的酵母菌種,并以該菌作為出發(fā)菌株,首先分別通過紫外光誘變，氯化鋰誘變和紫外光與氯化鋰復合誘變，然后分別測試誘變后的酵母菌株的酒精發(fā)酵及耐酒精性能，從而篩選得到高發(fā)酵能力及高耐酒精度的酵母菌株。關鍵詞：酵母菌；耐酒精；紫外線；氯化鋰；復合誘變目 錄摘 要.iabstrct.ii目 錄. 前 言1第一章 實驗儀器與材料31.1 儀器與設備31.2 材料與試劑31.3 實驗試劑的配制41.4 培養(yǎng)基的配制5第二章 實驗內容與方案62.1 大曲中釀酒酵母的分離62.2 出發(fā)菌株的能力測定7 2.3

4、 紫外線誘變酵母菌.8 2.4 氯化鋰誘變酵母菌.10 2.5 紫外線-氯化鋰復合誘變酵母菌.13第三章 實驗結果與討論153.1實驗結果153.2 實驗討論35第四章 結 論.39第五章 綜 述.41參考文獻.44致 謝46附 錄.47表目錄表2-1 不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 .7表2-2a不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況.9表2-2b不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況.10表2-3 不同質量分數下的氯化鋰用量情況.11表2-4 不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 .12表2-5a 不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況.13表2-5b 不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況.14 表3-1 出發(fā)酵

5、母菌在不同乙醇體積分數下的產氣情況.16表3-2 出發(fā)酵母菌的二氧化碳失重情況.17表3-3 出發(fā)酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度情況.17表3-4 紫外線照射酵母菌的致死情況.18圖3-5 紫外線誘變酵母菌的致死曲線.19表3-6a 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況.21表3-6b 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況.21表3-7 紫外線誘變后的酵母菌的二氧化碳失重情況.24表3-8 紫外線誘變后的酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度情況.24表3-9 氯化鋰誘變酵母菌的致死情況.25圖3-10 氯化鋰誘變酵母菌的致死曲線.26表3-11氯化鋰誘變后的酵母菌的產氣情況.28表3-12 氯化鋰誘變后的酵母菌的二氧化碳失

6、重情況.29表3-13氯化鋰誘變后的酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度情況.29表3-14a 復合誘變后的酵母菌的產氣情況.31表3-14b 復合誘變后的酵母菌的產氣情況.31表3-14c 復合誘變后的酵母菌的產氣情況.31表3-15 復合誘變后的酵母菌的二氧化碳失重情況.34表3-16 復合誘變后的酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度情況.34圖目錄圖3-1 酵母菌出發(fā)菌的菌落形態(tài).15圖3-2 出發(fā)酵母菌的產氣情況.16圖3-3 紫外線誘變后的酵母菌.20圖3-4a 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況.22圖3-4b 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況.23圖3-5 氯化鋰誘變后的酵母菌.27圖3-6 氯化鋰誘變后的酵

7、母菌的產氣情況.28圖3-7 復合誘變后的酵母菌.30圖3-8a 復合誘變菌產氣情況.32圖3-8b 復合誘變菌產氣情況.33隨著世界經濟的發(fā)展與繁榮，石油的消耗越來越多，以至于它成為了維系世界經濟與發(fā)展的命脈,然而現在全世界的石油儲備越來越少，且由于它是不可再生的資源，消耗之后就會消失，故開發(fā)一種新型的石油的替代產品,已經是迫在眉睫，而且已經成為了世界各國能源研究的主要問題。酒精作為能源替代品, 與石油相比具有可再生、污染小、可減少溫室效應等優(yōu)點,是世界公認的可再生環(huán)保新型能源之一。目前,世界各國的燃料酒精工業(yè)正在蓬勃的發(fā)展。由于在酒精生產工藝中,提高成熟醪的酒精濃度可以降低蒸餾時的能耗,提

