第四章 高效液相色譜

1、 一、一、 高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較 高速、高速、高效、高靈敏度。高速、高速、高效、高靈敏度。 HPLC一個(gè)突出的特點(diǎn)，供液壓力和進(jìn)樣壓力可達(dá)一個(gè)突出的特點(diǎn)，供液壓力和進(jìn)樣壓力可達(dá) 高速：高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度 極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分 析需時(shí)數(shù)小時(shí)。析需時(shí)數(shù)小時(shí)。 高效：高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻 力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)

2、完成數(shù)百種物質(zhì)的力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的 分離。分離。 高靈敏度：高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：檢測(cè)器靈敏度極高：UV10-9g, 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器 10-11g。 4-2 影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素 理理 nLH/ 222 1 2 ()5.54()16() RRR ttt n YY 理 effeff nLH/ 22 1 2 5.54()16() RR eff tt n YY R M t k t 2 ) 1 ( k k nneff 理 /HAB uC u（填充柱） （毛細(xì)管柱）或uCuBH/ dpA2dpA gm DDB22 gR

3、DBtB， M T D T D gg 或 使用細(xì)粒的固定相并填充均勻可減小使用細(xì)粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。，提高柱效。 減小減小B值，提高柱效的措施：使用分子量較大的載氣，值，提高柱效的措施：使用分子量較大的載氣， 增加載氣流速，降低溫度，增大柱壓。增加載氣流速，降低溫度，增大柱壓。 g p D d k k 2 2 2 )1 ( 01. 0 2 2 2 3 (1) f l d k kD Ig CCC 采用粒度小的填充物和相對(duì)分采用粒度小的填充物和相對(duì)分 子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做 載氣，可使載氣，可使Cg減小，提高柱效。減小，提高柱效。 一般采用表面積較

4、大的載一般采用表面積較大的載 體來(lái)降低液膜厚度。應(yīng)控體來(lái)降低液膜厚度。應(yīng)控 制適宜的柱溫。制適宜的柱溫。 Cu u B AH 氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式基本一致，主氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式基本一致，主 要要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì)區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì),影響柱效的主要因素影響柱效的主要因素 是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。 (2) 縱向擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)Hb可忽略可忽略 u DC H mb b 同于氣相色譜同于氣相色譜 分子在液相中分子在液相中 的擴(kuò)散系數(shù)比的擴(kuò)散系數(shù)比 在氣相中小在氣相中小 45數(shù)量級(jí)。數(shù)量級(jí)。 (3) 傳質(zhì)阻力項(xiàng)傳質(zhì)阻力項(xiàng)

5、Cu u D dC H s fs s 2 k sf s Cd D ：與 有關(guān)的系數(shù)；：固定液的厚度； ：試樣分子在固定液內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)。 u D dC H m pm m 2 k mp m Cd D ：與 有關(guān)的系數(shù)；：固定相粒度； ：試樣分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。 sm C ：為常數(shù) 使用細(xì)粒的固定相，粒度規(guī)則，并填充均勻，固定相孔徑使用細(xì)粒的固定相，粒度規(guī)則，并填充均勻，固定相孔徑 大，可減小大，可減小Hm，提高柱效。，提高柱效。 2 smp sm m C d Hu D 222 2 sfmpsmp dm p smm B HACu u C dC dC d C D du uDDD 問(wèn)題：氣相色譜與

6、液相色譜的問(wèn)題：氣相色譜與液相色譜的H-u曲線有何不同，曲線有何不同， 是什么原因造成的？是什么原因造成的？ 4. 影響高效液相色譜擴(kuò)展的其它因素影響高效液相色譜擴(kuò)展的其它因素 一、分配色譜一、分配色譜 原理：原理： 根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而 具有不同的分配系數(shù)。具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種 分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí) 現(xiàn)分離的過(guò)程。現(xiàn)分離的過(guò)程。 2. 流動(dòng)相流動(dòng)相: HPLC

7、分析中，為防止固定相的流失，分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)流動(dòng)相與固定液應(yīng) 盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。 正相分配色譜正相分配色譜：流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先：流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先 流出，適于極性組分分離。流出，適于極性組分分離。 1. 反相分配色譜反相分配色譜：流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先：流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先 流出，適于非極性組分分離。流出，適于非極性組分分離。 固定相極性小固定相極性小 如硅膠如硅膠-C18，硅膠硅膠-苯基；苯基； 流動(dòng)相極性大流動(dòng)相極性大 甲醇甲醇-水

