生化藥物和基因工程藥物分析概念

1、第十三章 生化藥物和基因工程藥物分析 概念 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 生物藥物（生物藥物（biopharmaceuticsbiopharmaceutics或或 biopharmaceuticalsbiopharmaceuticals）是利用生物體、生）是利用生物體、生 物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、 生物化學(xué)等學(xué)科的原理與方法制得的天然生物化學(xué)等學(xué)科的原理與方法制得的天然 生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天 然物質(zhì)類似物。然物質(zhì)類似物。 生物藥物主要包括生化藥物生物藥物主要包括生化藥物 （biochemical dr

2、ugsbiochemical drugs）、生物技術(shù)藥物）、生物技術(shù)藥物 （bio-technology drugs)bio-technology drugs)和生物制品和生物制品 （biological products)biological products)等。等。 生化藥物是從動(dòng)物、植物及微生生化藥物是從動(dòng)物、植物及微生 物等生物體分離純化制得的生化基本物等生物體分離純化制得的生化基本 物質(zhì)，以及用化學(xué)合成、微生物合成物質(zhì)，以及用化學(xué)合成、微生物合成 或現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)或現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì) 及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié) 構(gòu)修

3、飾物等，如氨基酸、多膚、蛋白構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多膚、蛋白 質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核昔酸類等。質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核昔酸類等。 生物技術(shù)是利用生物體或其組生物技術(shù)是利用生物體或其組 成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系，用現(xiàn)成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系，用現(xiàn) 代生物技術(shù)研制的藥物稱為生物技代生物技術(shù)研制的藥物稱為生物技 術(shù)藥物（或生物工程藥物）。術(shù)藥物（或生物工程藥物）。 基因工程藥物（基因工程藥物（Genetic Genetic engineering drugsengineering drugs）：系指先確定）：系指先確定 對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋 白質(zhì)，然后將控制

4、該蛋白合成過程的白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成過程的 基因分離、純化或進(jìn)行人工合成，利基因分離、純化或進(jìn)行人工合成，利 用重組用重組DNADNA技術(shù)加以改造，最后將該技術(shù)加以改造，最后將該 基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中 不斷繁殖，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有不斷繁殖，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有 預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過 這種方法生產(chǎn)的新型藥物稱為基因工這種方法生產(chǎn)的新型藥物稱為基因工 程藥物。程藥物。 生物制品是應(yīng)用普通的或以生物制品是應(yīng)用普通的或以 基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工 程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲

5、得的程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的 微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源 的組織和體液等生物材料制備，的組織和體液等生物材料制備， 用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷 的藥品。的藥品。 一生化藥物和基因工程藥物的定義一生化藥物和基因工程藥物的定義 1.1.生化藥物生化藥物 2.2.基因工程藥物基因工程藥物 二、生化藥物和基因工程藥物的種類二、生化藥物和基因工程藥物的種類 （一）生化藥物的種類（一）生化藥物的種類 1.1.氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥物：?jiǎn)伟被?、多肽與蛋白質(zhì)類藥物：?jiǎn)?氨基酸、氨基酸衍生物和復(fù)合氨基酸氨基酸、氨基酸衍生物和復(fù)合氨基酸 類，消化

6、道多肽、下丘腦多肽、腦多類，消化道多肽、下丘腦多肽、腦多 肽、激肽等；動(dòng)、植物蛋白。肽、激肽等；動(dòng)、植物蛋白。 2.2.酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、 凝血酶及抗栓酶，輔酶凝血酶及抗栓酶，輔酶Q10Q10等。等。 3.3.多糖類藥物多糖類藥物: :肝素、硫酸軟骨素肝素、硫酸軟骨素 A A和和C;C;靈芝多糖、人參多糖、海藻靈芝多糖、人參多糖、海藻 多糖、多糖等類肝素。多糖、多糖等類肝素。 4.4.脂質(zhì)類藥物脂質(zhì)類藥物: :多價(jià)不飽和脂肪多價(jià)不飽和脂肪 酸（酸（PUFAPUFA）、磷脂類、固醇類類）、磷脂類、固醇類類 等。等。 5.5.核酸及其降解物和衍生物類藥

