生化實驗--血糖的測定

1、血糖的測定血糖的測定 u正常人空腹血糖濃度是多少正常人空腹血糖濃度是多少？ u為何能保持恒定為何能保持恒定？ u糖尿病糖尿病 正常人正常人空腹血糖濃度空腹血糖濃度(fasting plasma glucose,FPG)為為 3.89-6.11 mmol/L。 血糖如何維持穩(wěn)定？關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)血糖如何維持穩(wěn)定？關(guān)鍵酶調(diào)節(jié) 關(guān)鍵酶如何調(diào)節(jié)：激素調(diào)節(jié)。關(guān)鍵酶如何調(diào)節(jié)：激素調(diào)節(jié)。 常見的升高血糖的激素：胰高血常見的升高血糖的激素：胰高血 糖素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。糖素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。 降低血糖的激素：胰島素降低血糖的激素：胰島素 對糖代謝的調(diào)節(jié)：對糖代謝的調(diào)節(jié)：胰島素促進組織、胰島素促進組織、

2、細胞對葡萄糖的攝取和利用，加速細胞對葡萄糖的攝取和利用，加速 葡萄糖合成為糖原，貯存于肝和肌葡萄糖合成為糖原，貯存于肝和肌 肉中，并抑制糖異生，促進葡萄糖肉中，并抑制糖異生，促進葡萄糖 轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅?，貯存于脂肪組織，轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅幔A存于脂肪組織， 導(dǎo)致血糖水平下降。胰島素缺乏時，導(dǎo)致血糖水平下降。胰島素缺乏時， 血糖濃度升高，如超過腎糖閾，尿血糖濃度升高，如超過腎糖閾，尿 中將出現(xiàn)糖，引起糖尿病。中將出現(xiàn)糖，引起糖尿病。 胰島素是促進合成代謝、調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定的胰島素是促進合成代謝、調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定的 主要激素主要激素 如果調(diào)節(jié)失衡，結(jié)果是什么？高血糖如果調(diào)節(jié)失衡，結(jié)果是什么？高血糖 或者低血糖。或者

3、低血糖。 低血糖：生理性和病理性。低于低血糖：生理性和病理性。低于2.8 mmol/L。 高血糖：生理性和病理性。高于高血糖：生理性和病理性。高于7.1 mmol/L。高于。高于 8.89 mmol/L，出現(xiàn)糖尿。最常見病理性高血糖：，出現(xiàn)糖尿。最常見病理性高血糖： 糖尿病。糖尿病。 糖尿?。焊哐呛吞悄?。臨床特點：三多一少。病糖尿?。焊哐呛吞悄颉ＥR床特點：三多一少。病 因：胰島素分泌缺陷和胰島素受體缺陷。因：胰島素分泌缺陷和胰島素受體缺陷。 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)？糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)？ 糖尿?。ㄌ悄虿。╠iabetes）是由遺傳因素、免疫）是由遺傳因素、免疫 功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、

4、功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、 精神因素等等各種致病因子作用于機體導(dǎo)致胰精神因素等等各種致病因子作用于機體導(dǎo)致胰 島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白 質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合 征，臨床上以征，臨床上以高血糖高血糖為主要特點，典型病例可為主要特點，典型病例可 出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三三 多一少多一少”癥狀，糖尿?。ㄑ牵┮坏┛刂撇缓冒Y狀，糖尿?。ㄑ牵┮坏┛刂撇缓?會引發(fā)并發(fā)癥，導(dǎo)致腎、眼、足等部位的衰竭會引發(fā)并發(fā)癥，導(dǎo)致腎、眼、足

5、等部位的衰竭 病變，且無法治愈。病變，且無法治愈。 糖尿病的類型糖尿病的類型 型糖尿病型糖尿病 又又叫青年發(fā)病型糖叫青年發(fā)病型糖 尿病或胰島素依耐尿病或胰島素依耐 型糖尿病。型糖尿病。 原因原因：胰腺產(chǎn)生胰胰腺產(chǎn)生胰 島素的細胞已經(jīng)徹島素的細胞已經(jīng)徹 底損壞底損壞,從而完全失從而完全失 去了產(chǎn)生胰島素的去了產(chǎn)生胰島素的 功能功能. 治療治療：依賴胰島素依賴胰島素 治療。治療。 型糖尿病型糖尿病 又又叫非胰島素依耐叫非胰島素依耐 型糖尿病。型糖尿病。 原因：自身能夠產(chǎn)原因：自身能夠產(chǎn) 生胰島素，但細胞生胰島素，但細胞 無法對其作出反應(yīng)，無法對其作出反應(yīng)， 使胰島素?zé)o法發(fā)揮使胰島素?zé)o法發(fā)揮 作用。