8、、乙腈水、乙腈-水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。 反相鍵合色譜法反相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析對(duì)象 多用于多環(huán)芳烴多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流等低極性化合物分離；改變流 動(dòng)相配比，動(dòng)相配比，也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離 解的化合物，如有機(jī)解的化合物，如有機(jī)有機(jī)酸、有機(jī)酸、有有機(jī)機(jī)堿和酚堿和酚類(lèi)類(lèi)。 固定相極性固定相極性大大 硅膠硅膠-OH(或雙或雙-OH)，硅膠硅膠-CN 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性小小 烴類(lèi)烴類(lèi)+適量極性溶劑適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相鍵合色譜法相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析

9、對(duì)象 多用于極性或中等極性化合物的分離。多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離還可用于分離 異構(gòu)體、異構(gòu)體、極性不同的化合物以及不同類(lèi)型的化合物。極性不同的化合物以及不同類(lèi)型的化合物。 正相鍵合色譜中，隨流動(dòng)相極性增加，組分分配比正相鍵合色譜中，隨流動(dòng)相極性增加，組分分配比k增加。增加。 在在HPLC分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽碳酸銨、四烷基銨鹽) 或酸，為什么？或酸，為什么？ 答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類(lèi)是為了減少待測(cè)物與鍵合相表答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類(lèi)是為了減少待測(cè)物與鍵合相表 面的殘留硅醇基作用；加入

10、酸是抑制酸類(lèi)待測(cè)物的離解，使其以游離酸在面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類(lèi)待測(cè)物的離解，使其以游離酸在 柱內(nèi)分離。柱內(nèi)分離。 反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。 3. 固定相固定相 常用的固定液只有幾種，按極性由高到低為：常用的固定液只有幾種，按極性由高到低為： , -氧二丙腈氧二丙腈 (ODPN)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇、三甲撐二醇(TMG)、十八烷、十八烷(C18)、 角鯊?fù)榻酋復(fù)?SQ)。 1）機(jī)械涂漬固定相：）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面 多孔型多孔

11、型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型載體或全多孔型載體(5-10%涂布量涂布量)上形成的上形成的 液液色譜固定相。液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離 穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。 為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱前置柱，該，該 柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析 柱之前，預(yù)先被固定液飽和。柱之前，預(yù)先被固定液飽和。 2）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相

12、化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形 成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。 這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配， 而是二者兼而有之。化學(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。 對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。 通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：通常，化學(xué)鍵合相

13、的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）： Si-O-R：對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因?qū)岵环€(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因 此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。 Si-R(或或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方 便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其pH應(yīng)在應(yīng)在4-8之間。之間。 Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。 HClSiROSiiClSROHSi)( RSiClSiOHS

14、i)( ROSiOHROHSi)( 33 RMgClRLiSOCl SOCl 2 2 硅硅烷烷化化方方法法三三 先先氯氯化化方方法法二二 硅硅酯酯化化方方法法一一 或或 三、離子交換色譜三、離子交換色譜 既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、 核酸等。核酸等。 1. 原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能 力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上帶力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上帶 電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：電荷

15、基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)： 對(duì)陽(yáng)離子對(duì)陽(yáng)離子，滯留順序?yàn)椋海瑴繇樞驗(yàn)椋?Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 對(duì)陰離子對(duì)陰離子，滯留順序?yàn)椋海瑴繇樞驗(yàn)椋簷幟仕岣鶛幟仕岣? SO42-, C2O4, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- ClXNRRXClNR-R: HMSORMHSO-R: 33 -

16、3 - 3 陰離子交換陰離子交換 陽(yáng)離子交換陽(yáng)離子交換 2. 固定相固定相 按離子交換劑類(lèi)型分四種：按離子交換劑類(lèi)型分四種： 按固定相制作方法可分為：按固定相制作方法可分為： 多孔型離子交換樹(shù)脂多孔型離子交換樹(shù)脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹(shù)脂；包括薄膜型）離子交換樹(shù)脂； 離子交換鍵合型。離子交換鍵合型。 類(lèi)型類(lèi)型 官官能能團(tuán)團(tuán) 強(qiáng)強(qiáng)陽(yáng)陽(yáng)離離子子交換交換劑劑 -SO3- 陽(yáng)陽(yáng)離離子子交換交換劑劑 弱弱陽(yáng)陽(yáng)離離子子交換交換劑劑 -CO2- 強(qiáng)強(qiáng)陰陰離離子子交換交換劑劑 -NR3+ 陰陰離離子子交換交換劑劑 弱弱陰陰離離子子交換交換劑劑 -