7、核酸及其降解物和衍生物類藥 物物:RNA:RNA、DNADNA、多聚胞昔酸、琉、多聚胞昔酸、琉 基聚胞昔酸、基聚胞昔酸、ATPATP和和cAMPcAMP等。等。 （二）基因工程藥物的種類（二）基因工程藥物的種類 基因工程基因工程DNADNA重組藥物主要成重組藥物主要成 分為多膚或蛋白質(zhì)類，大致可分分為多膚或蛋白質(zhì)類，大致可分 為以下三大類：為以下三大類： 1.1.激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物： 人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子（人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子（human human somatotinsomatotin ) )，人胰島素（，人胰島素（human human insulin)in

8、sulin)，人生長(zhǎng)激素（，人生長(zhǎng)激素（human human growth hormonegrowth hormone） 2.2.細(xì)胞因子類藥物：人干擾素細(xì)胞因子類藥物：人干擾素 （human interferonshuman interferons），人白細(xì)胞），人白細(xì)胞 介素（介素（human interleukinahuman interleukina) )，集落，集落 刺激因子（刺激因子（colony-stimulating colony-stimulating factorsfactors，CSF)CSF)，促紅細(xì)胞生成素，促紅細(xì)胞生成素 （erythropoietinerythr

9、opoietin，EPOEPO） 3.3.酶類及凝血因子類藥物：?jiǎn)慰嗣割惣澳蜃宇愃幬铮簡(jiǎn)慰?隆抗體、疫苗、基因治療藥物、隆抗體、疫苗、基因治療藥物、 白介素、生長(zhǎng)因子、內(nèi)啡肽、反白介素、生長(zhǎng)因子、內(nèi)啡肽、反 義藥物、人生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞義藥物、人生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞 生成素、腫瘤壞死因子等。生成素、腫瘤壞死因子等。 三、生化藥物和基因工程藥物的特點(diǎn) 1.基因工程藥物具有細(xì)胞和組織 特異性，形成受體一配體復(fù)合物；多 數(shù)細(xì)胞因子具有多功能性，具有廣泛 的藥理活性；細(xì)胞因子間存在復(fù)雜的 相互作用，臨床使用有時(shí)需要幾種生 長(zhǎng)因子配合使用；具有低免疫活性。 許多基因工程藥物是參與人體一些生 理功能所必

10、需的蛋白質(zhì)，極微量產(chǎn)生 顯著的效應(yīng)。 2.2.分子量大分子量大 大部分為蛋白質(zhì)、多膚、大部分為蛋白質(zhì)、多膚、 多糖、核酸類等大分子的化合物，有多糖、核酸類等大分子的化合物，有 的化學(xué)結(jié)構(gòu)不確定，分析時(shí)需進(jìn)行純的化學(xué)結(jié)構(gòu)不確定，分析時(shí)需進(jìn)行純 度檢查和分子量的測(cè)定。對(duì)大分子的度檢查和分子量的測(cè)定。對(duì)大分子的 藥物而言，即使組分相同，由于分子藥物而言，即使組分相同，由于分子 量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。 3.3.結(jié)構(gòu)確證難結(jié)構(gòu)確證難 4.4.全過程的質(zhì)量控制全過程的質(zhì)量控制 原材料、生原材料、生 產(chǎn)過程和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。產(chǎn)過程和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 5.生物活性檢查 生物檢

11、定法 6.安全性檢查 例如熱原檢查、過敏 試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)、致突變?cè)囼?yàn)和 生殖毒性試驗(yàn)等。 7.效價(jià)（含量）測(cè)定 通過理化分 析進(jìn)行含量測(cè)定，但酶類需進(jìn)行效價(jià) 測(cè)定或酶活力測(cè)定，以表明其有效成 分的生物活性。 8.8.生化藥物和基因工程藥物生物活性質(zhì)量控生化藥物和基因工程藥物生物活性質(zhì)量控 制特點(diǎn)。制特點(diǎn)。 生化藥物和甚因工程藥物生物活性質(zhì)量生化藥物和甚因工程藥物生物活性質(zhì)量 控制對(duì)比控制對(duì)比 生物測(cè)定生物測(cè)定 理化測(cè)定理化測(cè)定 傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)傳統(tǒng)工藝生產(chǎn) DNADNA重組技術(shù)生產(chǎn)重組技術(shù)生產(chǎn) 結(jié)構(gòu)不明、組分變異、結(jié)構(gòu)不明、組分變異、 產(chǎn)品不純產(chǎn)品不純 結(jié)構(gòu)明確、組分單一、結(jié)構(gòu)明確、組分單一、

