流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理

1、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞）是以流式細(xì)胞 儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)或生物學(xué) 顆粒顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。 原理：原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素 染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的 強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒微粒)的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。的性狀進(jìn)行定性、

2、定量分析和分選。 流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀（Flow CytometerFlow Cytometer ）是集細(xì)胞與）是集細(xì)胞與 分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、 計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù) 為一體的一種新型高科技儀器。為一體的一種新型高科技儀器。 流式細(xì)胞儀特點(diǎn) 流式細(xì)胞儀的分類 n分析型分析型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。 n分選型分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 既能流式分析

3、，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選； 進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流 式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。 BD公司產(chǎn)品公司產(chǎn)品 FACS Calibur 雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高 FACSAria 科研型分選流式細(xì)胞儀 FACS Vantage DiVa 科研型（大型機(jī)） 特點(diǎn)： 多數(shù)字化 適用用各類細(xì)胞分選 4路分選 Beckman Coulter流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 Epics XL 單激光四色， 市場(chǎng)覆蓋率高，分析型 CyAn三激光九色，分析型 F

4、C 500 單激光或雙激光五色， 市場(chǎng)覆蓋率高，分析型 Gallios 三激光十色， 分析型 MoFlo XDP 高端分選型 第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)組成結(jié)構(gòu)組成 n液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) n光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) n電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng) n細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) n鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā) 展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩 種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì) 胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外 面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。 n流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)

5、定的液 流從截面積較大的部分流入流從截面積較大的部分流入 截面積較小的部分后，有一截面積較小的部分后，有一 個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直 徑被約束在徑被約束在10-20um，避免，避免 了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū) 。 鞘液鞘液鞘液鞘液 細(xì)胞流細(xì)胞流 激光照射點(diǎn)激光照射點(diǎn) 流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖 液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 進(jìn)樣速率控制進(jìn)樣速率控制 通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并 不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。

6、高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì) 胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。 光學(xué)原理光學(xué)原理 散射信號(hào)散射信號(hào)與與熒光信號(hào)熒光信號(hào) 熒光信號(hào)熒光信號(hào) 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài) ，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。 發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng)熒光波長(zhǎng)) Emission wavelength

7、激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng) Excitation wavelength Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540460 500 540460 500 540 光收集系統(tǒng)：濾光片 電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng) 電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成： n光電檢測(cè)器光電檢測(cè)器 將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。 n前置放大電路前置放大電路 將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。 n模數(shù)轉(zhuǎn)換器模數(shù)轉(zhuǎn)換器 將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。 n數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)

8、數(shù)據(jù)采集、分析。 光電檢測(cè)器光電檢測(cè)器(photodetector) n光電二極管光電二極管(photodiode) 光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）；）； n光電倍增管光電倍增管(photomultiplier, PMT) 光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。 PMT 前向散射光前向散射光 光電二極管光電二極管 光信號(hào)的類型：光信號(hào)的類型： n散射光信號(hào)散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)， 是細(xì)胞的固有參數(shù)。是細(xì)胞的固有參數(shù)。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC);

9、側(cè)向散射光側(cè)向散射光(side scatter, SSC). n熒光信號(hào)熒光信號(hào) 自發(fā)熒光自發(fā)熒光 ：微弱：微弱 特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出 的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。 流式細(xì)胞分析的信息流式細(xì)胞分析的信息光信號(hào)檢測(cè)光信號(hào)檢測(cè) 流式細(xì)胞的基本信息流式細(xì)胞的基本信息: “形態(tài)形態(tài)” 散射光的作用散射光的作用 n實(shí)驗(yàn)中，常利用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同 的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。 粒細(xì)胞粒細(xì)胞 單核細(xì)胞單核細(xì)胞 淋

10、巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片 流式細(xì)胞的主要信息流式細(xì)胞的主要信息:Fluorescence nFL1 nFL2 nFL3 nFL4 最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記 的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合 nForward scatter (FSC)Forward scatter (FSC) nSide scatter (SSC)Side scatter (SSC) nFL1-FL1-綠色綠色 nFL2-FL2-、橙色橙色 nFL3-FL3-紅色紅色 nFL4-FL4-紅色紅色 488FL1BP 530/30515-545nm F