17、NH2+ 1）多孔型：多孔型： 聚苯乙烯聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和 大孔型。交換基團(tuán)多大孔型。交換基團(tuán)多交換容量大，穩(wěn)交換容量大，穩(wěn) 定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速 度慢。度慢。 2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+樹(shù)脂薄層樹(shù)脂薄層(1-2 m) 多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅膠微球硅膠微球+樹(shù)脂薄層。樹(shù)脂薄層。 克服了多孔型離子交換樹(shù)脂的不足，但克服了多孔型離子交換樹(shù)脂的不足，但 交換容量低，柱子易超負(fù)荷。交換容量低，柱子易超負(fù)荷。 3）離子交換鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將離）離子交換鍵合相：利用化學(xué)

18、反應(yīng)將離 子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可 以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。 使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、 高柱效的柱子。高柱效的柱子。 微孔型微孔型 大孔型大孔型 微孔微孔微孔微孔 薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型 離子交換層離子交換層 惰性核惰性核惰性核惰性核 離子交換劑硅膠層涂覆離子交換劑硅膠層涂覆 3. 流動(dòng)相流動(dòng)相 離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類(lèi)緩沖溶液離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類(lèi)緩沖溶液(有一定有一定pH和離子強(qiáng)度。和離子強(qiáng)度。 pH值：值：影響酸或堿的離解平衡，

19、控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組 分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常 用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度I：對(duì)保留值的影響比對(duì)保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動(dòng)相中鹽類(lèi)更大。組分保留值受流動(dòng)相中鹽類(lèi) 總濃度控制。增加外加陰或陽(yáng)離子將增加它們對(duì)總濃度控制。增加外加陰或陽(yáng)離子將增加它們對(duì)R+或或R-的競(jìng)爭(zhēng)能的競(jìng)爭(zhēng)能 力，使組分保留值減小。通過(guò)加入不同種類(lèi)的鹽，可影響柱的選擇性

20、，力，使組分保留值減小。通過(guò)加入不同種類(lèi)的鹽，可影響柱的選擇性， 因?yàn)椴煌镔|(zhì)對(duì)交換劑的親和能力不同。因?yàn)椴煌镔|(zhì)對(duì)交換劑的親和能力不同。 有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留 值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。 配離子配離子L：當(dāng)大量當(dāng)大量L、組分、組分X隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換：隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換： RM-L+X RM-X+L 該法用于分離各種氨基酸或堿類(lèi)。該法用于分離各種氨基酸或堿類(lèi)。 四、離子色譜四、

21、離子色譜 離子色譜離子色譜(IC) 分離原理與離子交換色譜原理一樣，分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出只是流出 的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。 存在的問(wèn)題：存在的問(wèn)題：由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測(cè)離由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測(cè)離 子約高子約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。個(gè)數(shù)量級(jí)，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。 抑制型離子色譜：抑制型離子色譜：在離子交換柱之后，再串結(jié)一根在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱抑制柱。 該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹(shù)脂。通

22、過(guò)分離柱后 的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘暗臉悠吩俳?jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘?電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。 五、離子對(duì)色譜法（五、離子對(duì)色譜法（IPC） 分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。 1. 原理：將與待測(cè)物離子原理：將與待測(cè)物離子A電荷相反的離子電荷相反的離子B（稱(chēng)為對(duì)離（稱(chēng)為對(duì)離 子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子A與對(duì)離子與對(duì)離子B形成形成 離子對(duì)離子對(duì)AB，該，該AB離子對(duì)離子對(duì)的性質(zhì)與的性質(zhì)與A離子

23、離子或或B離子離子的性質(zhì)不同，的性質(zhì)不同， 即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。 例如：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，于流動(dòng)例如：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，于流動(dòng) 相中加入與待測(cè)離子相中加入與待測(cè)離子A-有相反電荷的離子有相反電荷的離子B+： 有有機(jī)機(jī)相相水水相相水水相相 BABA 六、尺寸排阻色譜法六、尺寸排阻色譜法 尺寸排阻色譜又稱(chēng)凝膠尺寸排阻色譜又稱(chēng)凝膠(滲透滲透)色譜，主要用于大分子的分離。色譜，主要用于大分子的分離。 1. 分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但