12、 產(chǎn)品高純產(chǎn)品高純 生物測(cè)定法檢測(cè)活性生物測(cè)定法檢測(cè)活性 上市前的生物活性檢測(cè)上市前的生物活性檢測(cè) 常規(guī)質(zhì)控常規(guī)質(zhì)控 生物測(cè)定生物測(cè)定 常規(guī)質(zhì)控常規(guī)質(zhì)控 理化測(cè)定理化測(cè)定 第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法 一、鑒別試驗(yàn)一、鑒別試驗(yàn) （一）理化鑒別法（一）理化鑒別法 1.1.化學(xué)鑒別法化學(xué)鑒別法 利用藥物與某些利用藥物與某些 試劑在一定條件下的呈色反應(yīng)、沉試劑在一定條件下的呈色反應(yīng)、沉 淀反應(yīng)等，生成具有顏色的產(chǎn)物或淀反應(yīng)等，生成具有顏色的產(chǎn)物或 沉淀進(jìn)行鑒別。沉淀進(jìn)行鑒別。 2.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 利用藥物利用藥物 中的共扼系統(tǒng)在紫外區(qū)有特征中的共扼系

13、統(tǒng)在紫外區(qū)有特征 吸收用于鑒別。蛋白或多肽分吸收用于鑒別。蛋白或多肽分 子的最大吸收波長(zhǎng)是固定的。子的最大吸收波長(zhǎng)是固定的。 3.3.高效液相色譜法高效液相色譜法 利用對(duì)照品溶利用對(duì)照品溶 液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和 肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。凡有紫外肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。凡有紫外 吸收的物質(zhì)均能在圖譜上顯示出來，吸收的物質(zhì)均能在圖譜上顯示出來， 一般要求純度要達(dá)一般要求純度要達(dá)95%95%以上。肽圖分以上。肽圖分 析、氨基酸成分和序列分析合并研究，析、氨基酸成分和序列分析合并研究， 可作為蛋白質(zhì)等天然產(chǎn)品精密比較的可作為蛋白質(zhì)等天然產(chǎn)品精密比較的 手段。

14、手段。 （二）生化鑒別法（二）生化鑒別法 酶法酶法 、電泳法、樣品脫鹽后、電泳法、樣品脫鹽后 用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定 （三）生物鑒別法（三）生物鑒別法 利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別 藥物，家兔驚厥試驗(yàn)藥物，家兔驚厥試驗(yàn) 二、雜質(zhì)檢查二、雜質(zhì)檢查 （一）一般雜質(zhì)檢查（一）一般雜質(zhì)檢查 （二）特殊雜質(zhì)檢查（二）特殊雜質(zhì)檢查 1.1.原料藥的純度分析原料藥的純度分析 多糖類，酶類藥物純度分析多糖類，酶類藥物純度分析 2.2.生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查 基因基因 工程藥物的生產(chǎn)過程更為復(fù)雜，質(zhì)工程藥物的生產(chǎn)過程更為復(fù)雜，質(zhì) 量須全面控制。量須全面控制。

15、三、安全性檢查三、安全性檢查 （一）熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢（一）熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢 查法查法 （二）異常毒性試驗(yàn)（二）異常毒性試驗(yàn) 異常毒性試驗(yàn)是用一定劑量的異常毒性試驗(yàn)是用一定劑量的 藥物按指定的操作方法和給藥途徑藥物按指定的操作方法和給藥途徑 給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀 察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以 試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。 是限度試驗(yàn)是限度試驗(yàn) （三）過敏試驗(yàn)（三）過敏試驗(yàn) 過敏試驗(yàn)是檢查異性蛋白的試過敏試驗(yàn)是檢查異性蛋白的試 驗(yàn)。驗(yàn)。 （四）降壓物質(zhì)試驗(yàn)（四）降壓物質(zhì)試驗(yàn) 降壓物質(zhì)試驗(yàn)是指