8、高設備利用率1,因此企業(yè)對如何提高發(fā)酵酒精濃度予高度重視。但是酒精對酵母菌本身是有一定的毒性的,當酒精度達到一定濃度時,會抑制酵母菌的生長、細胞發(fā)育以及酒精發(fā)酵的能力2。但是企業(yè)為了多產酒精,發(fā)酵時就會盡可能地提高成熟醪的酒精度,而酒精含量對酵母菌的生長影響很大,普通酵母在乙醇濃度達10%左右時,發(fā)酵完全受到抑制,所以在濃醪發(fā)酵時,有必要選用酒精耐性高的酵母菌，研究酵母菌的酒精耐受性機制以及開發(fā)出更高的耐酒精度的酒精高產酵母菌對于解決這一問題意義重大,同時也是目前酒精發(fā)酵領域的一個重要研究方向。 然而產酒精酵母在白酒釀造中應用廣泛,由于一般采用斜面保藏法, 在低溫條件下仍能進行緩慢的生理代謝,

9、 難免出現逐漸退化,細胞數及產酒能力大幅度下降。采用單細胞分離純化的生產育種方法,一般能得到保持或稍優(yōu)于原種性能的菌株, 但對于退化嚴重的菌種來說, 很難恢復原先水平,更別說分離到高產菌株3。采用誘變育種, 以解決傳統生產育種無法解決的難題, 采取基因突變的方式篩選正向突變的菌株,結合現有的試驗條件,得到更高耐酒精度的酵母菌是一條有效的途徑。 本文擬從大曲中分離得到具有發(fā)酵產酒精能力的酵母菌,并以該菌為出發(fā)菌株,采用不同的誘變方法對出發(fā)菌進行誘變，分別采用了紫外線輻射的物理誘變法，氯化鋰化學誘變發(fā)和紫外光與氯化鋰的物理與化學復合誘變的方法，然后分別測試不同誘變方法誘變后的菌種的酒精發(fā)酵及耐酒精

10、度性能。對耐酒精度的測試本文采用了裝麥芽汁液體培養(yǎng)基與試管中并裝入杜氏小管，滅菌后分別按不同的乙醇體積分數加入無水乙醇，進行產氣試驗并觀察現象；對酒精發(fā)酵力的測試則采用了二氧化碳失重法，發(fā)酵后分別測量其失重，從而測出發(fā)酵力。通過對比記錄的數據篩選出高耐酒精度的菌株。從而就可以得到更高發(fā)酵能力和更高耐酒精度的酵母菌種。 綜上所述,通過誘變育種得到更高的耐酒精度的酵母菌種,從而提高了酵母菌的耐酒精性能和酒精發(fā)酵力，這樣可以更好地適合濃醪酒精發(fā)酵的要求,更加有利酒精的生產，提高酒精的產量，同時也為酒精發(fā)酵工業(yè)帶來顯著的經濟效益。第1章 實驗儀器與材料1.1 儀器與設備ar1140電子分析天平 梅特勒

11、.托利多儀器（上海）有限公司hh-s型電熱恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司 lhs-250sc恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司yx-280b型手提式壓力蒸汽消毒器 江陰濱江醫(yī)療設備廠 sw-cj-if凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司202-3ab電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司bcd-185e/g冰箱 青島海爾股份有限公司gen/us3 漩渦混勻器 usazhwy-1102c搖床 上海智城分析儀器制造有限公司菌落計數儀 杭州迅數科技有限公司 78hw-1型恒溫磁力攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠 8w紫外燈 中國南京紫光電器有限責任公司 顯微鏡 麥克奧迪儀器設備公司bp-型托盤

12、天平 上海醫(yī)用激光儀器廠100ml、250ml、1000ml、2000ml燒杯，玻璃棒，1ml,2ml,5ml、10ml移液管， 250ml錐形瓶，100ml滴瓶，滴管，棉塞，涂布棒，研缽，試管架，鐵架臺， 細紗布，洗耳球，接種針，血球計數板，酒精燈，試管，平皿，牛皮紙，杜氏小管，ph試紙，麻繩,記號筆，密度計（1.0-1.1），酒精計（0-40度）等。 1.2 材料與試劑1.2.1 材料酒曲 四川理工學院微生物實驗室馬鈴薯 市售干麥芽粉 市售1.2.2 試劑無水乙醇（ar） 重慶川東化工（集團）有限公司化學試劑廠氯化鋰（ar） 成都科龍化工試劑廠酵母膏 北京奧博生物技術有限責任公司nh4cl