24、孔 徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔 穴中而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)，中等的部分滲透，小分子則完全穴中而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)，中等的部分滲透，小分子則完全 滲透，最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大小滲透，最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大小(分子量大小分子量大小)先后從先后從 柱中流出。柱中流出。 2. 固定相固定相 3. 流動(dòng)相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似流動(dòng)相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似(潤(rùn)濕凝膠潤(rùn)濕凝膠)、粘度小、粘度小(增加增加 擴(kuò)散速度擴(kuò)散速度)。 類(lèi)型類(lèi)型 材料材料 型號(hào)型號(hào) 特點(diǎn)特

25、點(diǎn) 流動(dòng)相流動(dòng)相 葡萄糖凝膠葡萄糖凝膠 Sephadax 水水 軟性凝膠軟性凝膠 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶脹溶脹,小分小分 子分離子分離 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 半剛性凝膠半剛性凝膠 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶脹溶脹較小較小 流速較小流速較小 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有機(jī)溶劑和水有機(jī)溶劑和水 剛性凝膠剛性凝膠 多孔硅膠多孔硅膠 Porasil 剛性大、剛性大、高高 流速分離流速分離 有機(jī)溶劑和水有機(jī)溶劑和水 七、親合色譜七、親合色譜 主要用于生物大分子與固定相之間的特異親合力進(jìn)行主要用于生物大

26、分子與固定相之間的特異親合力進(jìn)行 選擇性分離及純化的方法。選擇性分離及純化的方法。 分離原理：分離原理：于載體表面先鍵合具有一般反應(yīng)性能的環(huán)氧或于載體表面先鍵合具有一般反應(yīng)性能的環(huán)氧或 聯(lián)氨（稱(chēng)為間隔臂），然后再連接上配基，如酶、抗原或聯(lián)氨（稱(chēng)為間隔臂），然后再連接上配基，如酶、抗原或 激素。激素。 當(dāng)含有復(fù)雜混合試樣的流動(dòng)相流經(jīng)這種經(jīng)固定化的配當(dāng)含有復(fù)雜混合試樣的流動(dòng)相流經(jīng)這種經(jīng)固定化的配 基時(shí)，其中具有親合力特性的生物大分子與配基相互作用基時(shí)，其中具有親合力特性的生物大分子與配基相互作用 而被保留，無(wú)此作用的則被洗出；隨后，改變流動(dòng)相而被保留，無(wú)此作用的則被洗出；隨后，改變流動(dòng)相pH或或

27、組成，再將被保留的大分子組分以純品的形式洗脫出來(lái)。組成，再將被保留的大分子組分以純品的形式洗脫出來(lái)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：選擇性過(guò)濾、純化效果好。選擇性過(guò)濾、純化效果好。 1.1.液液- -液分配、液分配、化學(xué)鍵合化學(xué)鍵合及離子對(duì)分離色譜的固定相及離子對(duì)分離色譜的固定相 微孔型微孔型 大孔型大孔型 薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型 離子交換層離子交換層 惰性核惰性核惰性核惰性核 離子交換劑硅膠層涂覆離子交換劑硅膠層涂覆 2.2.液液- -固吸附分離固定相固吸附分離固定相 種類(lèi)：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；種類(lèi)：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類(lèi)型：全多孔型和薄殼型；結(jié)構(gòu)類(lèi)型：全多孔型和薄殼

28、型； 粒度：粒度：510 m； 3.3.離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相 結(jié)構(gòu)類(lèi)別：結(jié)構(gòu)類(lèi)別： （1）薄殼型離子交換樹(shù)脂）薄殼型離子交換樹(shù)脂 （2）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 樹(shù)脂類(lèi)別：樹(shù)脂類(lèi)別： （1）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 (強(qiáng)酸性、弱酸性強(qiáng)酸性、弱酸性) （2）陰離子交換樹(shù)脂）陰離子交換樹(shù)脂 (強(qiáng)堿性、弱堿性強(qiáng)堿性、弱堿性) 4. 4. 空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相 （1）軟性凝膠）軟性凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。 （2）半）半剛性剛性凝膠凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非極性有機(jī)溶