6、作用。 治療：需要胰島素治療：需要胰島素 單獨或與口服藥聯(lián)單獨或與口服藥聯(lián) 合應(yīng)用的治療合應(yīng)用的治療 一般正常人進食后血糖都會一般正常人進食后血糖都會暫時性升高暫時性升高， 進食后進食后30分種或分種或60分種可升到最高峰分種可升到最高峰，但，但 血糖一般不超過血糖一般不超過8.9 mmol/L；進食進食2小時后小時后 又會回到空腹水平又會回到空腹水平，這就是人體對糖的耐，這就是人體對糖的耐 受現(xiàn)象。受現(xiàn)象。 什么是口服葡萄糖耐量試驗（什么是口服葡萄糖耐量試驗（Oral glucose tolerance test， OGTT）？）？ 有何臨床意義？有何臨床意義？ 口服葡萄糖耐量試驗（口服葡萄

7、糖耐量試驗（Oral glucose Oral glucose tolerance testtolerance test， OGTTOGTT）是一種口服葡是一種口服葡 萄糖負荷試驗，用以了解人體對進食葡萄糖負荷試驗，用以了解人體對進食葡 萄糖后的血糖調(diào)節(jié)能力。萄糖后的血糖調(diào)節(jié)能力。 通過通過OGTTOGTT試驗，可以試驗，可以早期發(fā)現(xiàn)糖代謝異早期發(fā)現(xiàn)糖代謝異 常，早期診斷常，早期診斷糖尿病糖尿病(Diabetes (Diabetes Mellitus, DM)Mellitus, DM) ，是一種簡單、快捷的是一種簡單、快捷的 診斷方法。診斷方法。 實驗前三天，受試者每日食物中糖含實驗前三天，受

8、試者每日食物中糖含 量不應(yīng)低于量不應(yīng)低于150g，且維持正?；顒樱绊?，且維持正?；顒?，影響 試驗的藥物應(yīng)在三天前停用，受試前應(yīng)空試驗的藥物應(yīng)在三天前停用，受試前應(yīng)空 腹腹10-15h。 空腹取血后，5分鐘內(nèi)飲入250ml含 75g無水葡萄糖的糖水，妊娠婦女用量為 100g，兒童按1.75g/kg體重給予,不超過 75g。 服糖后半小時，半小時，1小時，小時，2小時，小時，3小時小時 各抽血一次，作血糖定量檢測。各抽血一次，作血糖定量檢測。于采血同 時，每隔1小時留取尿液作尿糖試驗，整個 過程不可吸煙，喝咖啡，喝茶或進食。 OGTT方法：方法：WTO標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化 測試前禁食測試前禁食10-16

9、小時，清晨空腹進行。空小時，清晨空腹進行?？?腹抽靜脈血，測空腹靜脈血漿葡萄糖，然腹抽靜脈血，測空腹靜脈血漿葡萄糖，然 后成人口服后成人口服75 g無水葡萄糖，溶于無水葡萄糖，溶于250 ml水水 中，中，510分鐘內(nèi)飲完。飲后分鐘內(nèi)飲完。飲后2小時抽靜脈血小時抽靜脈血 ，測靜脈血漿葡萄糖。，測靜脈血漿葡萄糖。 IFG 與 IGT 空腹血糖損傷空腹血糖損傷(Impaired Fasting Glucose, IFG) ：空腹血糖：空腹血糖6.1mmol/L,但但7.0mmol/L 糖耐量受損糖耐量受損(Impaired Glucose Tolerance, IGT) ：餐后：餐后2h血糖血糖7

10、.8mmol/L,但但11.1mmol/L IFG 和和IGT可以說是一種可以說是一種正常人向糖尿正常人向糖尿 病的過渡狀態(tài)病的過渡狀態(tài)，這部分人雖然現(xiàn)在還不是，這部分人雖然現(xiàn)在還不是 糖尿病，糖尿病， 但是將來發(fā)生但是將來發(fā)生2型糖尿病的危險型糖尿病的危險 性非常高，可以說是性非常高，可以說是糖尿病的后備軍糖尿病的后備軍。據(jù)。據(jù) 有關(guān)研究報道，每年有關(guān)研究報道，每年5-8%的的IGT者將發(fā)展者將發(fā)展 成為成為2型糖尿病。型糖尿病。 無糖尿病史，空腹或者隨機血糖異常無糖尿病史，空腹或者隨機血糖異常 無糖尿病史，有一過性或持續(xù)性糖尿無糖尿病史，有一過性或持續(xù)性糖尿 無糖尿病史，有明顯糖尿病家族史

