細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度的調(diào)控(修改版、劉漫)

1、 細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度調(diào)控 應(yīng)化應(yīng)化10031003班班 劉漫劉漫 莊原李開成莊原李開成 楊杰楊杰 細(xì)胞內(nèi)銅離子作用 對生命而言, 銅是一種必須的微量元素, 它以輔基的形式參與 細(xì)胞內(nèi)多種重要的代謝途徑。 1）賴氨酸氧化酶參與結(jié)締組織的形成和膠原交聯(lián) 2）超氧化物歧化酶清除胞內(nèi)自由基 3）細(xì)胞色素氧化酶是呼吸鏈電子傳送蛋白 4）酪氨酸酶參與色素形成途徑 5）多巴胺羥化酶則與神經(jīng)傳導(dǎo) 細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度過低會影響這些酶的活性及相應(yīng)的生理代謝 途徑, 影響細(xì)胞的生存。 但細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度超過生理需求也會引起嚴(yán)重的問題。 人體銅離子代謝示意圖 細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度控制 雖然細(xì)胞內(nèi)總的銅離子濃度很高，通常在10

2、-5一10-4mol/L范 圍內(nèi)，但是游離銅離子濃度通常小于10-18mol/L，即一個細(xì)胞 內(nèi)只含一個游離銅離子。生理性銅離子濃度的維持主要在于 四個環(huán)節(jié): 銅離子進(jìn)入胞內(nèi)(uptake) 胞內(nèi)運送(translocation) 合成金屬蛋白(synthesis) 清除過多銅離子(elimination)。 對于過高或過低的銅離子濃度, 細(xì)胞主要是通過改變流入量 (influx)和流出量(efflux)來應(yīng)答。另外, 金屬硫蛋白可與過多銅 離子結(jié)合,避免其破壞作用, 這種保護(hù)方式叫隔離 (sequestration)。 細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度的傳遞過程 銅離子的攝取(uptake) 細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運

3、蛋白只對Cu+具有識別特異性，所以 Cu2+不能被直接跨膜轉(zhuǎn)運，必須在質(zhì)膜上 FRE1/2(Fe3+/Cu2+還原酶：Ferric ion Reductase Enzyme) 還原成Cu+后進(jìn)入細(xì)胞。 CuCu2+ 2+ CuCu+ + FeFe3+ 3+/Cu /Cu2+ 2+還原酶 還原酶 銅離子的攝取(uptake) 1 1）高親和力轉(zhuǎn)運體）高親和力轉(zhuǎn)運體 系系(High(High一一affinity affinity systems)systems) Cu+被跨膜 蛋白一一CTR(copper transporter protein)轉(zhuǎn)運， 該蛋白由ctr基因編碼， 具有銅離子高親和性

4、和 特異性，轉(zhuǎn)運過程消耗 能量。Cu+經(jīng)ctr的轉(zhuǎn)運 依賴Cu+一2K+對向運輸 機(jī)制，即每轉(zhuǎn)運一個 Cu+，需要運出兩個K+。 CTR1/3 Cu+ 2K+ Cu+ 2K+ CTR基因 1、ctr1(Copper transporter1) ctr1基因首先在酵母轉(zhuǎn)運鐵離子體系缺陷型菌株中 被發(fā)現(xiàn)。ctr1基因的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)Cu+有效濃度的影響， 高濃度Cu+抑制ctr1基因的表達(dá)，低濃度促進(jìn)ctr1的表 達(dá)。ctr1是一個三次跨膜的蛋白質(zhì)，含有406個氨基酸， N端的128個氨基酸富含甲硫氨酸、絲氨酸、組氨酸殘 基，可以結(jié)合多個銅離子，還含有3個19個氨基酸長度 的重復(fù)序列和n個M一X一X