29、劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑 （3）剛性剛性凝膠凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小 ，可在較高流速下使用。 1. 1. 流動(dòng)相特性流動(dòng)相特性 （1）液相色譜的流動(dòng)相又稱(chēng)為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)）液相色譜的流動(dòng)相又稱(chēng)為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng) 相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，為正相色譜法，）流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，為正相色譜法， 極性柱也稱(chēng)正相柱。極性柱也稱(chēng)正相柱。 （3）流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，為反相色譜法，）流動(dòng)相的極性大于固定

30、液的極性，為反相色譜法， 非極性柱也稱(chēng)為反相柱。非極性柱也稱(chēng)為反相柱。 組分在兩種類(lèi)型分離柱上的出峰順序相反。組分在兩種類(lèi)型分離柱上的出峰順序相反。 2.流動(dòng)相類(lèi)別流動(dòng)相類(lèi)別 按流動(dòng)相組成分：按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；單組分和多組分； 按極性分：按極性分：極性、弱極性、非極性；極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑：常用溶劑：甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、四氯化碳、己烷等甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、四氯化碳、己烷等 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng) 相的極性或

31、增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。 3. 3. 流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇 在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組 分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留 時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧二氧 六環(huán)六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚

32、二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷 煤油煤油(最小最小) 4. 4. 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題 （1）盡量使用）盡量使用高純度試劑高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累 積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。 （2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱而使柱效下降或損壞柱 子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。 （3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度試樣

33、在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并，防止產(chǎn)生沉淀并 在柱中沉積。在柱中沉積。 （4）溶劑的黏度小些為好。溶劑的黏度小些為好。 （5）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)。當(dāng)使用紫外檢測(cè) 器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。 HPLC儀器包括：儀器包括： 高壓輸液裝置高壓輸液裝置; 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng); 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng); 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng); 此外還配有梯度淋此外還配有梯度淋 洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處 理裝置。理裝置。 其工作過(guò)程如圖所示。其工作過(guò)程如圖所示。 自學(xué)提綱 1. 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 1）貯液器：

34、）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金合金)，其孔很約，其孔很約2 m，可防，可防 止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。 2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分 子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。 3）高壓泵：）高壓泵： 對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。 輸液泵種類(lèi)：恒壓型和恒流型。輸液泵種類(lèi)：恒壓

35、型和恒流型。 恒壓泵恒壓泵(類(lèi)似于風(fēng)箱類(lèi)似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積 大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充 物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。 恒流型恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī) 械往復(fù)式兩種。械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵(見(jiàn)下圖。每分鐘往復(fù)見(jiàn)下圖。每分鐘往復(fù)25

36、100 次，因此脈動(dòng)小。對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器也會(huì)有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈次，因此脈動(dòng)小。對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器也會(huì)有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈 動(dòng)阻尼器動(dòng)阻尼器)。 馬達(dá)馬達(dá) 往復(fù)式拉動(dòng)往復(fù)式拉動(dòng) 密封密封 溶劑溶劑 球閥球閥 脈動(dòng)阻脈動(dòng)阻 尼器尼器 到色譜柱到色譜柱 機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖 4）梯度淋洗裝置：在分離過(guò)程中逐漸改變流動(dòng)相組成的裝置。）梯度淋洗裝置：在分離過(guò)程中逐漸改變流動(dòng)相組成的裝置。 如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)（將兩種或以上的溶如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)（將兩種或以上的溶 劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個(gè)或以上劑按一定比例混合

37、，再由高壓泵輸出）；如果有兩個(gè)或以上 泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。 2. 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 與與GC相比，相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生 的峰形展寬相對(duì)要小些。即，的峰形展寬相對(duì)要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因的展寬多因一些柱外因 素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的 死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。 1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體 積小。但進(jìn)樣

38、量小且重現(xiàn)性差。積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。 2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由 樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。 動(dòng) 畫(huà) 3. 色譜柱色譜柱 1）對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。）對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。 柱長(zhǎng)多為柱長(zhǎng)多為1030cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為45mm(尺寸排阻色譜柱常大于尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱，制備色譜柱 內(nèi)徑更大內(nèi)徑更大)； 2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)

39、不同可分為：）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為： 平衡密度法：平衡密度法： 非平衡密度法：非平衡密度法： 填充方法：填充方法： 填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然 后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填 充速度快充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無(wú)空氣進(jìn)入、且無(wú)空氣進(jìn)入(影響填充均勻性影響填充均勻性)。 常用分離柱常用分離柱 4. 檢測(cè)器檢測(cè)器 液相色譜檢測(cè)器包括紫