11、無糖尿病史，有明顯糖尿病家族史 有糖尿病癥狀，但空腹或者隨機血糖有糖尿病癥狀，但空腹或者隨機血糖 不夠標(biāo)準(zhǔn)不夠標(biāo)準(zhǔn) 分娩巨大胎兒的婦女和有巨大胎兒史分娩巨大胎兒的婦女和有巨大胎兒史 的個體的個體 不明原因腎病和視網(wǎng)膜病不明原因腎病和視網(wǎng)膜病 妊娠期、甲亢、感染期出現(xiàn)糖尿者妊娠期、甲亢、感染期出現(xiàn)糖尿者 OGTT的適應(yīng)癥 血糖測定方法血糖測定方法 無機化學(xué)法：如無機化學(xué)法：如Folin-Wu法法 有機化學(xué)法：如鄰甲苯胺法有機化學(xué)法：如鄰甲苯胺法 酶法：己糖激酶法，酶法：己糖激酶法， 酶酶法：葡萄糖氧化酶法法：葡萄糖氧化酶法 原理葡萄糖在和堿性銅試劑混合加熱后，可使原理葡萄糖在和堿性銅試劑混合加熱

12、后，可使 CuCu2+ 2+還原成 還原成CuCu+ + ，后者與磷鉬酸試劑作用生成藍色，后者與磷鉬酸試劑作用生成藍色 的鉬藍。通過比色法測定藍色化合物，計算出血糖的鉬藍。通過比色法測定藍色化合物，計算出血糖 的含量的含量 穩(wěn)定、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、但對葡萄糖無特異性，受血中非糖但對葡萄糖無特異性，受血中非糖 還原物質(zhì)的影響。還原物質(zhì)的影響。 空腹正常血糖參考值空腹正常血糖參考值 4.46.7mmol/L 4.46.7mmol/L或或80-120mg/80-120mg/dLdL 無機化學(xué)無機化學(xué)法：法：FolinFolin-Wu-Wu法法 有機化學(xué)法：鄰甲苯胺法有機化學(xué)法：鄰甲苯胺法 原理：原理

13、： 葡萄糖為一含醛基的已糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成葡萄糖為一含醛基的已糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成5-羥羥 甲基甲基-2-呋喃甲醛呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的Schiff堿。堿。 Schiff堿顏色的深淺與樣品中葡萄糖的含量成正比。堿顏色的深淺與樣品中葡萄糖的含量成正比。 評價：操作簡便，由于鄰甲苯胺只與醛糖作用而顯色，故此種測定評價：操作簡便，由于鄰甲苯胺只與醛糖作用而顯色，故此種測定 法不受血液中其他還原物質(zhì)的干擾，測定時也無需去除血漿或血清法不受血液中其他還原物質(zhì)的干擾，測定時也無需去除血漿或血清 中的蛋白質(zhì)，因此該實驗的特異性較高。中的蛋白

14、質(zhì)，因此該實驗的特異性較高。 酶法：己糖激酶法（酶法：己糖激酶法（Hexokinase, HK） n原理：原理： NADPH在340nm有吸收峰，其吸光度增加與標(biāo)本中的葡萄糖濃度成正比。 n評價評價： 本法特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化分本法特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化分 析，為葡萄糖測定的參考方法，但是析，為葡萄糖測定的參考方法，但是試劑較貴試劑較貴。 酶法：葡萄糖氧化酶法（酶法：葡萄糖氧化酶法（glucose oxidase, GOD） 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)利用氧和水利用氧和水將葡萄糖氧將葡萄糖氧 化為葡萄糖酸化為

15、葡萄糖酸，并釋放，并釋放過氧化氫過氧化氫。 過氧化氫過氧化氫在過氧化物酶在過氧化物酶 (peroxidase，POD)作用下，分解為水作用下，分解為水 和氧的同時將無色的和氧的同時將無色的4-氨基安替比林與酚氧化縮合生成氨基安替比林與酚氧化縮合生成紅色的紅色的 醌類化合物醌類化合物。 紅色的深淺在一定范圍內(nèi)與葡萄糖濃度成正比，在紅色的深淺在一定范圍內(nèi)與葡萄糖濃度成正比，在510nm波長波長 處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計算出血糖的濃度。處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計算出血糖的濃度。 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶- -過氧化物酶法原理過氧化物酶法原理 （1）葡萄糖）葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶葡萄