16、某些藥物中降壓物質(zhì)試驗(yàn)是指某些藥物中 含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包 括組胺、類組胺或其它導(dǎo)致血壓降括組胺、類組胺或其它導(dǎo)致血壓降 低的物質(zhì)。中國(guó)藥典采用貓（或狗）低的物質(zhì)。中國(guó)藥典采用貓（或狗） 血壓法檢查藥物中所含有的降壓物血壓法檢查藥物中所含有的降壓物 質(zhì)。質(zhì)。 （五）無菌試驗(yàn)（五）無菌試驗(yàn) 無菌試驗(yàn)是檢查藥品及敷料是否無菌試驗(yàn)是檢查藥品及敷料是否 染有活菌的一種方法。染有活菌的一種方法。 （六）基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污（六）基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污 染物檢查染物檢查 基因工程藥物中可能的雜質(zhì)有殘基因工程藥物中可能的雜質(zhì)有殘 留留DNADNA、宿主細(xì)胞蛋

17、白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋 白質(zhì)突變體和蛋白質(zhì)裂解物等。主要白質(zhì)突變體和蛋白質(zhì)裂解物等。主要 污染物有微生物、熱原和病毒等。主污染物有微生物、熱原和病毒等。主 要檢查項(xiàng)目有外源性要檢查項(xiàng)目有外源性DNADNA、宿主細(xì)胞蛋、宿主細(xì)胞蛋 白質(zhì)、其它有關(guān)雜質(zhì)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢白質(zhì)、其它有關(guān)雜質(zhì)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢 查。查。 （七）致突變?cè)囼?yàn)（七）致突變?cè)囼?yàn) （八）生殖毒性試驗(yàn)（八）生殖毒性試驗(yàn) 四、含量（效價(jià)）測(cè)定四、含量（效價(jià)）測(cè)定 生化藥物和基因工程藥物的含量生化藥物和基因工程藥物的含量 表示方法通常有兩種，一種用百分含表示方法通常有兩種，一種用百分含 量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥量

18、表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥 物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另 一種用生物效價(jià)或酶活力單位表示，一種用生物效價(jià)或酶活力單位表示， 適用于酶類和蛋白質(zhì)類等藥物的測(cè)定。適用于酶類和蛋白質(zhì)類等藥物的測(cè)定。 （一）含量測(cè)定：（一）含量測(cè)定：HPLCHPLC法、十二烷基法、十二烷基 硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳法硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳法 （SDS-PAGESDS-PAGE法）法） （二）效價(jià)測(cè)定（二）效價(jià)測(cè)定 效價(jià)測(cè)定均采用國(guó)際或國(guó)家參考效價(jià)測(cè)定均采用國(guó)際或國(guó)家參考 品，或經(jīng)過國(guó)家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考品，或經(jīng)過國(guó)家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考 品，以體內(nèi)或體外法（細(xì)胞法）測(cè)定品，

19、以體內(nèi)或體外法（細(xì)胞法）測(cè)定 其生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。其生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。 一般用免疫學(xué)方法測(cè)定的效價(jià)不能代一般用免疫學(xué)方法測(cè)定的效價(jià)不能代 替生物學(xué)效價(jià)，只能作為中間品的質(zhì)替生物學(xué)效價(jià)，只能作為中間品的質(zhì) 量控制。在測(cè)定效價(jià)的同時(shí)，應(yīng)測(cè)定量控制。在測(cè)定效價(jià)的同時(shí)，應(yīng)測(cè)定 蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出特異比活性，活蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出特異比活性，活 性以單位數(shù)毫克蛋白（性以單位數(shù)毫克蛋白（IU/mgIU/mg）表）表 示。示。 第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng) 用用 一、理化分析法一、理化分析法 包括化學(xué)分析包括化學(xué)分析 法（重量法、滴定分析法）、電法（重量法、