40、外吸收、熒光發(fā)液相色譜檢測(cè)器包括紫外吸收、熒光發(fā) 射、示差折光和安培檢測(cè)器等。射、示差折光和安培檢測(cè)器等。 1）紫外檢測(cè)器）紫外檢測(cè)器 其檢測(cè)原理和其檢測(cè)原理和UV-Vis方法一樣。只是方法一樣。只是 此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常 其光程為其光程為2-10mm, 體積約為體積約為110 L。 HPLC分析中，約有分析中，約有80%的物質(zhì)可以在的物質(zhì)可以在 254 nm或或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該處產(chǎn)生紫外吸收。因此該 類(lèi)檢測(cè)器應(yīng)用很廣。類(lèi)檢測(cè)器應(yīng)用很廣。 在選擇測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)注意：溶劑必須能在選擇測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)注意：溶劑必須能 讓所選擇的光透過(guò)，即所

41、選波長(zhǎng)不能小于讓所選擇的光透過(guò)，即所選波長(zhǎng)不能小于 溶劑的最低使用波長(zhǎng)。溶劑的最低使用波長(zhǎng)。 石英窗石英窗 接色譜柱接色譜柱 UV 光電倍增管光電倍增管 廢液廢液 波長(zhǎng)波長(zhǎng) 可的松可的松 氟美松氟美松 皮質(zhì)酮皮質(zhì)酮 快速掃描快速掃描光電二極管陣列（光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖光譜圖 2）熒光檢測(cè)器）熒光檢測(cè)器 許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。 熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高檢測(cè)器高 23個(gè)數(shù)量級(jí)。

42、個(gè)數(shù)量級(jí)。 3）示差折光檢測(cè)器）示差折光檢測(cè)器 原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二溶劑相，利用二 者對(duì)光的折射率不同，其中一束（通常是通過(guò)樣品者對(duì)光的折射率不同，其中一束（通常是通過(guò)樣品+溶劑相）光因溶劑相）光因 為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并 記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。 為通用型檢測(cè)器，靈敏度為為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且。但對(duì)溫度變化敏感，且 不適于梯度淋洗。不適于梯度淋洗。 4）

43、安培檢測(cè)器）安培檢測(cè)器(ampere detector) 由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池 （體積為（體積為15 L）組成。）組成。 該檢測(cè)器是利用待測(cè)物流入該檢測(cè)器是利用待測(cè)物流入 反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧 化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電 流通過(guò)，此電流大小與待測(cè)物濃流通過(guò)，此電流大小與待測(cè)物濃 度成正比。度成正比。 采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相 必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。 它最適于與反相色譜匹配。但此它最適于與反相色譜匹配。但此 檢測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性的物檢測(cè)器

44、只能檢測(cè)具有電活性的物 質(zhì)。質(zhì)。 接參比電極接參比電極 和對(duì)電極和對(duì)電極 接色譜柱接色譜柱 Teflon塑料塊塑料塊 1 cm工作電極工作電極 (Pt, Au, 碳糊碳糊) 5）電導(dǎo)檢測(cè)器）電導(dǎo)檢測(cè)器 電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。 其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的 電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。 電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影 響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)響較大，因此

45、需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng) pH7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。 其它檢測(cè)器還包括：其它檢測(cè)器還包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射光散射)、極譜等。、極譜等。 一、相對(duì)分子質(zhì)量一、相對(duì)分子質(zhì)量 對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（一般在對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（一般在200以下）、揮發(fā)性以下）、揮發(fā)性 比較好、加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)比較好、加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn) 行分析。相對(duì)分子質(zhì)量在行分析。相對(duì)分子質(zhì)量在200 2000的化合物，可用液固的化合物，可用液固 吸附、液吸附、液-液分配和

46、離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于液分配和離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于 2000，則，則 4-8 HPLC的應(yīng)用的應(yīng)用 1. 1. 環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠固定相：薄殼型硅膠(37 50 m) 流動(dòng)相：正己烷流動(dòng)相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色譜柱：色譜柱：50cm 2.5mm(內(nèi)徑內(nèi)徑) 檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器 可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng) 藥殘留量進(jìn)行分析。藥殘留量進(jìn)行分析。 2. 2. 稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相