11、ITC（綠色，（綠色，520nm520nm） FL2BP 585/42564-606nm PE FL3670 LP670nm PE-Cy5、PerCP、PE- Cy7（紅色）（紅色） 635FL4BP 661/16653-669nm APC（紅色，（紅色，660nm660nm） 流式常見圖形流式常見圖形 (Histogram Plot) 適用于：?jiǎn)螀?shù)分析適用于：?jiǎn)螀?shù)分析 DNA倍體分析倍體分析抗原表達(dá)分析抗原表達(dá)分析 流式常見圖形流式常見圖形 (Dot Plot) 散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖偽彩圖偽彩圖 假三維圖和三維圖假三維圖和三維圖 SSC-Height FSC-Height Counts SSC

12、CD45 CD14 等高圖和密度圖等高圖和密度圖 n等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目 相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。 n密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方 細(xì)胞少。細(xì)胞少。 設(shè)門與數(shù)據(jù)分析設(shè)門與數(shù)據(jù)分析 n門門(Gate，簡(jiǎn)寫，簡(jiǎn)寫G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，F(xiàn)CM 數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。 橢圓形橢圓形圓形圓形 十字門十字門

13、線性門線性門 流式分選流式分選 電荷式電荷式分選分選 超聲振動(dòng)器超聲振動(dòng)器(15-100kHz) 液流充電系統(tǒng)液流充電系統(tǒng) 高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板 收集裝置收集裝置(流式管、培養(yǎng)板流式管、培養(yǎng)板) lasers 斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)(充電充電) 高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板 第二節(jié)第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用 n分析群體細(xì)胞分析群體細(xì)胞 n所需時(shí)間短所需時(shí)間短 n多參數(shù)分析多參數(shù)分析 n定性或定量定性或定量 流式應(yīng)用常見范圍流式應(yīng)用常見范圍 n細(xì)胞大小細(xì)胞大小 n細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞的顆粒度 n細(xì)胞表面分子：細(xì)胞表面分子：CD 系列等系列等 n細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因

14、子等 n細(xì)胞核內(nèi)分子：細(xì)胞核內(nèi)分子：P53 n細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、PH、 Ca+、細(xì)胞活性等、細(xì)胞活性等 樣品 培養(yǎng)細(xì)胞 新鮮組織 石蠟包埋 單細(xì)胞 懸液 標(biāo)記 熒光抗體 檢測(cè) 表型測(cè)定細(xì)胞分選 流式細(xì)胞術(shù)操作流程 統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析 繼續(xù) 培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理 n單細(xì)胞懸液的制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液的制備：胰酶消化胰酶消化 n抗體或標(biāo)記分子的染色：抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) n非特異結(jié)合的去除：非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體封閉：血清和同型抗體 細(xì)胞染色細(xì)胞染色 n染色要求：染色要求： 特異識(shí)別某一群細(xì)

15、胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群 非特異反應(yīng)水平低非特異反應(yīng)水平低 抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本 n使用特異的單克隆抗體使用特異的單克隆抗體 n最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體 n采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物 n抗體最適滴度抗體最適滴度 抗體的選擇抗體的選擇 n首選直接標(biāo)記抗體首選直接標(biāo)記抗體 n熒光分子：熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原 n間接標(biāo)記：間接標(biāo)記：適用范圍廣適用范圍廣, biotin-avidin不適不

16、適 合弱抗原的檢測(cè)合弱抗原的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì) n空白對(duì)照：空白對(duì)照：ALL n陰性對(duì)照：陰性對(duì)照：評(píng)估非特異反應(yīng)水平，界定陰性范圍 常用同型抗體對(duì)照常用同型抗體對(duì)照 單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照或同型抗體對(duì)照） 多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)照多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)照 （用于儀器校正），（用于儀器校正），補(bǔ)償調(diào)整管補(bǔ)償調(diào)整管 n陽(yáng)性對(duì)照：確定抗原表達(dá)正常時(shí)的抗原表達(dá)強(qiáng)度和百分含 量。（特別在檢測(cè)陰性時(shí)）（特別在檢測(cè)陰性時(shí)） 流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例 n細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè) n細(xì)胞