13、（ar） 重慶北碚化學試劑廠mgso4.7h2o（ar） 成都科龍化工試劑廠kh2po4（ar） 重慶北碚化學試劑廠牛肉膏 上?；瘜W試劑采購供應站蛋白胨 北京奧博生物技術有限責任公司nacl（ar） 成都科龍化工試劑廠 葡萄糖 重慶北碚化學試劑廠瓊脂 海南省瓊海市夢圓瓊膠卡拉膠食品有限公司硫酸（ar） 重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠美藍 重慶北碚化學試劑廠koh（ar） 成都科龍化工試劑廠1.3 實驗試劑的配制1.3.1 0.1%美藍染色液的配制4： 美藍酒精飽和液（0.3g美藍溶于30ml95%酒精中）30ml與氫氧化鉀溶液（0.1g/l)100ml兩液混合，搖勻。1.3.2 0.1

14、moll硫酸配制： 計算：查數據：98%的濃硫酸密度1.84g/ml3,根據h2so4分子式知道,當量濃度是摩爾濃度的2倍(so42-),所以,克當量為98/2=49,設取濃硫酸為xml,配制1l的溶液時按公式計算得： 0.1=(x*1.84*98%)/49/1 x=2.71ml1.3.3 麥芽汁制備5： 稱取干麥芽粉溶于水中（比例是1：3），水浴加熱到60度左右，保溫4小時左右，可以取一點與碘液反應，不變藍則糖化完全，四層紗布過濾即可，配制為10波美度的濃度，在121c下滅菌20分鐘并放入冰箱中備用。波美度與比重換算方法：波美度=144.3-(144.3/比重)；對于比誰重的：比重144.3

15、/(144.3-波美度)對于比水輕的：比重144.3/(144.3+波美度)根據公式計算得 x/999.972 =144.3/(144.3-10) x=1074.43x=1074.43kgm3=1.074.43gcm3式中：x-10波美度時的密度。1.4 培養(yǎng)基的配制：1.4.1 分離純化培養(yǎng)基2 :（馬鈴薯培養(yǎng)基） 馬鈴薯200g，葡萄糖20 g ,瓊脂20g ,加蒸餾水至1000ml，自然ph 。在 121c下滅菌20分鐘并放入冰箱中保存?zhèn)溆谩?.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基2: 葡萄糖15. 0 g ,酵母膏0. 5 g ,nh4cl 0. 15 g ,mgso47h2o 0. 065 g ,蛋白

16、胨0. 5 g ,kh2po4 0. 15 g ,加蒸餾水至100 ml ,用h2so4 調節(jié)ph至4.5 ，在121c下滅菌20分鐘并放入冰箱中保存?zhèn)溆谩５诙?實驗內容與方案2.1 大曲中釀酒酵母的分離2.1.1 分離純化培養(yǎng)基的制備： 馬鈴薯200g，葡萄糖20 g ,瓊脂20g ,加蒸餾水至1000ml，自然ph ,121 高壓滅菌20 min ,冷卻后倒平板備用。2.1.2菌懸液的制備： 稱大曲樣品5g迅速倒入有滅菌生理鹽水45ml的玻璃瓶內（瓶內裝適量玻璃珠），充分振蕩使大曲樣品充分打散，即制成1：10的小曲懸液。 2.1.3 稀釋涂布： 用無菌移液管吸取1ml小曲樣品懸液，沿管壁

17、注入9ml滅菌生理鹽水試管內，搖勻試管，即制成1：100的稀釋液。按上述方法依次稀釋，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的稀釋液。將培養(yǎng)基注入平皿約15ml共9個，分別取10-4，10-5和10-6三管稀釋液各0.1ml，分別接入相應標號的平皿中，每個稀釋度接3個，然后進行涂布，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置，放于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。2.1.4 純化：2天后，取出上述平皿，用接種針挑取菌落外觀是圓形且菌落表面光滑，濕潤，粘稠呈乳白色，有酒香味的菌落進行鑒定，用顯微鏡鑒定確認是酵母菌后，然后進行純化，純化采用稀釋涂布法，從而得到純種的酵母菌。2.1.5 接種保藏：將