47、固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動(dòng)相：流動(dòng)相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇線性梯度淋洗，甲醇線性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 溫：溫：50 C 柱柱 壓：壓：70 104 Pa 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 4-9 制備型液相色譜儀制備型液相色譜儀 preparative liquid chromatography 獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。 半制備柱半制備柱(內(nèi)徑內(nèi)徑8mm，長(zhǎng)度，長(zhǎng)度1530cm)，一次制備量，一次制備量.1mg。 1.1.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 對(duì)分析柱：不影響柱

48、效時(shí)的最大進(jìn)樣量；對(duì)分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量； 對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量；對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量； 超載：進(jìn)樣量超過(guò)柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。超載：進(jìn)樣量超過(guò)柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低降低 10%為宜。為宜。 2. 液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法 收集組分時(shí)，通常有以下情況：收集組分時(shí)，通常有以下情況： （1）可獲得良好分離，主峰使用制備柱，超載提高效率；）可獲得良好分離，主峰使用制備柱，超載提高效率； （2）兩主成分之間的小組分；）兩主成分之

49、間的小組分； 超載，分離切分使待分離組超載，分離切分使待分離組 分成為主成分（富集）后，再次分離制備。分成為主成分（富集）后，再次分離制備。 3. 制備型液相色譜儀制備型液相色譜儀 制備型液相色譜儀：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但制備型液相色譜儀：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)泵流量大、進(jìn) 樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制備柱：內(nèi)徑制備柱：內(nèi)徑2050mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)50cm。 一、高效毛細(xì)管電泳基本原理一、高效毛細(xì)管電泳基本原理 電泳：電泳：電解質(zhì)溶液中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以電解質(zhì)溶液中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以 不同的速度向其所帶電荷相反的電極

50、方向遷移的現(xiàn)象，稱(chēng)之不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱(chēng)之 為為電泳電泳。 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳：以：以高壓高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管毛細(xì)管為分離通為分離通 道，依據(jù)試樣中各組分之間道，依據(jù)試樣中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn) 分離分離、分析物質(zhì)的一類(lèi)液相技術(shù)，是經(jīng)典電泳和現(xiàn)代微柱分、分析物質(zhì)的一類(lèi)液相技術(shù)，是經(jīng)典電泳和現(xiàn)代微柱分 離的結(jié)合。離的結(jié)合。 4-10 高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳 2.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破 高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩

51、項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管內(nèi)徑的毛細(xì)管,； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度 效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。 電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增 加，加， 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高 達(dá)幾十萬(wàn)塊達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。 所用

52、分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于 HPLC），溫度影響大。），溫度影響大。 高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。 3.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象 電滲流電滲流：石英：石英毛細(xì)管在pH3時(shí), 內(nèi)壁帶負(fù)電荷與接觸的緩沖溶 液形成雙電層，在高電場(chǎng)的作用下，雙電層中的水合陽(yáng)離子層 引起溶液在毛細(xì)管內(nèi)整體向負(fù)極方向流動(dòng)而形成電電滲流。速 度V V電滲流 電滲流。 。 4. 分離過(guò)程分離過(guò)程 電場(chǎng)作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。電場(chǎng)作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。 帶電粒

53、子的遷移速度帶電粒子的遷移速度= =電泳和電滲流兩種速度的矢量和。電泳和電滲流兩種速度的矢量和。 正離子：正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出； 陰離子：陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，V V電滲流 電滲流 V V電泳電泳時(shí) 時(shí), ,陰離子陰離子 在負(fù)極最后流出在負(fù)極最后流出, ,在這種情況下在這種情況下, ,不但可以按類(lèi)分離不但可以按類(lèi)分離, ,除中性粒子除中性粒子 外外, ,同種類(lèi)離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)

54、被相互分離同種類(lèi)離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離 。 5.分離類(lèi)型分離類(lèi)型 (1) 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） 最普遍、最基本的一種分離模式。最普遍、最基本的一種分離模式。 (2) 毛細(xì)管毛細(xì)管凝膠凝膠電泳（電泳（CGE） 將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性， 類(lèi)似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分類(lèi)似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分 擴(kuò)散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測(cè)定蛋白質(zhì)、擴(kuò)散，所得峰型尖銳，分離效率高。可分離測(cè)定蛋白質(zhì)、DNA 等。等。 在緩沖溶液中加

