發(fā)酵工程大試驗(2012)

1、湖南大學生物學院湖南大學生物學院 2012年年5月月 一、發(fā)酵設備 二、發(fā)酵方式 三、發(fā)酵罐操作 四、蒸汽發(fā)生器 五、空氣壓縮機 六、空罐滅菌（空消） 七、實際裝料滅菌（實消） 八、發(fā)酵培養(yǎng) 九、溶氧（DO）與轉(zhuǎn)速的關聯(lián) 十、發(fā)酵罐工作組織流程 十一、思考題 目 錄 空氣動力系統(tǒng)：空壓機。提供罐壓、氧氣、氣動閥 動力 滅菌系統(tǒng)：蒸汽發(fā)生器 溫控系統(tǒng) 發(fā)酵罐自帶 電加熱 自來水冷卻 蒸汽發(fā)生器：滅菌消毒時用 冷水機：控溫低于水溫時用 發(fā)酵系統(tǒng)：發(fā)酵罐 一、 發(fā)酵設備 發(fā)酵罐 冷水機及蒸汽發(fā)生器 空壓機 空壓機表壓 發(fā)酵方式 固體發(fā)酵法：曲池、固體發(fā)酵罐 半固體發(fā)酵法：發(fā)酵罐 液體發(fā)酵法：發(fā)酵罐

2、二、發(fā)酵方式 三、 發(fā)酵罐操作 1.發(fā)酵罐、蒸汽發(fā)生器、空氣壓縮機均屬壓力容器。操作時須小心謹慎。尤以滅 菌（空消、實消）最危險。滅菌時須全程看守，不得離人。 2.發(fā)酵、空消、實消前所有蓋板螺絲，探頭、補料口螺絲須全部擰緊。將發(fā)酵罐 、蒸汽發(fā)生器進水龍頭打開。 3.發(fā)酵前，先將空壓機打開，待空壓機壓力達到0.6MPa時，開發(fā)酵罐電源。如果 滅菌，須將蒸汽發(fā)生器、空壓機全部打開后，再接通發(fā)酵罐電源。 4.發(fā)酵罐開機： 開電源開攪拌電機下位機登陸系統(tǒng)設計程序運行程序 5.發(fā)酵罐關機： 退出運行程序關攪拌電機關電源關水龍頭 發(fā)酵罐 、蒸汽發(fā)生器進水龍頭 發(fā)酵罐電源、電機開關及下位機 發(fā)酵罐的控制及使

3、用：通過下位機進行發(fā)酵罐的控制及使用：通過下位機進行 1、通過下位機“登陸系統(tǒng)”。 2、輸入密碼后，點擊“確認”。操作員“100”，低級權限。 3、發(fā)酵罐在準備發(fā)酵或者滅菌時都必須先點擊“系統(tǒng)控制”的 “啟動”。 6.發(fā)酵時，上位機只能監(jiān)控及輸出數(shù)據(jù)，用下位機設置參數(shù)。兩者關系，下位機優(yōu) 先。 7.發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐過壓時(0.15MPa) ，（1）將進氣流量設定為0，若仍不能 控制，則將空壓機關閉。（2）取消DO-轉(zhuǎn)速關聯(lián)控制，晚上無人值班時須取消 DO-轉(zhuǎn)速關聯(lián)控制。 8.發(fā)酵過程中，罐壓必須為正壓（？），通常為0.02-0.05MPa。 四、 蒸汽發(fā)生器 1.蒸汽發(fā)生器在空消、實消、取樣

4、時使用。 蒸汽發(fā)生器為壓力容器，須謹慎 操作。滅菌（空消、實消）及取樣時，必須全程看守，不得離人。 2.使用時，打開蒸汽發(fā)生器的進水龍頭，關閉排污閥，打開蒸汽排出閥，打開 發(fā)酵罐蒸汽進入總閥 。 3.開蒸汽發(fā)生器電源開機 。會出現(xiàn)缺水報警聲，水泵運轉(zhuǎn)補水，達到預定 水位時，停止報警，水泵停止補水。 4.密切注意蒸汽發(fā)生器的水位變化，若出現(xiàn)故障不進水，水位下降至刻度線下 時，應立即關機、關電源。 5.蒸汽發(fā)生器加熱時，暫時關閉蒸汽閥門，待壓力到達工作壓力時，緩開蒸汽 閥門，正常使用蒸汽。 6.使用完畢，關機、關電源。若長時間不用，則應關閉進水龍頭，并待蒸汽發(fā) 生器冷卻后，將水箱中的水排空。 7.