18、上面純化好的酵母菌選一個長勢好的酵母菌落用于誘變，并用三點法接入到加入了分離培養(yǎng)基的平皿中，于30度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。2天后用于誘變育種，作為出發(fā)菌株，用完后放入4度冰箱中保藏備用。取2支試管，倒入適量的分離培養(yǎng)基制成斜面。然后選擇菌落形態(tài)特征好的分別接種于2支斜面上，放于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，2天后作為菌種保藏。2.2. 出發(fā)菌株的能力測定2.2.1 耐酒精度試驗： 1.將上面分離所得的出發(fā)菌株，用接種針分別挑取一環(huán)酵母菌接種于兩支裝10ml的無菌生理鹽水的試管中，混勻。2. 將上面?zhèn)浜玫某霭l(fā)菌株,接入麥芽汁中,放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2天,制得種子培養(yǎng)液。取裝有10ml麥芽

19、汁的試管(內裝杜氏小管)10支,每個乙醇濃度做兩支試管，種子培養(yǎng)液分別以1ml的接種量接入試管中,在無菌條件下分別加入不同量的無水乙醇混勻,使培養(yǎng)基中乙醇含量（體積分數）如表2-1所示。3. 然后，放于30恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1天,觀察產氣情況。 表2-1 不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 graph2-1 the dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麥芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.00種子培養(yǎng)液加入量（ml）1.001.001.001.001.00無水乙醇加入量

20、（ml）0.000.340.590.831.09總 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.09乙醇體積分數（%）0.002.995.097.029.022.2.2 活化酵母菌種: 將上面出發(fā)菌株，用接種針挑取一環(huán)酵母菌接入到裝有200ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，放于搖床中在30度條件下培養(yǎng)2天。2.2.3酒精發(fā)酵能力測定: 于三支500ml 的錐形瓶瓶中加入200 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌種,于30 的搖床中發(fā)酵,每1 天測定一次co2 失重,當co2 失重小于2克時認為發(fā)酵結束，測定發(fā)酵醪液酒精濃度。附：酒精含量測定6：取100 ml 發(fā)酵液于50

21、0 ml 蒸餾瓶中,加100 ml 蒸餾水,蒸餾出100 ml 溶液,用酒精比重計測定溶液中的酒精濃度,同時測定溶液溫度,換算為20 時的酒精濃度。2.3 紫外線誘變酵母菌2.3.1 制備菌懸液： 取上面的出發(fā)菌種，用接種針接種10環(huán)酵母菌于100ml滅菌的生理鹽水錐形瓶中，放到搖床振蕩30分鐘。 2.3.2 致死曲線的測定： 1.紫外線燈處理： 打開紫外燈（8w）預熱20分鐘，從錐形瓶中取10ml菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿（9cm）中，同時制作6份。將培養(yǎng)皿發(fā)在離紫外燈30cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上，照射1min后打開培養(yǎng)皿蓋，開始照射，與照射處理開始的同時打開磁力攪拌器進行攪拌，即時計算

22、時間，照射時間分別為30s,1min,3min,5min,6min，7min。然后在紅光下進行下面操作。 2.死亡率的確定： 取0.1%美藍染色液1滴，置于載玻片中央，并用接種環(huán)分別取上面5份酵母菌懸液與染色液混勻。染色2-3min中，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察，在一個視野內計算死細胞（藍色）和活細胞（不著色），共計數5-6個視野。 死亡率=（死細胞數/細胞總數）x100%最后制定致死曲線，找到最佳的誘變時間ta。(由于紫外線誘變效應中,正突變較多地出現在偏低的劑量,負突變則較多地出現在偏高劑量,因此選擇死亡率為70 %80 %的劑量。) 3.以照射時間為橫軸，以致死率為縱軸，作致死曲線。 2.