20、滴定分析法）、電 化學(xué)分析法、光譜分析法（比色化學(xué)分析法、光譜分析法（比色 法、紫外分光光度法、熒光分光法、紫外分光光度法、熒光分光 光度法）和色譜法（高效液相色光度法）和色譜法（高效液相色 譜法、灌注色譜法和高效毛細(xì)管譜法、灌注色譜法和高效毛細(xì)管 電泳法）等。電泳法）等。 （一）化學(xué)分析法（一）化學(xué)分析法 1.1.重量法根據(jù)樣品中分離出的重量法根據(jù)樣品中分離出的 單質(zhì)或化合物的重量測(cè)定所含成分單質(zhì)或化合物的重量測(cè)定所含成分 的含量。根據(jù)被測(cè)組分分離方法的的含量。根據(jù)被測(cè)組分分離方法的 不同，可分為提取法、揮發(fā)法和沉不同，可分為提取法、揮發(fā)法和沉 淀法等。淀法等。 2.2.滴定分析法滴定分析法

21、 （二）電化學(xué)分析法（二）電化學(xué)分析法 （三）光譜分析法（三）光譜分析法 比色法、紫外分光光度法、熒比色法、紫外分光光度法、熒 光分光光度法光分光光度法 （四）色譜分析法（四）色譜分析法 1.1.高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC）具有在）具有在 分離過程中不破壞樣品的特點(diǎn)，特別分離過程中不破壞樣品的特點(diǎn)，特別 適合于對(duì)高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和適合于對(duì)高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和 熱穩(wěn)定性差的生化藥物的分析。熱穩(wěn)定性差的生化藥物的分析。 （1 1）反相高效液相色譜法（）反相高效液相色譜法（RP-RP- HPLCHPLC）固定相：）固定相：C C8 8、 、C C1818烷基硅烷鍵合

22、烷基硅烷鍵合 相流動(dòng)相：甲醇、水或乙腈，紫外、相流動(dòng)相：甲醇、水或乙腈，紫外、 熒光檢測(cè)器。熒光檢測(cè)器。 (2) (2)高效離子交換色譜法高效離子交換色譜法 （HPIEC )HPIEC )具有以下特點(diǎn)：具有以下特點(diǎn)： 1)1)根據(jù)相應(yīng)的離子化程度對(duì)蛋根據(jù)相應(yīng)的離子化程度對(duì)蛋 白質(zhì)、多肽進(jìn)行分離白質(zhì)、多肽進(jìn)行分離 2)2)鹽濃度梯度洗脫法鹽濃度梯度洗脫法 3)3)柱效中等并具有較高質(zhì)量的柱效中等并具有較高質(zhì)量的 活性回收活性回收 （3 3）高效凝膠過濾色譜法）高效凝膠過濾色譜法 （HPGFCHPGFC） HPGFCHPGFC可用于多肽和蛋白質(zhì)可用于多肽和蛋白質(zhì) 等生物藥物的分離及其分子量的等生物

23、藥物的分離及其分子量的 測(cè)定。測(cè)定。 HPGFCHPGFC具有如下特點(diǎn)：具有如下特點(diǎn)： 1)1)活性蛋白質(zhì)可以回收活性蛋白質(zhì)可以回收 2)2)在固定比例的水溶液中進(jìn)行的在固定比例的水溶液中進(jìn)行的 分離分離 3)3)是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中 相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的分離。當(dāng)?shù)跋鄳?yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的分離。當(dāng)?shù)?白質(zhì)具有相同形狀（如球狀或纖維狀）白質(zhì)具有相同形狀（如球狀或纖維狀） 時(shí)，通?？梢愿鶕?jù)分子量來預(yù)示組分時(shí)，通?？梢愿鶕?jù)分子量來預(yù)示組分 的洗脫順序，故可用來測(cè)定蛋白類藥的洗脫順序，故可用來測(cè)定蛋白類藥 物的分子量。物的分子量。 2.2.灌注色譜法灌注色譜法 1.1.