5、一M(X指任意氨基酸)基序 (motif)的重復(fù)序列，但其具體作用不詳，可能與轉(zhuǎn)運 有關(guān)。N端位于細(xì)胞膜外，可能用于清除未被攝取的 Cu+。CTR1以多聚復(fù)合物(multimericcoplexes)的形式 發(fā)揮功能。 CTR基因 ctr1基因 高濃度Cu+ 低濃度Cu+ ctr1蛋白質(zhì) ctr1基因ctr1蛋白質(zhì) 抑制 促進(jìn) 表達(dá) 表達(dá) 結(jié)合多個銅離子 結(jié)合多個銅離子Cu+濃度 Cu+濃度 CTR基因 2、ctr3(Copper transporter3) ctr3是一個三次跨膜的 蛋白質(zhì)，含有241個氨 基酸，與ctr1的序列有 較高的相似性。ctr3分 布在細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜 上，與ctr

6、1是兩個獨立 的銅離子轉(zhuǎn)運體系，但 在某些特殊的情況下如 細(xì)胞內(nèi)Cu+濃度極低時， 它們可以協(xié)同作用共同 轉(zhuǎn)運以提高細(xì)胞內(nèi)可利 用的Cu+濃度。 3、其他基因 ctr1、ctr3都是在酵母菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的， 后來在植物和動物的CDNA文庫內(nèi)也 發(fā)現(xiàn)具有類似序列的Cu+轉(zhuǎn)運蛋白， 如擬南芥的COPT1（Copper transporte1)和人類Hela細(xì)胞的 hctr1(Human conpper transporter1)。 其中COPT1與CTR1蛋白的核昔酸序 列相似性是49%。COPT1含169個氨 基酸，hctr1含190個氨基酸，都具有 類似ctr1的三個跨膜區(qū)，N端富含甲 硫氨酸和絲氨

7、酸。大鼠和小鼠體內(nèi)也 有類似的蛋白質(zhì)序列，它們可能是負(fù) 責(zé)Cu+轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)家族。 2、低親和力的銅離子轉(zhuǎn)運體系 酵母cDNA文庫中的ctr2(Copper transporter2)蛋白與擬南 芥的COPT1具有 相似的序列，可能是低親和力的銅離子轉(zhuǎn)運體 系的成員。ctr2含有三個跨膜區(qū)，與ctr1/ctr3不同的是其N端組 氨酸、甲硫氨酸的含量低，因此不能結(jié)合大量的Cu+。在代謝過程 中，ctr2對Cu+轉(zhuǎn)運貢獻(xiàn)不大，但它的存在卻有利于Cu在細(xì)胞內(nèi)的 積累或區(qū)室化，同時可以使細(xì)胞對Cu的超載(overload)和毒性更 敏感，ctr2基因突變的菌株對毒性有高抗性。 銅離子的攝取(uptak

8、e) 胞內(nèi)運送(translocation) Cu+進(jìn)入細(xì)胞以后，迅速與細(xì)胞內(nèi)的銅離子結(jié)合蛋白如 ATX1(anti-oxidant1)、COX17(Cytochrome oxidase17copper chaperone)等蛋白質(zhì)相結(jié)合，傳遞到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的靶蛋白如 SOD、 CCC2(Copper chaperone for ceruloplasmin-like oxidase2)。象ATX1、COX17等細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)叫分 子伴侶(Chaperones)，參與細(xì)胞內(nèi)的Cu+轉(zhuǎn)運?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞內(nèi)由分子伴侶介導(dǎo)的Cu+轉(zhuǎn)運方式主要有三種: 1)ATX1、HAH1與CCC2 2)COX17