23、3.3 紫外線誘變處理： 從錐形瓶中取10ml菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿（9cm）中, 將培養(yǎng)皿放在離紫外燈30cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上，照射1min后打開培養(yǎng)皿蓋，開始照射，與照射處理開始的同時打開磁力攪拌器進行攪拌，即時計算時間ta（根據所得的致死曲線，對菌株采用80%左右致死率的誘變條件進行誘變）。照射后在黑暗冷凍中保存1-2小時，然后在紅光下將菌懸液加入已準備好的5個裝有分離培養(yǎng)基的平皿中，每個平皿0.1ml菌懸液，然后進行涂布，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置，將上述涂均的平板用黑布包好，在30度恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2天。 2.3.4 接種保藏:2天后，觀察平皿中的菌落，選出長勢很好菌落進

24、行下面的測試并接種于備好的斜面上，于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，2天后放于4c的冰箱中作為菌種保藏。2.3.5 耐酒精度試驗: 1.將上面?zhèn)浜眠x育的菌株，用接種針分別挑取一環(huán)酵母菌接種于兩支裝10ml的無菌生理鹽水的試管中，混勻。 2.將上面?zhèn)浜眠x育的菌株,接入麥芽汁中,放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2天,制得種子培養(yǎng)液。取裝有10ml麥芽汁的試管(內裝杜氏管)20支，每個乙醇濃度做兩支試管,種子培養(yǎng)液分別以1ml的接種量接入試管中，在無菌條件下分別加入不同量的無水乙醇混勻,使培養(yǎng)基中乙醇含量（體積分數）如表2-2所示。3. 然后，放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1天,觀察產氣情況。表2-2a

25、不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 graph2-2a the dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麥芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.00種子培養(yǎng)液加入量（ml）1.001.001.001.001.00無水乙醇加入量（ml）0.000.340.590.831.09總 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.09乙醇體積分數（%）0.002.995.097.029.02表2-2b不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 graph2-2b the dosage

26、of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麥芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.00種子培養(yǎng)液加入量（ml）1.001.001.001.001.00無水乙醇加入量（ml）1.361.652.002.302.60總 量（ml）12.3612.6513.0013.3013.60乙醇體積分數（%）11.0013.0415.3817.2919.122.3.6 活化酵母菌種: 將上面?zhèn)浜眠x育的菌株，用接種針挑取一環(huán)酵母菌接入到裝有200ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，放于搖床中在30度條件下培養(yǎng)2天。2.

27、3.7 酒精發(fā)酵能力測定: 于三支500ml 的錐形瓶瓶中加入200 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌種,于30 的搖床中發(fā)酵,每1 天測定一次co2 失重,當co2 失重小于2克時認為發(fā)酵結束，測定發(fā)酵醪液酒精濃度，將數據與出發(fā)酵母菌進行比較 酒精含量測定：取100 ml 發(fā)酵液于500 ml 蒸餾瓶中,加100 ml 蒸餾水,蒸餾出100 ml 溶液,用酒精比重計測定溶液中的酒精濃度,同時測定溶液溫度,換算為20 時的酒精濃度。2.4 氯化鋰誘變酵母菌2.4.1 制備氯化鋰培養(yǎng)基：首先，將氯化鋰以0%，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%的質量分數的用量分別加入到分離

28、培養(yǎng)基中溶化，每個質量分數做100ml的氯化鋰培養(yǎng)基（如表2-3）。表2-3 不同質量分數下的氯化鋰用量情況graph2-3 the dosage of licl in different licl concentration氯化鋰質量分數（%）0.0000.3000.6000.9001.200氯化鋰的加入量（g/100ml）0.0000.3720.7441.1161.4882.4.2 制備菌懸液：然后，將出發(fā)菌種用接種針接種1環(huán)酵母菌于10ml滅菌的生理鹽水錐形瓶中，放到搖床振蕩30分鐘。2.4.3 平板涂布: 將預先準備好10個裝有分離培養(yǎng)基含氯化鋰0%， 0.3%， 0.6%， 0.9%

29、， 1.2%每個濃度兩個平皿分別加入0.1ml菌懸液進行涂布，待菌懸液待菌液滲入培養(yǎng)基后，倒置于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。2.4.4 死亡率的確定:（菌落計數法） 2天后，觀察平皿中菌落數并記錄，以0%的氯化鋰平皿作對照計算致死率，以氯化鋰在培養(yǎng)基中的質量分數為橫坐標，致死率為縱坐標作圖，得到licl誘變的致死曲線。 2.4.5氯化鋰誘變處理： 根據所得的致死曲線，對菌株采用80%左右致死率的誘變條件進行誘變酵母菌，平行作5個平板，倒置于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。2.4.6 接種保藏：兩天后，觀察平皿中的菌落，選出長勢很好菌落進行下面的測試并接種于備好的斜面上，于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培