17、周期分析細(xì)胞周期分析 n細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡分析 淋巴細(xì)胞表面抗原分析淋巴細(xì)胞表面抗原分析 n樣本來(lái)源樣本來(lái)源 新鮮抗凝全血新鮮抗凝全血 PBMC n單克隆熒光抗體染色單克隆熒光抗體染色 n溶血溶血 n洗細(xì)胞洗細(xì)胞 n固定固定 n上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè) 淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析 n樣本來(lái)源樣本來(lái)源 新鮮抗凝全血新鮮抗凝全血 PBMC n細(xì)胞表面抗體染色細(xì)胞表面抗體染色 n溶血、固定溶血、固定 n細(xì)胞打孔細(xì)胞打孔 n細(xì)胞內(nèi)抗體染色細(xì)胞內(nèi)抗體染色 n上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè) 細(xì)胞周期分析：細(xì)胞周期分析： G1 M G2 S Quiescent cells G0 n處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞處于不

18、同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNADNA含量不同，含量不同， G G0 0/G/G1 1期細(xì)胞含有期細(xì)胞含有二倍體二倍體量的量的DNADNA，G G2 2/M/M期期 細(xì)胞含有細(xì)胞含有四倍體四倍體量的量的DNADNA，而，而S S期細(xì)胞期細(xì)胞DNADNA 含量處于含量處于二倍體和四倍體量之間二倍體和四倍體量之間。 nDNADNA熒光染料能與熒光染料能與DNADNA結(jié)合，結(jié)合，DNADNA含量的多含量的多 少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度 反應(yīng)了反應(yīng)了DNADNA吸收熒光分子的多少。通過流吸收熒光分子的多少。通過流 式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNADNA

19、的含量，區(qū)分的含量，區(qū)分 細(xì)胞周期的細(xì)胞周期的G G0 0/G/G1 1期、期、S S期和期和G G2 2/M/M期細(xì)胞比期細(xì)胞比 例。例。 樣品制備 上機(jī) DNA DNA 流式檢測(cè)的主要指標(biāo)流式檢測(cè)的主要指標(biāo) nDNA 含量含量: ploidy：細(xì)胞內(nèi)染色體細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量含量 DI：測(cè)定標(biāo)本的測(cè)定標(biāo)本的G0/G1期細(xì)胞期細(xì)胞DNA含量與同種系正常細(xì)含量與同種系正常細(xì) 胞的胞的G0/G1期細(xì)胞期細(xì)胞DNA含量的比值，表示細(xì)胞倍體性含量的比值，表示細(xì)胞倍體性 nPI：增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例 nCV： G0/G1期細(xì)胞期細(xì)胞DNA含量變異系數(shù)含量變異系數(shù) An

20、nexin V Assay （建議用于懸浮細(xì)胞）（建議用于懸浮細(xì)胞） 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位 于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)胞凋亡， 可以從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)迅速翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞 膜外側(cè)，使得PS 暴露在細(xì)胞膜表面。 在Ca2+存在時(shí)，Annexin V 與PS 有很 高的親和力，可與之迅速結(jié)合。PS 外 翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂、DNA 片段化以 及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得 Annexin V 與PS 的結(jié)合成為凋亡早期 的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。 PI 被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死 或晚期凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞可以同時(shí) 與annexin V-FITC 和PI 結(jié)合顯色，而 PI 則被排除在活細(xì)胞(F

21、ITC 陰性)和早 期凋亡細(xì)胞(FITC 陽(yáng)性)之外。 Annexin V-FITC/ PI雙染色法 雙陰：活細(xì)胞 Annexin V-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞 雙陽(yáng)：晚期凋亡細(xì)胞 PI 單陽(yáng)：壞死細(xì)胞 PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所 以以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。 Annexin V-FITCAnnexin V-FITC PIPI 活細(xì)胞活細(xì)胞 早期凋亡早期凋亡 晚期凋亡晚期凋亡 壞死細(xì)胞壞死細(xì)胞 裸核裸核 進(jìn)樣速率控制進(jìn)樣速率控制 通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并通過改變

22、樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并 不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。 高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì) 胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。 電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成： n光電檢測(cè)器光電檢測(cè)器 將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。 n前置放大電路前置放大電路 將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。 n模數(shù)轉(zhuǎn)換器模數(shù)轉(zhuǎn)換器 將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。 n數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。 nForward scatter (FSC)Forward scatter (FSC) nSide scatter (SSC)Side scatter (SSC) nFL1-FL1-綠色綠色 nFL2-FL2-、橙色橙色 nFL3-FL