24、基本理論基本理論 2.2.灌注色譜法主要用于基因工程灌注色譜法主要用于基因工程 藥物和其它大分子藥物的分離純化和藥物和其它大分子藥物的分離純化和 分析。分析。 3.3.高效毛細(xì)管電泳法（高效毛細(xì)管電泳法（HPCEHPCE） 毛細(xì)管電泳法是根據(jù)帶電組分在毛細(xì)管電泳法是根據(jù)帶電組分在 管中由于其所帶電荷和分子量的大小，管中由于其所帶電荷和分子量的大小， 即荷質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而即荷質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而 進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。 二、酶法二、酶法 酶法包括兩種類型：酶法包括兩種類型：“酶活力酶活力 測(cè)定法測(cè)定法”；“酶分析法酶分析法”。二者檢。二者檢 測(cè)的對(duì)象雖有所不同，但原理和方測(cè)的對(duì)

25、象雖有所不同，但原理和方 法都是以酶能專一而高效地催化案法都是以酶能專一而高效地催化案 些化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對(duì)酶反應(yīng)些化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對(duì)酶反應(yīng) 速度的測(cè)定或生成物等濃度的測(cè)定速度的測(cè)定或生成物等濃度的測(cè)定 而檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。而檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。 （一）酶活力測(cè)定法（一）酶活力測(cè)定法 1.1.基本概念基本概念 所謂酶活力所謂酶活力 是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。 酶活力測(cè)定實(shí)質(zhì)上是測(cè)定一個(gè)被酶活力測(cè)定實(shí)質(zhì)上是測(cè)定一個(gè)被 酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反 應(yīng)速度可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物應(yīng)速度可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物 的減少或產(chǎn)物的增加來

26、表示，酶的減少或產(chǎn)物的增加來表示，酶 反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越 高。高。 國(guó)際理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)國(guó)際理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì) （IUPACIUPAC）和國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)）和國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì) （IBUIBU）推薦的）推薦的 酶單位定義：任何一種酶，系酶單位定義：任何一種酶，系 指在指在2525以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、最以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、?適當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)適當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng) 的的pHpH等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微 摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位 （國(guó)際單位，（國(guó)際單位，IUIU）。）

27、。 酶活力測(cè)定可采用物理法、酶活力測(cè)定可采用物理法、 化學(xué)法或酶分析法等。常用的方化學(xué)法或酶分析法等。常用的方 法有終點(diǎn)法、動(dòng)力學(xué)法或反應(yīng)速法有終點(diǎn)法、動(dòng)力學(xué)法或反應(yīng)速 率法。率法。 2.2.酶促反應(yīng)的條件及影響因素酶促反應(yīng)的條件及影響因素 選擇反應(yīng)條件的基本要求是選擇反應(yīng)條件的基本要求是 所有待測(cè)定的酶分子都應(yīng)該正常所有待測(cè)定的酶分子都應(yīng)該正常 地發(fā)揮其作用。確定反應(yīng)條件時(shí)地發(fā)揮其作用。確定反應(yīng)條件時(shí) 應(yīng)考慮底物濃度、應(yīng)考慮底物濃度、pHpH、溫度、輔、溫度、輔 助因子、空白和對(duì)照試驗(yàn)等因素，助因子、空白和對(duì)照試驗(yàn)等因素， 使其都處于最適于酶發(fā)揮催化作使其都處于最適于酶發(fā)揮催化作 用的水平。用的水平。 3. 3.測(cè)定方法測(cè)定方法 測(cè)定方法有取樣測(cè)定和連續(xù)測(cè)測(cè)定方法有取樣測(cè)定和連續(xù)測(cè) 定法。定法。 檢測(cè)方法：常用的有紫外一可檢測(cè)方法：常用的有紫外一可 見分光光度法和熒光分光光度法、見分光光度法和熒光分光光度法、 旋光度法、酶偶聯(lián)測(cè)定法。旋光度法、酶偶聯(lián)測(cè)定法。 （二）酶分析法