9、、hCOX17與SCO1 3)LYS7、CCS與SOD 1)ATX1、HAH1與CCC2 ATX1存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，含73個氨基酸，一個MTCXXC的基序可以結(jié)合 Cu+。在結(jié)合Cu+前后，ATX1表面的半膚氨酸含量變化很大，蛋白質(zhì)構(gòu)象的 變化可能更加有利于Cu+的結(jié)合和釋放。ATX1將Cu+傳遞給CCC2，進(jìn)而傳遞 給鐵離子攝入系統(tǒng)(Ironuptakesystems)如FET3/FET5(Fe transporter3/5)，參 與鐵離子的轉(zhuǎn)運，并影響胚胎神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)銅離子鰲合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及數(shù) 據(jù)分析系統(tǒng)的分化和發(fā)育。 CCC2是P型ATPase家族成員(P-type ATPase)，

10、定位于高爾基體上，N端有 MTCXXC基序，兩個半膚氨酸非常保守，可能與Cu+的結(jié)合有關(guān)。人類 Menkes(MNK)和Wiison(wD)疾病蛋白與CCC2同源，N端有該基序的六個拷貝， MNK參與人類肝細(xì)胞中Cu+的傳遞，WD負(fù)責(zé)其它組織如腸粘膜的Cu+輸出。 ATX1傳遞Cu+的可能機(jī)理:ATX1的兩個半膚氨酸疏基結(jié)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域化的 Cu+，然后與脫輔基的CCC2(apo一CCC2)作用，ATP水解供能，形成一系列 含有ATXI一Cu一CCCZ的中間物，最后形成脫輔基的ATX1(apo-ATx1)和攜帶 Cu+的CCC2。隨后ATP水解，CCC2一Cu+構(gòu)象改變，Cu+被釋放入囊泡，插

11、 入靶蛋白FET3/FET5內(nèi)。ATX1的65位賴氨酸是其活性位點，在Cu+捕獲和釋 放中起重要作用。在該反應(yīng)中，ATX1可能作為一種酶，降低Cu+在蛋白質(zhì)之 間轉(zhuǎn)運的動力能障，使反應(yīng)更易進(jìn)行。 FET3/FET5是一次跨細(xì)胞器膜的轉(zhuǎn)鐵蛋白，屬于多銅氧化酶家族 (multicopper oxidases)成員，與Cu+具有高親和性，氧化區(qū)位于細(xì)胞器膜外。 底物是O2和Fe2+，4個Fe2+被氧化成4個Fe3+，4個電子傳給O2，形成H2O。 人類與ATX1同源的蛋白質(zhì)是HAH1(Human anti一oxidant 1 homologue1)， 二者氨基酸序列的相似性為47%。HAH1是穩(wěn)定的

12、單鏈蛋白質(zhì)，含有68個氨基 酸，形成2個螺旋和2個折疊，一個MXCXXC的金屬離子結(jié)合序列。HAH1存 在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，分布和穩(wěn)定性不受細(xì)胞內(nèi)的Cu+濃度的影響。兩個 HAH1單體與銅離子形成的HAH1同源二聚體發(fā)揮其功能。HAH1利用ATP水解 提供的能量，與其它蛋白質(zhì)相互作用將Cu+傳遞給類似CCCZ的P型ATPase家 族成員，如位于高爾基體成熟面的WD和MNK蛋白。雖然HAH1與ATX1本身無 抗氧化特性，但它們可以將Cu+傳給具有抗氧化作用的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)其抗氧化 作用。 1)ATX1、HAH1與CCC2 ATX1 Cu-ATX1 構(gòu)象變化 Cu-CCC2 鐵離子攝入系統(tǒng) （FE

13、T3/FET5） 鐵的運輸 響胚胎神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) 銅離子鰲合蛋白質(zhì) COX17是一個細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)，分子量8KD，含有69個 氨基酸，7個半胱氨酸，其中6個在進(jìn)化中十分保守，3個功能 必需殘基包含在CCXC基序中。C端有線粒體的靶序列，使COX17 暫時停泊在線粒體上，便于Cu+進(jìn)入線粒體的膜間隙，進(jìn)而經(jīng) SCO1(synthesis of cytochrome c oxidase1)傳給細(xì)胞色素c氧化酶 。另外，細(xì)胞外高濃度的Cu+也可以通過被動擴(kuò)散進(jìn)入線粒體 ，以彌補COX17基因突變造成的線粒體內(nèi)Cu+濃度的降低。 COX17不穩(wěn)定，易被降解。 2)COX17、hCOX17與SCO1