30、養(yǎng)2天，2天后放于4c的冰箱中作為菌種保藏。2.4.7 耐酒精度試驗： 1.將上面?zhèn)浜眠x育的菌株，用接種針分別挑取一環(huán)酵母菌接入到兩支裝有10ml的無菌生理鹽水的試管中，混勻。 2.將上面?zhèn)浜眠x育的菌株,接入麥芽汁中,放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2天,制得種子培養(yǎng)液。取裝有麥芽汁10ml的試管(內裝杜氏小管)12支,種子培養(yǎng)液分別以1ml的接種量接入試管中，在無菌條件下分別加入不同量的無水乙醇混勻,使培養(yǎng)基中乙醇含量如表2-4所示。 3.然后，放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2天,觀察產氣情況。表2-4不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 graph2-4 the dosage of absolu

31、te ethyl alcohol in different alcohol concentration麥芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.0010.00種子培養(yǎng)液加入量（ml）1.001.001.001.001.001.00無水乙醇加入量（ml）0.000.340.590.831.091.36總 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.0912.36乙醇體積分數（%）0.002.995.097.029.0211.002.4.8活化酵母菌種： 將上面?zhèn)浜眠x育的菌株，用接種針挑取一環(huán)酵母菌接入到裝有200ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，放于搖床中在30度條件

32、下培養(yǎng)2天。2.4.9酒精發(fā)酵能力測定： 于三支500ml 的錐形瓶瓶中加入200 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌種,放于30 的搖床中發(fā)酵,每1 天測定一次co2 失重,當co2 失重小于2克時認為發(fā)酵結束，測定發(fā)酵醪液酒精濃度，將數據與出發(fā)酵母菌進行比較。附： 酒精含量測定：取100 ml 發(fā)酵液于500 ml 蒸餾瓶中,加100 ml 蒸餾水,蒸餾出100 ml 溶液,用酒精比重計測定溶液中的酒精濃度,同時測定溶液溫度,換算為20 時的酒精濃度。2.5 紫外線-氯化鋰復合誘變酵母菌2.5.1 復合誘變處理：將用氯化鋰誘變80%左右致死率的誘變條件下長出的菌落（挑選長

33、勢好的菌落）制成菌懸液，于紫外線80%左右致死率的誘變條件進行誘變，然后涂布于平板上，平行作5個平板，然后放于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天。2.5.2 接種保藏：兩天后，觀察平皿中的菌落，選出長勢很好菌落進行下面的測試并接種于備好的斜面上，放于30度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)樣2天，2天后放于4c的冰箱中作為菌種保藏。2.5.3 耐酒精度試驗： 1.將上面?zhèn)浜眠x育的菌株，用接種針分別挑取一環(huán)酵母菌接入到兩支裝有10ml的無菌生理鹽水的試管中，混勻。 2.將上面?zhèn)浜眠x育的菌株,接入麥芽汁中,放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2天,制得種子培養(yǎng)液。取裝有10ml麥芽汁的試管(內裝杜氏管)28支,種子培養(yǎng)液分別

34、以1ml的接種量接入試管中，在無菌條件下分別加入不同量的無水乙醇混勻,使培養(yǎng)基中乙醇含量如表2-5所示。3. 然后，放于30的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2天,觀察產氣情況。表2-5a不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 graph2-5a the dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麥芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.0010.0010.00種子培養(yǎng)液加入量（ml）1.001.001.001.001.001.001.00無水乙醇加入量（ml）0.000.340.590.831.

35、091.361.65總 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.0912.3612.65乙醇體積分數（%）0.002.995.097.029.0211.0013.04表2-5b不同酒精濃度下的無水乙醇加入情況 graph2-5b the dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麥芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.0010.0010.00種子培養(yǎng)液加入量（ml）1.001.001.001.001.001.001.00無水乙醇加入量（ml）2.002.302.