16、糖氧化酶 （GOD） （2）H2O24-氨基安替吡啉苯酚氨基安替吡啉苯酚 葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2 H2O 紅色醌式物質(zhì)紅色醌式物質(zhì) 過氧化物酶過氧化物酶 （POD） Trinder反應(yīng)反應(yīng) 505nm 光吸收法測定光吸收法測定相對血糖濃度相對血糖濃度 實實驗試劑驗試劑 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液(pH7.0) 酶試劑酶試劑 取過氧化物酶取過氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶1200U ，4-氨基安替比林氨基安替比林10mg，疊氮化鈉，疊氮化鈉100mg，溶于磷，溶于磷 酸緩沖液酸緩沖液80ml中，定容至中，定容至100ml，置，置4保存保存 酚溶液酚溶液 稱取重蒸

17、餾酚稱取重蒸餾酚100mg溶于蒸餾水溶于蒸餾水100ml中，中， 用棕色瓶貯存。用棕色瓶貯存。 酶酶酚混合試劑酚混合試劑 將酶試劑和酚試劑等量混合，將酶試劑和酚試劑等量混合，4 下下 可存放可存放1個月。個月。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：5mmol/L 實驗操作實驗操作 加入物 BST 血清(ml)0.01 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(ml)0.01 蒸餾水(ml)0.01 工作液(ml)1.01.01.0 混勻，置混勻，置 37 37 水浴保溫水浴保溫 1515分鐘，分鐘，每管加蒸餾水每管加蒸餾水0.5 ml0.5 ml，在，在 510nm510nm波長處比色，以空白管（波長處比色，以空白管（B

18、 B管）調(diào)零，讀取各管吸光度。管）調(diào)零，讀取各管吸光度。 根據(jù)各管吸光度根據(jù)各管吸光度計算其血糖濃度計算其血糖濃度。 葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液的葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液的 葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡 萄糖含量。這是因為尿液中的尿酸等萄糖含量。這是因為尿液中的尿酸等 干擾物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物干擾物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物 酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。 對于血液樣品需及時分離紅細胞。因?qū)τ谘簶悠沸杓皶r分離紅細胞。因 為紅細胞的酵解將會導(dǎo)致測定結(jié)果偏為紅細胞的酵解將會導(dǎo)致測定結(jié)果偏 低。建議測定樣品以草酸鉀低。建議

19、測定樣品以草酸鉀- -氟化鈉為氟化鈉為 抗凝劑以抑制糖酵解。抗凝劑以抑制糖酵解。 注意事項注意事項 嚴(yán)重黃疸、溶血及乳糜樣血清先制備無蛋白血濾液嚴(yán)重黃疸、溶血及乳糜樣血清先制備無蛋白血濾液 ，然后在進行測定。，然后在進行測定。 酶酚混合液一般現(xiàn)用現(xiàn)配。酶酚混合液一般現(xiàn)用現(xiàn)配。 葡萄糖氧化酶對葡萄糖氧化酶對 - D 葡萄糖高度特異，溶液中的葡葡萄糖高度特異，溶液中的葡 萄糖約萄糖約 36% 為為 型，型， 64% 為為 型。葡萄糖的完全氧型。葡萄糖的完全氧 化需要化需要 型到型到 型的變旋反應(yīng)型的變旋反應(yīng)。葡萄糖。葡萄糖變旋酶，可變旋酶，可 加速這一加速這一反應(yīng)反應(yīng)，延長延長孵育時間可達到完成自

20、發(fā)變旋孵育時間可達到完成自發(fā)變旋 過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是 型，故須放型，故須放 置置 2h 以上以上 ( 最好過夜最好過夜 ) ，待變旋平衡后方可應(yīng)用。，待變旋平衡后方可應(yīng)用。 注意事項注意事項 計算：計算： 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：5 5 mmolmmol/L/L 血清葡萄糖（血清葡萄糖（mmolmmol/L/L）=A=AT T/A/AS S C CS S 參考值：參考值： 3.96.1 mmol/L 不同檢測方法所提供的空腹正常血糖不同檢測方法所提供的空腹正常血糖 參考值存在參考值存在差異。差異。 葡萄糖葡萄糖氧化酶氧化酶法法：3.93.96.1mmol/L6.1mmol/L FolinFolin-Wu-Wu法法：4.44.46.7mmol/L6.7mmol/L 鄰鄰- -甲苯胺甲苯胺法法：3.93.96.1mmol/L6.1mmol/L 本法測定葡萄糖非常特異，從原理反本法測定葡萄糖非常特異，從