55、入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、 外部帶負(fù)電的膠束。在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。外部帶負(fù)電的膠束。在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。 由于電泳流和電滲流的方向相反，且由于電泳流和電滲流的方向相反，且V V電滲流 電滲流V V電泳電泳 ，則帶負(fù)電 ，則帶負(fù)電 的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動(dòng)，中性試樣分子在膠束的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動(dòng)，中性試樣分子在膠束 相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合 的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)。的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)。用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛

56、細(xì)用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì) 管電泳的應(yīng)用范圍。管電泳的應(yīng)用范圍。 (3) 毛細(xì)管毛細(xì)管膠束膠束電動(dòng)色譜（電動(dòng)色譜（MECC） (4) 毛細(xì)管等電聚焦（毛細(xì)管等電聚焦（CIEF） (5) 毛細(xì)管等速電泳（毛細(xì)管等速電泳（CITP） (6) 毛細(xì)管電滲色譜（毛細(xì)管電滲色譜（CEC） 二、主要特點(diǎn)和應(yīng)用二、主要特點(diǎn)和應(yīng)用 高分辨率：高分辨率：理論理論n n高達(dá)數(shù)百萬(wàn)塊，甚至數(shù)千萬(wàn)塊；高達(dá)數(shù)百萬(wàn)塊，甚至數(shù)千萬(wàn)塊； 高靈敏度：高靈敏度：可檢測(cè)出低至可檢測(cè)出低至1010-21 -21 mol/L mol/L濃度的物質(zhì)；濃度的物質(zhì)； 高分析速度：高分析速度：可在可在3 3分鐘內(nèi)分離分鐘內(nèi)分離3030

57、種陰離子；種陰離子；1.71.7分鐘分離分鐘分離1919 種陽(yáng)離子；種陽(yáng)離子；4 4分鐘可分離分鐘可分離1010種蛋白質(zhì)；種蛋白質(zhì)； 試樣用量少試樣用量少：僅需幾：僅需幾nLnL（1010-9 -9 L L）的試樣； ）的試樣； 操作成本低：操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。 不足之處：不足之處： 進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。 分析陰離子時(shí)，由陰極進(jìn)樣，在陽(yáng)極檢測(cè)。但電滲流方向與分析陰離子時(shí)，由陰極進(jìn)樣，在陽(yáng)極檢測(cè)。但電滲流方向與 陰離子受電場(chǎng)力作用移動(dòng)方向相反，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。陰離子受電場(chǎng)力作用移動(dòng)方向相反，出峰時(shí)間較長(zhǎng)

58、。 三、儀器設(shè)置三、儀器設(shè)置 一、紙層析和薄層層析分離過(guò)程一、紙層析和薄層層析分離過(guò)程 紙層析和薄層層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方紙層析和薄層層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方 法不同的是在分離過(guò)程中一般不使用動(dòng)力源。法不同的是在分離過(guò)程中一般不使用動(dòng)力源。將試樣點(diǎn)在色將試樣點(diǎn)在色 譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流?dòng)相的溶劑譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流?dòng)相的溶劑 （常稱(chēng)之為展開(kāi)劑）中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過(guò)試樣點(diǎn)（常稱(chēng)之為展開(kāi)劑）中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過(guò)試樣點(diǎn) 時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。 紙層析和薄層層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用紙層析和薄層

59、層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用 二、操作技術(shù)二、操作技術(shù) 1. 層析紙和層析板層析紙和層析板 特制的色層濾紙。按需要剪裁成長(zhǎng)條形（或筒型）。層析板是特制的色層濾紙。按需要剪裁成長(zhǎng)條形（或筒型）。層析板是 用專(zhuān)門(mén)的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，用專(zhuān)門(mén)的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200250目）均目）均 勻地涂在長(zhǎng)條形玻璃板上（厚度勻地涂在長(zhǎng)條形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用）。干燥后即可使用 。 2. 展開(kāi)劑展開(kāi)劑 由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸 時(shí)，常用的展開(kāi)劑組成和配比為：正丁醇：乙

60、酸：水時(shí)，常用的展開(kāi)劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。 3. 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試 樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm5mm。 4.顯色、檢測(cè)顯色、檢測(cè) 有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將 組份斑點(diǎn)描繪出來(lái)。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或組份斑點(diǎn)描繪出來(lái)。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或 氨水熏等。氨水熏等。 三、特點(diǎn)及應(yīng)用三、特點(diǎn)及應(yīng)用 1 1、平板色譜、平板色譜簡(jiǎn)單、方便簡(jiǎn)單、方便、及操作、