5、蒸汽發(fā)生器通常在滅菌或取樣前20-30min開始工作，蒸汽發(fā)生器的工作壓 力為0.4-0.7MPa。 蒸汽發(fā)生器 五、 空氣壓縮機 1.空氣壓縮機在空消、實消、發(fā)酵、取樣過程中，均須打開。功效主要在 于：保持罐壓。提供氧氣。為氣動閥提供動力。吹干空氣過濾 器。 2.空氣壓縮機出口處工作壓力必須達到0.6MPa才能維持發(fā)酵罐的正常工 作。 3.空氣壓縮機在發(fā)酵、滅菌前打開，在放罐結束后才能關閉。 4.發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐過壓時(0.15MPa)，若進氣流量設定為0，仍不能 控制罐壓，則須將空壓機關閉。 空氣壓縮機 六、 空罐滅菌（空消） 1.空消通常在實消（實際裝料滅菌）前或在發(fā)酵結束清洗完發(fā)酵罐

6、后進行。指對罐 體、管道、閥門、過濾器等的滅菌消毒。 2.空消前打開蒸汽發(fā)生器、空壓機，將pH、DO電極拔出，用堵帽螺絲塞住并擰緊。 其余蓋板螺絲、補料口螺絲須全部擰緊。發(fā)酵罐視鏡窗口裝上防護板。 3.空消前須將夾套中的水排空（？），發(fā)酵罐裝入約5L水（將溫度電極探頭淹過即 可）。 4.開啟發(fā)酵罐電源，登陸系統(tǒng)，點擊“啟動”，進入滅菌控制滅菌參數(shù)設定。 空罐滅菌轉(zhuǎn)速設定0rpm 攪拌停止溫度設定0 滅菌穩(wěn)定溫度設定121 滅菌時間設定1030min，一般為20min 滅菌完成罐壓設定為0.05MPa 滅菌完成后溫度設定37 滅菌完成后流量設定30.0L/min 點擊“開始”，即可自動根據(jù)滅菌參

7、數(shù)來滅菌。 5.空消時，當罐體溫度達到70時，開啟底閥、放料閥通蒸汽，對底閥、放料 閥滅菌消毒。 6.空罐滅菌全程須有人看管，如有報警，立即處置、報告。滅菌罐壓 0.15MPa。 7.空消結束后，按序關閉蒸汽發(fā)生器、發(fā)酵罐、空壓機。 七、 實際裝料滅菌（實消） 1.實消是指實際裝料滅菌，通常在空消后進行。實消前要將夾套中的水排空。 2.實消前，先將pH、DO電極用pH標準液及飽和亞硫酸鈉溶液通過下位機的“pH 電極校正”、“DO電極校正”界面，采用“兩點自動校正法”校正，然后裝入發(fā) 酵罐，擰緊螺絲。 3.從發(fā)酵罐頂部入料口裝入預先配置好的發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)鹽溶液約5升，再倒入固 形料（如麩皮、豆餅

8、粉等），然后補充剩余水份。裝料系數(shù)一般為0.7（20L罐， 實際裝料量為14L）。預留出滅菌冷凝水或蒸發(fā)水的量。若滅菌后產(chǎn)生冷凝水，滅 菌前須少加水；若滅菌后蒸發(fā)了水，滅菌前須多加水。 4.調(diào)整好液位電極和消泡電極的位置并旋緊，滅菌完畢不得再調(diào)整液位電極和消泡 電極的位置（？）。如果不用，則可拆下并用堵頭封住。 本實驗僅調(diào)整消泡電極 的位置。 5.打開空壓機、蒸汽發(fā)生器，擰緊發(fā)酵罐的蓋板螺絲、補料口螺絲。發(fā)酵罐視鏡窗 口裝上防護板。所有罐體上的部件都必須保證是安裝可靠的，以防泄漏和罐壓升高 時造成危害。 pH電極校正電極校正：兩點自動校正法。通過下位機進入“pH電極校正”界面 1、把pH電極放

9、入6.86的標準緩沖溶液中，在“測量值1”處輸入標準值6.86，等“當 前電壓”穩(wěn)定后，點擊 “第一點確認” ，系統(tǒng)會自動將“當前電壓”處的數(shù)值記錄 到“測量電壓1”處。 2、把pH電極放入4.00（酸性發(fā)酵）標準緩沖溶液中，在“測量值2”處輸入標準值 4.00，等“當前電壓”穩(wěn)定后，點擊“第二點確認” ，系統(tǒng)會自動將“當前電壓”處 的數(shù)值記錄到“測量電壓2”處。 3、點擊“自動校正”，系統(tǒng)自動計算出零位和斜率。電極校正完成。 DO電極校正電極校正：兩點自動校正法。通過下位機進入“DO電極校正”界面 1、把DO電極放入飽和亞硫酸鈉溶液中 ，等“當前電壓”穩(wěn)定后，點擊 “第一點 確認” ，系統(tǒng)會