36、603.003.303.704.00總 量（ml）13.0013.3013.6014.0014.3014.7015.00乙醇體積分數（%）15.3817.2919.1221.4323.0825.1726.672.5.4 活化酵母菌種： 將上面?zhèn)浜眠x育的菌株，用接種針挑取一環(huán)酵母菌接入到裝有200ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，放于搖床中在30度條件下培養(yǎng)2天。2.5.5 酒精發(fā)酵能力測定： 于三支500ml 的錐形瓶瓶中加入200 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌種,于30 的搖床中發(fā)酵,每1 天測定一次co2 失重,當co2失重小于2克時認為發(fā)酵結束，測定發(fā)酵醪液酒精濃度，將數

37、據與出發(fā)酵母菌進行比較。附： 酒精含量測定：取100 ml 發(fā)酵液于500 ml 蒸餾瓶中,加100 ml 蒸餾水,蒸餾出100 ml 溶液,用酒精比重計測定溶液中的酒精濃度,同時測定溶液溫度,換算為20 時的酒精濃度。第3章 實驗結果與討論3.1 實驗結果3.1.1大曲中分離純化酵母菌的結果：大曲中分離得到得酵母菌，菌落形態(tài)呈圓形，不透明，乳白色，表面光滑，有光澤，濕潤，粘稠。出發(fā)酵母菌如圖3-1所示： 圖3-1 酵母菌出發(fā)菌的菌落形態(tài)picture3-1 the shape of saccharomyces cerevisiae strain3.1.2 出發(fā)菌株的能力測定的結果：3.1.2

38、.1 出發(fā)菌耐酒精度試驗結果：出發(fā)酵母菌經過麥芽汁培養(yǎng)基的產氣試驗，產氣所需時間較短，且現象明確。24小時后觀察的產氣結果是0%，2.99%（乙醇體積分數）的試管中杜氏小管全充滿了氣體；5.09%的試管的杜氏小管中有1/2管氣體；7.02%的試管的杜氏小管中有1/3管氣體；9.02%的試管的杜氏小管沒有產氣。實驗結果如表3-1所示： 表3-1 出發(fā)酵母菌在不同乙醇體積分數下的產氣情況graph3-1 the gas production of the original strain in different ethyl alcohol concentration乙醇體積分數（%）02.995.

39、097.029.02產氣量全管氣體全管氣體1/2管氣體1/3管氣體未產氣產氣情況如圖3-2所示:（下圖從左到右乙醇體積分數依次由0%增加到13.04%）圖3-2 出發(fā)酵母菌的產氣情況picture3-2 the gas production of the original strain 3.1.2.1 酒精發(fā)酵能力測定的結果：出發(fā)酵母菌經過液體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵試驗，發(fā)酵時間較短，經二氧化碳失重測定一天就能發(fā)酵完畢，且有很濃的酒香味，但是發(fā)酵醪液酒精濃度經測定只有3.8%。酒精發(fā)酵能力測定的結果如表3-2所示：表3-2出發(fā)酵母菌的二氧化碳失重情況（單位：g）graph3-2 the weight

40、 loss of co2 in the fermentation of the original strain 時 間第一組第二組第三組平均值初始值343.2324.3344.4第一天333.4311.2332.3第二天331.3310.0331.2失重量（第一天）9.813.112.111.67出發(fā)酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度情況如表3-3所示:表3-3 出發(fā)酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度情況graph3-3 the alcohol-concentration of fermentative liquid concerning the original strain組 別第一組第二組第三組平均值酒精濃

41、度（%）3.54.04.03.8注：表中的酒精濃度均是換算成20c時的酒精濃度3.1.3 紫外線誘變后的酵母菌的試驗結果：3.1.3.1 紫外線誘變酵母菌的致死曲線： 致死曲線是通過計數死菌與活菌數量并計算致死率來進行制作的，酵母菌計數采用了顯微鏡直接計數法，計數前先用美藍染色，便可以清晰的辨認出死菌還是活菌，計數使用的是25*16型的血球計數板，分別計數了五個中方格（左上，左下，右上，右下，中央）。致死曲線分別以時間為橫軸，以致死率為縱軸。酵母菌細胞呈橢圓形，在10*100倍的油鏡下容易觀察到酵母菌的液泡，酵母菌出芽情況也清晰可見，經過美藍染色，死菌變成藍色，活菌不被作色。由于紫外線誘變效應