14、 SCO1是線粒體膜上的蛋白質(zhì) ，CXXXC序列與Cu+結(jié)合，并 將其傳給細(xì)胞色素c氧化酶。 細(xì)胞色素c氧化酶是位于呼吸 鏈末端的復(fù)合物，由核基因 和線粒體基因共同編碼，2個 血紅素A和3個銅離子可以傳 遞電子。scol基因的突變導(dǎo)致 細(xì)胞色素c氧化酶失活，高濃 度的Cu+不能使之恢復(fù)活性， 這說明細(xì)胞色素c氧化酶不能 直接絡(luò)合細(xì)胞內(nèi)游離的Cu+， 只能依靠分子伴侶遞呈Cu+。 所以SCO1是一個激活細(xì)胞色 素c氧化酶的必需分子。 2)COX17、hCOX17與SCO1 COX17 Cu+ Cu-SCO1 細(xì)胞色素 c氧化酶 激活 LYS7(Lysine biosynthesis7)存在于酵母

15、細(xì)胞內(nèi)，含249個氨基酸， 有MTCXXC的Cu+結(jié)合區(qū)，它可將Cu+傳給SOD。Cu，Zn-SOD單 體含151個氨基酸，兩個單體組成的同源二聚體作為細(xì)胞內(nèi)的 功能形式可以絡(luò)合兩個銅離子，兩個鋅離子。它能有效地清除 活性氧，保護(hù)線粒體DNA免受氧化傷害，是體內(nèi)主要的抗氧化 酶類，SOD基因的缺失可以導(dǎo)致成人神經(jīng)退行性疾病一一 ALS(Amyotrophic lateral sclerosis) 3)LYS7、CCS與SOD LYS7 Cu+ LYS7 Cu+ 2（Cu， Zn-SOD） 清除活性氧，保護(hù) 線粒體DNA免受氧化 人類與LYS7同源的分子伴侶是CCS(copper chapero

16、ne for SOD)，它以同 源二聚體形式特異地將Cu+傳遞給SOD。CCS的單體共有三個結(jié)構(gòu)域 (domains):N端結(jié)構(gòu)域(Domain ），含有一個MTCXXC的金屬結(jié)合基 序，與AIX1有較高的同源性;中間結(jié)構(gòu)域(Domain )，與它的目標(biāo)酶 SOD的序列相似性為50%，但是CCS缺少催化活性部位;C端結(jié)構(gòu)域 (Domainm)，大約30個氨基酸，是CCS的特異部位和功能必需基團(tuán) ，含有一個高度保守的CXC序列，Domainm在不同物種之間同源性很 高。Domainl和Domainlll可以結(jié)合金屬離子，Domalnl負(fù)責(zé)識別和捕獲 Cu+;Domainn與SOD結(jié)合成異源二聚體以固定SOD，利于離子的轉(zhuǎn)運 。Domainm負(fù)責(zé)將Cu+插入脫輔基SOD(apo一SOD)的金屬離子結(jié)合位 點，并將其激活。CCS與SOD單體形成的異源二聚體(CCS一SOD)較CCS 、SOD的同源二聚體(CCS-CCS，SOD-SOD)構(gòu)象發(fā)生了很大變化，可能 更便于Cu+的轉(zhuǎn)運，但是具體作用機(jī)制仍不清楚。有趣的是，CCS結(jié) 合Cu+，而SOD結(jié)合Cu2+了，在轉(zhuǎn)運過程中，Cu+是如何實現(xiàn)變價有待 進(jìn)一步研究。 3)LYS7、CCS與SOD 銅離子濃度的其他調(diào)控