10、自動將“當前電壓”處的數(shù)值記錄到“測量電壓1”處。DO顯示值 在5%以下即可。 2、把DO電極放入飽和濕度的空氣中（用濕濾紙包住DO探頭）。在“測量值2”處 輸入標準值98，等“當前電壓”穩(wěn)定后，點擊“第二點確認” ，系統(tǒng)會自動將“ 當前電壓”處的數(shù)值記錄到“測量電壓2”處。 3、點擊“自動校正”，系統(tǒng)自動計算出零位和斜率。電極校正完成。 6.開啟發(fā)酵罐電源，下位機登陸系統(tǒng)，點擊“啟動”，進入滅菌控制滅菌參數(shù)設定 。 攪拌速度設定100rpm 攪拌停止溫度設定90 滅菌穩(wěn)定溫度設定121 滅菌時間設定30min 滅菌完成罐壓設定為0.05MPa 滅菌完成后溫度設定37 滅菌完成后流量設定30.

11、0L/min 點擊“開始”，即可自動根據(jù)滅菌參數(shù)來進行實消。 7.實消滅菌全程須有人看管，如有報警，立即處置、報告。滅菌罐壓0.15MPa。 8.實消罐溫達到121 后，要對發(fā)酵罐機械密封，取樣閥，底閥 通蒸汽滅菌，在滅 菌攪拌停止時用手動滅菌 。滅菌時，先開啟蒸汽進氣閥，再微開蒸汽出口閥，三者 滅菌20min 。滅菌完成后，先關閉開蒸汽出口閥，再關閉蒸汽進氣閥。實消時不允許 蒸氣通過底閥進入發(fā)酵罐（？）。 9.實消時，罐溫達到121 后，還要對空氣過濾器、尾氣過濾器滅菌，兩者過濾器 頂部壓力表壓要達到0.1MPa 。若壓力達不到，可關小尾氣手動閥。 10.實消完成后，關閉蒸汽發(fā)生器。待罐溫、

12、罐壓、轉(zhuǎn)速等達到發(fā)酵參數(shù)設定值后， 必須對pH電極進行在線校正，對DO電極進行100滿度值校正（？）。 11. pH電極、DO電極的在線校正 通過下位機進入“pH電極校正”、“DO電極校正”的界面， pH電極在線校正：通 過調(diào)零位，使pH顯示值與標準pH計測定值一致（需要取樣30mL測定）。 DO電極 的在線校正：通過調(diào)斜率，在正常發(fā)酵溫度、罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量狀況下，使DO顯 示值達到100滿度值。兩者校正完畢后，按界面上的“返回”即可。 pH電極校正 DO電極校正 八、 發(fā)酵培養(yǎng) 1.實消完成后，當罐溫達到30-35，罐壓達到0.02-0.03MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為 100rpm時，即可上罐接種

13、。 2.接種時，室內(nèi)空氣要保持相對靜止，關掉空調(diào)及電風扇，將菌種及要補充的無 菌水移近發(fā)酵罐。兩小組的液體種須事先匯集到兩個大三角瓶中（200mL2瓶 ）。 3.在接種火圈環(huán)內(nèi)壓入燃燒酒精棉球，發(fā)酵罐頂部軸、螺絲等不銹鋼處，用75 的酒精棉球擦拭消毒，點燃酒精棉。 4.戴好防燙手套，打開接種蓋，將裝菌種的三角瓶瓶口在火焰上灼燒，按接種量 迅速倒入液體菌種，補充無菌水至14L，蓋上接種蓋，并用火焰再次灼燒接種口 。 5.在下位機上，登陸系統(tǒng)，點擊“啟動”，進入“發(fā)酵控制”，按工藝要求，設 定發(fā)酵溫度、罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量等后，點擊“自動啟動”開始發(fā)酵培養(yǎng)。也可 按“標準啟動”后，再設置運行參數(shù)。

14、6.記錄接種時間。從接種時計算，每隔1hr，用實驗記錄本記錄罐溫、攪拌速度、 通氣量、罐壓、pH、DO、泡沫變化、發(fā)酵液粘稠度、發(fā)酵液顏色等數(shù)據(jù)。 7.每隔12hr取樣一次（通常為上午8：30，晚上8：30），取樣量約30mL，取樣前 30min，打開蒸汽發(fā)生器，待蒸汽壓力達到0.6-0.7MPa時，通過手動隔膜閥對取樣 口進行滅菌，滅菌時間20min，關閉蒸汽閥門。用火焰封住取樣口，將滅過菌的取 樣瓶口置于火焰上灼燒，拔出瓶塞，同時，戴好手套，擰開取樣閥，先放出30mL 發(fā)酵液棄之，再接入30mL作為樣品。取樣后，關閉取樣閥，打開蒸汽閥門，對取 樣閥再進行5-10min滅菌。關閉蒸汽發(fā)生器，