42、中,正突變較多地出現在偏低的劑量,負突變則較多地出現在偏高劑量,因此選擇死亡率為70 %80 %的劑量為最佳。所以本文選取了紫外線照射6分鐘，酵母菌致死率為76.7%時為實驗誘變最佳條件。紫外線照射結果如表3-3所示：表3-4 紫外線照射酵母菌的致死情況graph3-4 the quantity of saccharomyces cerevisiae strains killed by different dosage of uv紫外線照射時間照射30秒（個）照射1分鐘（個）照射3分鐘（個）照射5分鐘（個）照射6分鐘（個）照射7分鐘（個）一方格死菌個數005202030活菌個數15251510

43、100二中格死菌個數005102025活菌個數2030201550三中格死菌個數000151520活菌個數25252010100四中格死菌個數000202535活菌個數3030150100五中格死菌個數0010103525活菌個數2035201500總 數110135110125150135 致死率（%）0.00.018.262.576.7100.0紫外線誘變酵母菌的致死曲線如圖3-5所示：圖3-5 紫外線誘變酵母菌的致死曲線 graph3-5 the curved shape of saccharomyces cerevisiae strains killed by different do

44、sage of uv3.1.3.2 紫外線誘變后的酵母菌：出發(fā)酵母菌經過紫外線誘變后，生長速度加快，菌落形態(tài)與出發(fā)酵母菌基本一致，只有菌落比出發(fā)菌小，因為培養(yǎng)時間為一天。紫外線誘變后的酵母菌如圖3-3所示：圖3-3 紫外線誘變后的酵母菌picture3-3 the saccharomyces cerevisiae strains mutated by uv3.1.3.3 紫外線誘變后的酵母菌的酒精度試驗結果:出發(fā)酵母菌經過紫外線誘變后，接入到液體麥芽汁培養(yǎng)基中產氣。與出發(fā)酵母菌相比較，紫外線誘變后的酵母菌的耐酒精度有明顯的增強。紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況由出發(fā)酵母菌的7.02%（乙醇體積分

45、數）的耐酒精度增加到了17.29%。產氣情況如表3-6所示：表3-6a 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況graph3-6 the gas production of saccharomyces cerevisiae strains mutated by uv乙醇體積分數（%）02.995.097.029.02產氣量全管氣體全管氣體全管氣體全管氣體全管氣體表3-6b 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況graph3-6b the gas production of saccharomyces cerevisiae strains mutated by uv乙醇體積分數（%）11.0013.0415.38

46、17.2919.12產氣量全管氣體全管氣體2/3管氣體2/3管氣體未產氣產氣情況如圖3-4所示：（下圖乙醇體積分數從右到左依次由0%增加到15.38%）圖3-4a 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況picture3-4a the gas production of saccharomyces cerevisiae strains mutated by uv（下圖乙醇體積分數從左到右依次為17.29%，19.12%）圖3-4b 紫外線誘變后的酵母菌的產氣情況picture3-4b the gas production of saccharomyces cerevisiae strains mutat

47、ed by uv3.1.3.4 紫外線誘變后的酵母菌的酒精發(fā)酵能力的測定結果：出發(fā)酵母菌經紫外線誘變后，接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵能力與出發(fā)酵母菌相比，明顯增強，由出發(fā)酵母菌的每天二氧化碳失重11.67克增加到每天失重15.4克，發(fā)酵能力比起出發(fā)酵母菌提高了32.0%，但是發(fā)酵醪液酒精濃度比起出發(fā)酵母菌來也沒有多大提高，紫外線誘變后的酵母菌的發(fā)酵醪液酒精濃度為4.3%。酒精發(fā)酵能力測定的結果如表3-5所示：表3-7 紫外線誘變后的酵母菌的二氧化碳失重情況（單位：g）graph3-7 the weight loss of co2 in the fermentation of saccharomyces cerevisiae strain