15、對樣品進行鏡檢，測定酶活。 8.放罐：到達發(fā)酵時間后，須放罐。放罐通過底閥進行，放罐前30min，打開蒸汽 發(fā)生器，通過底閥手動隔膜閥對底閥滅菌20min；適當提高轉(zhuǎn)速及罐壓，用不銹鋼 桶接住，旋松底閥開關，將發(fā)酵液放入不銹鋼桶內(nèi)。 9.放罐完畢，關閉蒸汽發(fā)生器，停止攪拌，及時將發(fā)酵罐清洗干凈，以防染菌污染 。 10.發(fā)酵罐清洗完畢后，對發(fā)酵罐要實施空罐滅菌，對罐體、過濾器、管道、閥門 等進行滅菌消毒。 11.實驗報告：根據(jù)所記錄的數(shù)據(jù)，繪制pH、DO、生物量、酶活、殘?zhí)橇繉Πl(fā)酵 時間的動態(tài)曲線圖。 九、 溶氧（DO）與轉(zhuǎn)速的關聯(lián) 1.在“DO控制”界面，點擊“高級”。 2.在“DO高級控制”

16、界面,將“轉(zhuǎn)速DO關聯(lián)”設為“ON”，”系數(shù)”設為5-50 ，取值越大關聯(lián)度越小。再設“DO高級控制”旁邊的“OFF”為“ON”，點擊 “返回”。 “DO控制”為“ON”。 3.DO與轉(zhuǎn)速相關聯(lián)后，轉(zhuǎn)速設定值不再起作用。50rpm轉(zhuǎn)速700rpm 4.在“轉(zhuǎn)速控制”界面，點擊“高級”。 5.在“轉(zhuǎn)速高級控制”界面，“轉(zhuǎn)速設定值”與正常所需轉(zhuǎn)速相同，“轉(zhuǎn)速DO 關聯(lián)”為“ON”， “轉(zhuǎn)速高級控制”為“ON”， 按“返回”。 “轉(zhuǎn)速控制” 為“ON”。 6.轉(zhuǎn)速與DO關聯(lián)后，轉(zhuǎn)速設定值不再起作用。50rpm轉(zhuǎn)速700rpm 7.注意：當下位機不顯示，需重啟時，一定要將轉(zhuǎn)速與DO關聯(lián)取消，先采用 1

17、00-200rpm轉(zhuǎn)速待DO值上升后，再設定轉(zhuǎn)速與DO關聯(lián)。否則，會造成電機高 速飛轉(zhuǎn)損毀。 8.考慮到泡沫過多易堵塞尾氣過濾芯的情況，不建議將DO-轉(zhuǎn)速進行關聯(lián)。轉(zhuǎn)速 維持在250rpm左右。 十、發(fā)酵罐工作組織流程 1、罐體清洗：對罐體、攪拌槳、各管路清洗疏通。 2、空罐消毒：空消兼保壓試驗。121，20min，罐壓0.15MPa。 3、實際裝料滅菌（實消）：實消前，將校正好的pH、DO電極裝入發(fā)酵罐，滅 菌后，需對pH、DO電極在線校正。此過程還需對機封軸、取樣閥、放料閥、 級空氣過濾器、尾氣過濾器滅菌。 121，30min（閥門、過濾器為20min）， 罐壓0.15MPa。 4、發(fā)酵培養(yǎng)：罐壓維持0.02-0.03MPa。記錄罐溫、攪拌速度、通氣量、罐壓 、pH、DO、泡沫變化、發(fā)酵液粘稠度、發(fā)酵液顏色等數(shù)據(jù)。每隔12hr取樣一次 。根據(jù)所記錄的數(shù)據(jù)，繪制pH、DO、生物量、酶活、殘?zhí)橇繉Πl(fā)酵時間的動態(tài) 曲線圖。 5、放罐及后續(xù)工藝處理階段：放罐完畢，取下pH、DO電極，清洗干凈后，裝 入電極保護液套中保存。發(fā)酵液進入后續(xù)處理工藝。 6、罐體清洗：關閉蒸汽發(fā)生器、停止攪拌，及時將發(fā)酵罐、攪拌槳等清洗干凈 ，防止微生物污染、擴散。 7、空罐消毒：對發(fā)酵罐中殘存微生物滅菌。此過程還需對機封軸、取樣閥、放 料閥、級空氣過濾器、尾氣過濾器滅菌。 121